СПОСОБ МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ ГЕСТОЗА Российский патент 2010 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к патоморфологии, и может быть использовано для морфологической диагностики степени тяжести гестоза.

Актуальность предлагаемого способа определяется тенденцией к увеличению числа женщин с гестозом. Последний является одной из основных причин перинатальной заболеваемости и материнской смертности, что доказывает актуальность гестоза в современном акушерстве и перинатологии (Сидорова И.С., Зайратьянц О.В., Никитина Н.А. Гестоз и материнская смертность. // Акушерство и гинекология. - 2008. - №2. - С.13-15). Частота гестоза по данным разных авторов составляет от 7 до 19% (Савельева Г.М. Проблема гестоза в современном акушерстве: тез. 36-го ежегод. конгр. междунар. общества по патофизиологии беременности организации гестоза. - М., 2004. - С.194-195; Токова З.З., Фролова О.Г. Гестоз и материнская летальность. // Российский вестник акушера-гинеколога. - 2005. - №3. - С.52-55). При этом клинический диагноз данной патологии не всегда совпадает с морфологическим.

Проведенный анализ патентной и специальной литературы выявил отсутствие морфологических критериев оценки степени тяжести гестоза. В связи с этим разработка способа, позволяющего оценить степень тяжести гестоза, имеет большое значение для патологоанатомической службы.

Известен способ оценки степени тяжести гестоза по показателям центральной гемодинамики с помощью эхокардиографии или тетраполярной реографии, который позволяет диагностировать степень тяжести гестоза при стертых клинических симптомах (Тактика родоразрешения женщин с ОПГ-гестозами: показания, прогноз, исходы. // В.И.Краснопольский, М.В.Федорова, С.В.Новикова и др. // Вестник Российской ассоциации акушеров-гинекологов. - 1997. - №1. - С.95-100). При показателях минутного объема кровообращения (МОК) от 4,6 л/мин до 4,3 л/мин, величине общего периферического сопротивления (ОПС) 1543-1794 дин. с см^-5 диагностируют гестоз легкой степени тяжести, при показателях МОК 4,36-3,62 л/мин, ОПС 2038,8-2448 дин. с см^-5 диагностируют гестоз средней степени тяжести, при МОК менее 3,6 л/мин, ОПС выше 2500 дин. с см^-5 диагностируют гестоз тяжелой степени.

Недостатком указанного способа является то, что в 40% случаев при гестозе легкой степени тяжести, в 30% случаев при гестозе средней степени тяжести и в 25% случаев при тяжелом течении гестоза МОК и ОПС могут находиться в пределах нормы, в силу чего способ не является достаточно точным.

Известен способ диагностики степени тяжести гестоза на основании исследования клинических признаков и кровотока во внутрипочечных артериях. У пациенток с нечетко выраженными клиническими симптомами проводят ультразвуковое исследование с цветовым доплеровским картированием. Определяют максимальную систолическую, минимальную диастолическую скорости кровотока и индекс резистентности (RI) во внутрипочечных артериях (сегментарных и междолевых). При показателях RI 0,62-0,65% диагностируют гестоз легкой степени тяжести, при RI 0,66-0,69% - гестоз средней тяжести и при RI 0,70% и более диагностируют гестоз тяжелой степени (Пат. 2262305 Российская Федерация. Способ диагностики степени тяжести гестоза. / Краснопольский В.И., Мазурская Н.М., Логутова Л.С., Петрухин В.А. // Изобретения. Полезные модели. - 2005. - №29).

Предлагаемый способ имеет недостатки: труден в техническом исполнении, для выполнения метода необходимо иметь дорогостоящее оборудование, точность способа не известна.

