СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ У ЖИВОТНЫХ ПРИ СТРЕССОВОМ ВОЗДЕЙСТВИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2011 года по МПК A61K31/718 A61K31/7016 A61K33/18 

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и может быть использовано для предупреждения развития инфекционных осложнений у экспериментальных животных, возникающих при стрессовом воздействии в эксперименте вследствие процесса транслокации условно-патогенных микроорганизмов из кишечника в удаленные органы.

В экспериментальных исследованиях нередко приходится прибегать к моделированию стресса у животных. Известно, что стрессовое воздействие вызывает нарушение барьерной функции стенки кишечника и миграцию из его просвета условно-патогенной микрофлоры и ее токсинов в системный кровоток, что провоцирует у животных развитие инфекционно-воспалительного процесса в удаленных органах (Л.А.Пирузян, Е.М.Михайловский. Взаимодействие иммунной системы организма с условно-патогенной сапрофитной микрофлорой и возможное сопряжение этого процесса с метаболическим статусом человека // Прикладная биохимия и микробиология. - 2004. - Т.40. - №5. - С.602-606; В.М.Бондаренко. Роль условно-патогенных бактерий кишечника в полиорганной патологии человека. - Москва-Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2007. - 64 с). Безусловно, бактериемия, обусловленная стрессом, а также развитие у животного микробно-воспалительного процесса во внутренних органах искажают результаты проводимого эксперимента.

В доступной научной и патентной литературе способов профилактики инфекционных осложнений при стрессовом воздействии в эксперименте на лабораторных животных не обнаружено.

Изобретение направлено на решение задачи: разработка способа профилактики инфекционных осложнений у экспериментальных животных, возникающих вследствие процесса транслокации условно-патогенной микрофлоры из просвета кишечника в системный кровоток при стрессовом воздействии в эксперименте.

Технический результат: предупреждение процесса транслокации кишечной микрофлоры в системный кровоток и развития инфекционных осложнений при использовании в эксперименте острого стресса, снижение летальности экспериментальных животных.

Указанная задача достигается путем профилактического применения в течение 10 дней, предшествующих стрессовому воздействию, биологически активной добавки «Ультрасорб», представляющей собой комплекс БАД «Рекицен-РД» с олигофруктозой, из расчета 3 г/сут, добавляя его к корму. БАД «Ультрасорб» выпускается ЗАО «Ягодное», г.Киров, д.Югрино (Россия). «Ультрасорб» используется в качестве профилактического средства практически здоровыми людьми, при воздействии неблагоприятных экологических и производственных факторов, при повышенном риске формирования дисбактериоза, онкологических заболеваний, сахарного диабета, иммунной недостаточности. Также «Ультрасорб» применяется отдельно или как дополнение к терапии при заболеваниях желудочно-кишечного тракта (стоматиты, дисбактериоз, острые кишечные инфекции, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, гастриты, холециститы, гепатиты, энтериты, колиты), при нарушениях обмена веществ (атеросклероз, ожирение, сахарный диабет, гипергликемия), при алкогольной интоксикации и алкогольной патологии, при воспалительной патологии кожи микробного и аллергического происхождения, в комплексной терапии вторичной иммунной недостаточности.

Основным компонентом «Ультрасорба» являются ферментированные нерастворимые и растворимые пищевые волокна и короткоцепочечные жирные кислоты, наличие которых способствует нормализации кишечной микрофлоры и укреплению гематоинтестинального барьера, что, в свою очередь, предупреждает транслокацию условно-патогенной микрофлоры кишечника в системный кровоток.

Способ осуществляют следующим образом. БАД «Ультрасорб» после механического измельчения в ступке добавляют в корм экспериментальных животных (нелинейных белых крыс) в количестве 10% суточного объема пищи (3 г/сут). Курс профилактического применения «Ультрасорба» составляет 10 дней.

Процесс транслокации кишечной микрофлоры в лимфу и системный кровоток регистрируют на основании результатов бактериологического исследования аутопсийного материала (брыжеечные лимфоузлы, селезенка, печень, почки, легкие). Нарушение целостности гематоинтестинального барьера оценивают по результатам гистологического и, в том числе, иммуногистохимического исследования (определение экспрессии в стенке толстой кишки животных регуляторного пептида Ki-67 как маркера клеточной пролиферации и маркера апоптоза Fas ligand).