Наиболее близким по техническому решению является способ диагностики течения гестоза, включающий исследование периферической крови и осуществление нитросиний тетразолиевого (НСТ)-теста с определением числа НСТ-положительных форм и индекса активации нейтрофилов. При появлении более 12% НСТ-положительных клеток с темноокрашенными зернами формазана и индексе активации нейтрофилов свыше 0,28 у.е. диагностируют возникновение гестоза, причем при получении 12,1-17% НСТ-положительных клеток и индекса активации 0,28-0,43 у.е. в 1-3 триместрах беременности диагностируют легкое течение гестоза, при появлении 27-43% НСТ-положительных клеток с индексом активации 0,67-1,0 у.е. диагностируют тяжелое течение гестоза, во 2-3 триместрах беременности при 18-26% НСТ-положительных клеток с индексом активации 0,44-0,66 у.е. диагностируют гестоз средней тяжести. Точность способа по данным литературы не известна. Указанный способ выбран нами в качестве ближайшего аналога (прототипа). (Пат.2143694 Российская Федерация. Способ диагностики течения гестоза. / Баранова И.Н., Тягунова А.В., Васильева З.В. // Изобретения. - 1999. - №36. - С.230-231).

Недостатки способа

1. Невозможно использовать для морфологической диагностики (способ предназначен для клинической диагностики).

2. Инвазивность метода.

3. Точность способа не известна.

Указанные недостатки предлагается устранить в заявляемом способе.

Заявляемый технический результат достигается тем, что при морфологическом иммуногистохимическом исследовании базальной децидуальной оболочки и ворсинчатого хориона плаценты определяют индекс экспрессии маркеров апоптоза р53 и bcl-2. При индексе экспрессии р53, равном или более 2,4 у.е., и bcl-2, равном или более 2,2 у.е., диагностируют гестоз тяжелой степени. При индексе экспрессии р53, равном 2,0-2,39 у.е., и bcl-2, равном 1,8-2,19 у.е., диагностируют гестоз легкой степени тяжести.

Техническим решением является разработка способа морфологической диагностики легкой и тяжелой степеней гестоза с высокой точностью - 93,3%.

Новизна изобретения заключается в том, что маркеры апоптоза р53 и bcl-2 используют впервые для диагностики степени тяжести гестоза. Известно, что сбалансированное функционирование иммунных механизмов обеспечивает физиологическое течение беременности. Нарушение тех или иных звеньев этой сложной цепочки ведет к возникновению патологических процессов в системе мать-плацента-плод, в том числе к развитию гестоза (Соколов Д.И. Иммунологические механизмы контроля апоптоза при развитии плаценты. // Медицинская иммунология. - 2008. - Т. 10, №2-3. - С.125-138). Одним из важнейших иммунных механизмов регуляции гестационного процесса, начиная с имплантации эмбриона и заканчивая рождением здорового ребенка, является апоптоз. Апоптоз - это генетически запрограммированный процесс самоуничтожения клетки (Ярилин А.А. Основы иммунологии. - М.: Медицина, 1999. - 608 с.). В процессе гестации с помощью апоптоза регулируются децидуализация маточного эндометрия, адекватное ремоделирование тканей материнской децидуальной оболочки, инвазия трофобласта и нидация развивающегося эмбриона. Кроме перечисленного обеспечивается иммунная толерантность к беременности и подготовка к родам (Роль апоптоза в развитии плаценты. // И.О.Буштырева, З.И.Микашинович, А.В.Шестопалов, О.В.Борисенко. // Журнал российского общества акушеров-гинекологов. - 2007. - №2. - С.4-7; Atyapathu H., Jayawardana М.А., Senanayaka L. A study of the incidence of apoptosis in the human placental cells in the last weeks of pregnancy. // J. Obstet. Gynaecol. - 2003. - Vol.23, №5. - P.515-517; Huppertz В., Kingdom J.C. Apoptosis in the trophoblast - role of apoptosis in placental morphogenesis. //J Soc. Gynecol. Investig. - 2004. - Vol.11, №6. - P.353-362; Joswig A., Gabriel H.-D., Kibschull M., Winterhager E. Apoptosis in uterine epithelium and deciduas in response to implantation: evidence for two different pathways. // Reprod. Biol. Endocrinol. - 2003. - Vol.1. - P. 44-52). Нарушение апоптоза на системном и локальном уровнях встречается при развитии различных осложнений беременности, в том числе и гестоза. Ранее исследование маркеров апоптоза р53 и bcl-2 в плаценте с целью диагностики степени тяжести гестоза не проводилось. Данный способ позволяет провести морфологическую дифференциальную диагностику легкой и тяжелой степеней гестоза. В особо сложных клинически не диагностируемых случаях гестоза морфологическое исследование последа, в том числе р53 и bcl-2, позволяет установить диагноз и уточнить стадию гестоза.

Отличительные признаки способа:

при морфологическом иммуногистохимическом исследовании базальной децидуальной оболочки и ворсинчатого хориона плаценты определяют индекс экспрессии маркеров апоптоза р53 и bcl-2. При значении р53, равном или более 2,4 у.е., и bcl-2, равном или более 2,2 у.е., диагностируют гестоз тяжелой степени, а при значении р53, равном 2,0-2,39 у.е., и bcl-2, равном 1,8-2,19 у.е., диагностируют гестоз легкой степени тяжести.

Способ осуществляется следующим образом.

Послед непосредственно после родов помещают в емкость с физиологическим раствором, в котором он находится не более 30-60 минут. Материал (базальную децидуальную оболочку и ворсинчатый хорион) для иммуногистохимического исследования забирают из центрального отдела плацент в виде кусочков 10×10×3 мм и фиксируют в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 12-24 часов (Петров С.В., Райхлин Н.Т. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. - Казань: Титул, 2004. - 456 с.). Иммуногистохимическую реакцию осуществляют на парафиновых срезах после депарафинации препаратов, предварительной демаскировки антигена путем двукратного кипячения в цитратном буфере по 5 минут в СВЧ-печи при мощности 650 Вт. Эндогенную пероксидазу блокируют 1% раствором перекиси водорода с последовательной инкубацией во влажной камере с первичными антителами и биотинилированными вторичными антителами. В промежутках между инкубацией срезы промывают в трех сменах фосфатного буфера. В качестве первичных антител используют мышиные моноклональные антитела класса IgG_2b к р53 в рабочем разведении 1:50 и мышиные моноклональные антитела класса IgG₁ к bcl-2 в разведении 1:100 («Dako», Германия). Визуализацию комплексов антиген-антитело осуществляют стрептавидин-биотиновым пероксидазным методом при помощи системы детекции LSAB2 System, HRP («Dako», Германия). Далее срезы окрашивают DAB-хромогеном, ополаскивают в воде, докрашивают гематоксилином Мейера и заключают в глицерин-желатин. Для проведения негативного контроля первичные антитела замещают 1% раствором бычьего сывороточного альбумина, а также исключают вторичные антитела. Результаты иммуногистохимической реакции оценивают в 10 полях зрения микроскопа, по 100 клеток в каждом, при увеличении ×400. В готовых срезах высчитывают процент антиген-положительных клеток и оценивают интенсивность иммуногистохимической реакции по трехбалльной системе: слабая (1 балл) - продукт реакции светло-коричневого цвета, умеренная (2 балла) - коричневого цвета, выраженная (3 балла) - темно-коричневого цвета. Отсутствие экспрессии в клетках оценивают в 0 баллов. Индекс экспрессии изучаемых маркеров высчитывают по формуле

Индекс экспрессии=ΣP(i)·i/100 у.е.,

где i - интенсивность окрашивания в баллах (от 0 до 3);

P(i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью.

Результат рассчитывают в условных единицах (у.е.).

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами.