Эксперимент выполнен на 30 животных - самцах и самках беспородных белых крыс четырехмесячного возраста, содержащихся в стандартных условиях вивария. Все эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г., №755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г.

Животные были разделены на 3 экспериментальные группы, состав групп был следующий:

I группа - контрольная (интактные животные), получавшие типовой рацион вивария, n=10;

II группа - животные, получавшие в течение эксперимента типовой рацион вивария, ректальное введение культуры лактозонегативной Escherichia coli в концентрации 10⁹ КОЕ/мл, последующий острый стресс, n=10;

III группа - животные, получавшие в течение эксперимента в качестве компонента функционального питания БАД «Ультрасорб» (комплекс «Рекицена-РД» с олигофруктозой, ЗАО «Ягодное», г. Киров), введение Escherichia coli в концентрации 10⁹ КОЕ/мл, последующий острый стресс, n=10.

Ректальное введение в микроклизме суточной бульонной культуры лактозонегативной Escherichia coli, обладающей известными культуральными и биохимическими свойствами, осуществляли с целью воспроизведения процесса транслокации кишечной микрофлоры в лимфу и системный кровоток. Культуру Escherichia coli вводили животным в концентрации 10⁹ КОЕ/мл, стандартизованной нефелометрическим методом (КФК-3, кювета 1,060 мм, длина волны - 540 нм, оптическая плотность бактериальной суспензии в мясопептонном бульоне 0,026). Транслокацию условно-патогенной микрофлоры во внутреннюю среду организма провоцировали последующим однократным стрессовым воздействием в форме острого холодового стресса (t=+4°C, экспозиция - 2 часа).

На 10-й день от начала эксперимента животных выводили из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. При проведении аутопсии внутренние органы (брыжеечные лимфоузлы, печень, селезенка, почки, легкие) в асептических условиях забирали для проведения бактериологического исследования. Выделенные чистые культуры бактерий идентифицировали по традиционным схемам с изучением культуральных, морфологических, тинкториальных и биохимических свойств.

Кусочки органов (толстая, тонкая кишка, селезенка, печень, почки, легкие) фиксировали в 10% забуференном по Лилли формалине (рН - 7,2), обезвоживали в спиртах восходящей крепости, заливали в парафин, срезы (3-4 мкм) получали на ротационом микротоме, наносили на стекла с адгезивным покрытием (Tissue bond). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

Для выявления в исследуемых образцах регуляторного пептида Ki-67 и маркера апоптоза Fas ligand использовали антитела (Polyclonal Rabbit Antibody to Fas Ligand; Rabbit Monoclonal Antibody to Human Ki-67, Clone SP6, Isotype IgG) и полный диагностический набор компании Diagnostic BioSystems (USA), предназначенный для проведения экспериментальных исследований. Иммуногистохимические исследования проводили в соответствии со стандартным протоколом. При проведении иммуногистохимических исследований использовали позитивные контроли. В качестве позитивного контроля экспрессии Ki-67 в исследуемых образцах использовали экспрессию соответствующих антигенов в реактивных центрах фолликулов небной миндалины человека. В качестве позитивного контроля экспрессии Fas Ligand использовали ткань простаты. Срезы докрашивали гематоксилином Майера, заключали в канадский бальзам и изучали в проходящем свете микроскопа при увеличении ×400.

Оценка интенсивности пероксидазной метки и определение индекса пролиферации Ki-67 проводились полуколичественным методом - учитывалось число позитивных на 100 учтенных ядер (при учете 500-1000 клеток) (Н.А.Корсакова. Оценка степени злокачественности эпителиальных новообразований толстой кишки на основе определения иммунофенотипа опухолевых клеток / Автореф. дисс. к.м.н. - Москва, 2007. - 23 с.). При определении экспрессии Ki-67 ядерная реакция любой интенсивности фиксировалась как позитивная (Г.А.Раскин. Онкоген HER2 в раке молочной железы: механизм влияния на поведение опухоли (сравнительное количественное иммуногистохимическое исследование / Автореф. дисс. к.м.н. - Казань, 2007. - 24 с.). Уровень пролиферации расценивался как низкий, если <15% клеток имели позитивную реакцию, умеренный, если 15-30% ядер были позитивны на Ki-67, и высокий при позитивной реакции более 30% клеток (Раскин, 2007).