Пример 1. Беременная Д., 43 лет, поступила в стационар в 29 недель. Настоящая беременность пятая. В анамнезе 1 своевременные роды, 1 медицинский аборт и 2 самопроизвольных выкидыша. За время наблюдения в женской консультации артериальное давление 150/80-160/90 мм рт.ст. В общих анализах мочи отклонений от нормы не выявлено. Осмотрена терапевтом, дано заключение: гипертоническая болезнь II стадии, пролапс митрального клапана I степени Н0. При поступлении жалобы на отеки голеней, одутловатость лица, повышение артериального давления. Госпитализирована в палату интенсивной терапии. Объективно: состояние средней тяжести, АД 180/110-190/110 мм рт.ст., отеки голеней, одутловатость лица, в анализе мочи протеинурия 3,3 г/л. По данным УЗИ: плацентарная недостаточность, внутриутробная задержка развития плода. Поставлен диагноз: беременность 29 недель. Сочетанный гестоз (тяжелая форма) на фоне гипертонической болезни II ст. Пролапс митрального клапана I степени, Н0. Фетоплацентарная недостаточность. Хроническая внутриутробная гипоксия плода. Синдром задержки развития плода. Отягощенный акушерско-гинекологический анамнез. Проводилась интенсивная терапия гестоза. Артериальное давление оставалось в пределах 170/110-180/110 мм рт.ст., в суточном анализе мочи протеинурия 3,3 г/л. По данным доплеровского исследования нарушения гемодинамики III степени, по данным КТГ признаки внутриутробного страдания плода. Учитывая отсутствие эффекта от терапии тяжелого гестоза и выраженное страдание плода беременная родоразрешена путем операции кесарево сечения, извлечен ребенок массой 960 г, с оценкой по шкале Апгар 3 балла, переведен в отделение детской реанимации.

В плаценте при гистологическом исследовании выявлен вирусно-бактериальный базальный и париетальный децидуит, нарушения маточно-плацентарного кровотока в виде ишемических инфарктов и проявления плацентарной гипертензии. При иммуногистохимическом исследовании плаценты индекс экспрессии р53 равен 2,5 у.е., bcl-2 - 2,7 у.е. Диагностирован гестоз тяжелой степени, т.е. клинический диагноз подтвержден морфологически.

Пример 2. Беременная Ч., 28 лет, срок беременности при поступлении в стационар 35-36 недель. В анамнезе 1 своевременные роды и 1 медицинский аборт в 7 недель. За время наблюдения в женской консультации артериальное давление 100/60-110/70 мм рт.ст. В общих анализах мочи отклонений от нормы не выявлено. Осмотрена терапевтом, дано заключение: мочекаменная болезнь, ожирение II степени. Настоящая беременность осложнилась угрозой прерывания во втором триместре беременности. Поступила в стационар с жалобами на повышение артериального давления, отеки голеней, передней брюшной стенки. Госпитализирована в палату интенсивной терапии. Объективно: состояние средней тяжести, АД 160/110 мм рт.ст., отеки голеней и передней брюшной стенки, в анализах мочи протеинурия 16,5 г/л. По данным УЗИ: плацентарная недостаточность, внутриутробная задержка развития плода. Поставлен диагноз: беременность 35 недель. Сочетанный гестоз (тяжелая форма) на фоне ожирения II степени, мочекаменной болезни. Фетоплацентарная недостаточность. Хроническая внутриутробная гипоксия плода. Синдром задержки развития плода. Проводилась интенсивная терапия гестоза. В утреннем анализе мочи протеинурия 16,5 г/л, артериальное давление 160/110 мм рт.ст., водный баланс 1200/800. По данным доплеровского исследования нарушения гемодинамики II степени, по данным КТГ - признаки внутриутробного страдания плода. Учитывая отсутствие эффекта от терапии тяжелого гестоза и выраженное страдание плода беременная родоразрешена путем операции кесарево сечения, извлечен ребенок массой 2100 г и ростом 46 см, с оценкой по шкале Апгар 7-8 баллов.

В плаценте при патоморфологическом исследовании выявлены вирусный базальный и париетальный децидуит, признаки незавершенной гестационной перестройки спиральных артерий, микроотслойка плаценты на фоне расслаивающих кровоизлияний в базальную пластинку и проявления плацентарной гипертензии. При иммуногистохимическом исследовании индекс экспрессии р53 равен 2,4 у.е., bcl-2 - 2,2 у.е. Диагностирован гестоз тяжелой степени, т.е. клинический диагноз подтвержден морфологически.

Пример 3. Беременная Р., 22 лет, поступила в стационар в 40 недель беременности с жалобами на отеки голеней с 31 недели. За время наблюдения в женской консультации артериальное давление 100/60-110/70 мм рт.ст. В общих анализах мочи без патологии. Объективно: состояние удовлетворительное, АД 130/90 мм рт.ст., в анализах мочи протеинурия 0,099 г/л. По данным УЗИ: плод соответствует сроку доношенной беременности. Поставлен диагноз: беременность 40 недель. Гестоз (легкой степени). Проводилась терапия гестоза, терапия, улучшающая маточно-плацентарный кровоток, подготовка организма к родам. Беременность завершилась своевременными родами в 41 неделю. Ребенок массой 3400 г и ростом 51 см, с оценкой по шкале Апгар 8-9 баллов.

Гистологически в плаценте выявлены нарушения маточно-плацентарного кровотока в виде мелкоочаговых псевдоинфарктов и субхориального стаза-тромбоза межворсинчатого пространства краевых отделов. При иммуногистохимическом исследовании индекс экспрессии р53 равен 2,0 у.е., bcl-2 - 2,18 у.е. Диагностирован гестоз легкой степени тяжести, т.е. клинический диагноз подтвержден морфологически.

Пример 4. Беременная Ш., 33 лет, поступила в стационар в 40 недель беременности с жалобами на отеки голеней. В анамнезе 1 своевременные роды и 3 медицинских аборта. За время наблюдения артериальное давление 100/60-110/70 мм рт.ст. В анализах мочи отклонений от нормы не выявлено. Осмотрена терапевтом: здорова. Объективно: состояние удовлетворительное, АД 110/60 мм рт.ст., в анализах мочи протеинурия 0,033 г/л. По данным УЗИ: плод соответствует сроку доношенной беременности. Поставлен диагноз: беременность 40 недель. Гестоз (легкой степени). Отягощенный акушерско-гинекологический анамнез. Беременность завершилась своевременными родами в 40 недель. Ребенок массой 3250 г, ростом 53 см, с оценкой по Апгар 8-9 баллов.

В плаценте гистологически выявлено формирование афункциональных зон с отложением петрификатов (признаки старения плаценты). Индекс экспрессии р53 равен 1,8 у.е., bcl-2 - 1,6 у.е. Клинический диагноз гестоза не подтвержден.

Пример 5. Беременная М., 21 год, срок беременности при поступлении в стационар 39 недель. На учете в женской консультации с 11 недель беременности. Общая прибавка массы тела с 11 по 39 неделю беременности 10 кг. За время наблюдения артериальное давление 120/70-120/80 мм рт.ст. В анализах мочи отклонений от нормы не выявлено. Осмотрена терапевтом: здорова. Настоящая беременность протекала без осложнений. При поступлении объективно: состояние удовлетворительное, АД 120/70 мм рт.ст. В анализах мочи без патологии. По данным УЗИ: плод соответствует сроку доношенной беременности. Поставлен диагноз: беременность 39 недель, смешанное ягодичное предлежание плода. Беременность завершилась своевременными оперативными родами в 40 недель. Ребенок массой 3600 г, ростом 54 см, с оценкой по шкале Апгар 8-9 баллов.

В плаценте гистологически выявлен базальный и париетальный децидуит. При иммуногистохимическом исследовании индекс экспрессии р53 равен 2,39 у.е., bcl-2=1,8 у.е., т.е. морфологически диагностирован гестоз легкой степени.