Результаты. Бактериологическое исследование аутопсийного материала показало, что посевы из материала, полученного от интактных животных, были стерильны. При проведении гистологического исследования признаков воспаления в исследуемом материале выявлено не было, все органы имели нормальное гистологическое строение. При проведении иммуногистохимических исследований у животных группы контроля выявлена умеренно выраженная пролиферация эпителиоцитов толстой кишки, расположенных в донных отделах крипт (индекс пролиферации - 33±5,48%), что отражает физиологический процесс обновления эпителиальной выстилки кишечника (Корсакова, 2007). Также у животных данной группы обнаруживалась слабо выраженная экспрессия маркера апоптоза Fas ligand в цитоплазме эпителиоцитов толстой кишки.

При заражении экспериментальных животных культурой Escherichia coli и последующем остром холодовом стрессе культура Escherichia coli по свойствам, идентичная штамму, используемому для заражения, была выделена из внутренних органов экспериментальных животных в 100% случаев в концентрации, превышающей 10⁴ КОЕ/г. При проведении гистологического исследования воспалительная инфильтрация, представленная нейтрофильными лейкоцитами, клетками лимфоидного ряда и макрофагами, была выявлена в стенке кишечника, почках, печени животных, в селезенке отмечались реактивные изменения и воспалительная инфильтрация. При проведении иммуногистохимического исследования в препаратах толстой кишки крыс отмечались статистически значимое уменьшение пролиферирующих клеток в донных отделах крипт (11,4±2,31%; р<0.05) и выраженная экспрессия маркера клеточного апоптоза Fas ligand в цитоплазме эпителиоцитов.

У животных, подвергшихся заражению и стрессу и получавших в дополнение к типовому рациону вивария БАД «Ультрасорб», положительные результаты бактериологического исследования аутопсийного материала были получены в 60% случаев. При этом концентрация выделенной Е. coli не превышала 10² КОЕ/г. При проведении гистологического исследования аутопсийного материала воспалительные изменения в исследуемых органах в форме умеренно выраженной лимфолейкоцитарной инфильтрации отмечались менее чем у 50% животных. При проведении иммуногистохимических исследований в данной экспериментальной группе отмечался низкий уровень экспрессии апоптотического белка Fas ligand в цитоплазме эпителиоцитов толстой кишки. Также у всех животных, получающих в качестве компонента функционального питания БАД «Ультрасорб», отмечалась экспрессия фактора пролиферации Ki-67 в донных отделах крипт толстой кишки, соответствующая результатам контрольной группы (35,8±6,02%).

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Наркотизированному эфиром самцу белой крысы, массой 210 г, находящемуся в течение эксперимента на стандартном рационе вивария, введено ректально однократно 500 мкл микробной суспензии суточной бульонной культуры лактозонегативной Escherichia coli в концентрации 10⁹ КОЕ/ мл, предварительно определенной нефелометрическим методом на фотоэлектрофотометре КФК-3, (оптическая плотность бактериальной суспензии в мясопептонном бульоне 0,026, длина волны 540 нм, кювета - 1,060 мм). На следующий день после заражения животное было подвергнуто однократному стрессовому воздействию - охлаждение до t=+4°С в течение двух часов. На 10 сутки животное было умерщвлено под эфирным наркозом путем перерезки спинного мозга, проведено бактериологическое и гистологическое исследование внутренних органов.

При проведении бактериологического исследования аутопсийного материала культура Escherichia coli, по свойствам идентичная использованному для заражения штамму, в концентрации 10³-10⁴ КОЕ/г была выделена из лимфатических узлов брыжейки, ткани почек, селезенки, печени и легких крысы. При проведении патоморфологического исследования толстой и тонкой кишки, легких, печени, селезенки, почек выявлена инфильтрация лимфоцитами, нейтрофилами и макрофагами с преобладанием лимфоцитов.