Пример 6. Беременная Е., 35 лет. За время наблюдения в женской консультации артериальное давление 120/70-140/90 мм рт.ст. В общих анализах мочи отклонений от нормы не выявлено. Осмотрена терапевтом, дано заключение: гипертоническая болезнь 1-11 ст. Артериальная гипертензия I ст. Дисциркуляторная энцефалопатия. Поступила в стационар в сроке 30 недель беременности с жалобами на головную боль, повышение артериального давления, отеки голеней и передней брюшной стенки. Госпитализирована в палату интенсивной терапии. Объективно:

состояние средней тяжести, АД 140/100 мм рт.ст., отеки голеней и передней брюшной стенки, в анализах мочи протеинурия 0,066 г/л. Поставлен диагноз: беременность 30 недель, головное предлежание плода. Сочетанный гестоз (преэклампсия) на фоне гипертонической болезни I-II ст. Артериальная гипертензия I ст. Дисциркуляторная энцефалопатия. Проводилась интенсивная терапия гестоза, экстрагенитальной патологии. На фоне терапии в течение четырех часов отмечено улучшение состояния: исчезновение головной боли, снижение артериального давления до 130/70-120/60 мм рт.ст., утренний анализ мочи без патологии, водный баланс 1800/2100. Учитывая положительный эффект от терапии беременная через сутки переведена в отделение патологии беременных. Беременность закончилась своевременными родами в 39 недель. Ребенок массой 4450 г и ростом 56 см, с оценкой по шкале Апгар 8-9 баллов.

В плаценте гистологически выявлены нарушения маточно-плацентарного кровотока в виде геморрагических инфарктов, склероза, гелиноза, очагового фибриноидного некроза стенок артериол и артерий со стенозом просвета сосудов стволовых ворсин, то есть изменение со стороны сосудистого русла свидетельствует об артериальной гипертензии, сочетающейся с гестозом. При иммуногистохимическом исследовании плаценты индекс экспрессии р53 равен 2,2 у.е., bcl-2=1,9 у.е., т.е. морфологически диагностирована артериальная гипертензия I ст. на фоне гестоза легкой степени.

Преимущества способа.

1. Заявляемый способ прост в исполнении.

2. Является неинвазивным.

3. Способ высокочувствителен, обладает высокой точностью.

4. Не требуется дорогостоящего оборудования.

5. Исследование может быть проведено в любом патологоанатомическом отделении (лаборатории).

6. Способ является высокоинформативным.

7. Позволяет выполнить морфологическую дифференциальную диагностику степени тяжести гестоза в тканях плаценты, в том числе и при клинически не диагностируемых и трудно диагностируемых случаях гестоза и его степеней тяжести.

Указанным способом исследовано 45 плацент от женщин с гестозом различной степени тяжести.

Результаты исследования представлены в таблице 1.

Таблица 1 Всего исследований 45 Истинно положительный результат 28 Ложно положительный результат 2 Истинно отрицательный результат 14 Ложно отрицательный результат 1 Точность 93,3% Чувствительность 96,5% Специфичность 87,5%

Изобретение относится к медицине, а именно к патоморфологии, и может быть использовано для морфологической диагностики степени тяжести гестоза. Для осуществления изобретения при морфологическом иммуногистохимическом исследовании базальной децидуальной оболочки и ворсинчатого хориона плаценты определяют индекс экспрессии маркеров апоптоза р53 и bcl-2. При индексе экспрессии р53, равном или более 2,4 у.е., и bcl-2, равном или более 2,2 у.е., диагностируют гестоз тяжелой степени. При индексе экспрессии р53, равном 2,0-2,39 у.е., и bcl-2, равном 1,8-2,19 у.е., диагностируют гестоз легкой степени тяжести. Использование изобретения позволяет на современном уровне выполнить объективное патоморфологическое исследование плаценты и провести диагностику не выявленного в клинике гестоза и дифференциальную диагностику степеней его тяжести с высокой точностью. 1 табл.

Способ диагностики степени тяжести гестоза путем исследования биологического материала, отличающийся тем, что при морфологическом иммуногистохимическом исследовании базальной децидуальной оболочки и ворсинчатого хориона плаценты определяют индекс экспрессии маркеров апоптоза р53 и bcl-2 и при значении р53 равном или более 2,4 у.е., и bcl-2, равном или более 2,2 у.е., диагностируют гестоз тяжелой степени, а при значении р53, равном 2,0-2,39 у.е., и bcl-2, равном 1,8-2,19 у.е., диагностируют гестоз легкой степени тяжести.