При оценке экспрессии регуляторного пептида Ki-67 в препаратах толстой кишки выявлено значительное уменьшение пролиферирующих клеток в донных отделах крипт (9,8%) и выраженная экспрессия маркера клеточного апоптоза Fas ligand в цитоплазме эпителиоцитов.

Таким образом, у экспериментального животного, находящегося на стандартном рационе вивария, ректальное заражение Escherichia coli и последующий острый стресс вызывают повреждение кишечной стенки, что выражается в активации процессов апоптоза и угнетении физиологической клеточной регенерации, и активацию процессов бактериальной транслокации, подтверждаемую бактериологическим и гистологическим методами.

Пример 2. Самке белой крысы, массой 160 г, в течение 10 дней в смеси с кормом давали БАД «Ультрасорб» в количестве 3 г/сут. На 11-й день эксперимента под эфирным наркозом животному ректально введено 500 мкл микробной суспензии суточной бульонной культуры лактозонегативной Escherichia coli в концентрации 10 КОЕ/ мл. На следующий день после заражения животное было подвергнуто однократному стрессовому воздействию - охлаждение до t=+4°С в течение двух часов. На 10-е сутки от заражения животное было выведено из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии.

При проведении бактериологического исследования аутопсийного материала высева из исследуемых органов не получено. При проведении гистологического исследования не выявлено воспалительных инфильтратов в исследуемом материале (толстая, тонкая кишка, печень, почки, селезенка, легкие).

При оценке экспрессии Fas ligand и Ki-67 выявлена умеренно выраженная пролиферация эпителиоцитов толстой кишки, расположенных в донных отделах крипт (39,2%), соответствующая уровню физиологической регенерации, и слабо выраженная экспрессия маркера апоптоза Fas ligand в цитоплазме эпителиоцитов толстой кишки.

Таким образом, у данного животного включение в рацион в качестве компонента функционального питания БАД «Ультрасорб» способствовало нормализации процессов апоптоза и пролиферации в эпителии кишечника и, как следствие, укреплению кишечной стенки и предупреждению бактериальной транслокации.

Пример 3. Самцу белой крысы, массой 210 г, в течение 10 дней в смеси с кормом давали БАД «Ультрасорб» в количестве 3 г/сут. На 11-й день эксперимента под эфирным наркозом животному ректально введено 500 мкл микробной суспензии суточной бульонной культуры лактозонегативной Escherichia coli в концентрации 10⁹ КОЕ/ мл. На следующий день после заражения животное было подвергнуто однократному стрессовому воздействию - охлаждение до t=+4°С в течение двух часов. На 10-е сутки от заражения животное было выведено из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии.

При проведении бактериологического исследования аутопсийного материала высева из исследуемых органов не получено. При проведении гистологического исследования не выявлено воспалительных инфильтратов в исследуемом материале (толстая, тонкая кишка, печень, почки, селезенка, легкие).

При оценке экспрессии Fas ligand и Ki-67 выявлена умеренно выраженная пролиферация эпителиоцитов толстой кишки, расположенных в донных отделах крипт (36,4%), соответствующая уровню физиологической регенерации, и слабо выраженная экспрессия маркера апоптоза Fas ligand в цитоплазме эпителиоцитов толстой кишки.

Таким образом, у данного животного включение в рацион в качестве компонента функционального питания БАД «Ультрасорб» способствовало нормализации процессов апоптоза и пролиферации в эпителии кишечника и, как следствие, укреплению кишечной стенки и предупреждению бактериальной транслокации.

Положительный эффект от использования предлагаемого способа состоит в предупреждении процесса транслокации условно-патогенной микрофлоры кишечника в системный кровоток у экспериментального животного при остром стрессе с развитием инфекционных осложнений и, тем самым, в достижении исключения влияния этого нежелательного эффекта на результаты эксперимента.

Изобретение относится к области экспериментальной медицины. Экспериментальным животным в течение 10 дней до начала эксперимента в рацион включают биологически активную добавку «Ультрасорб» из расчета 3 г/сут. Способ предупреждает процесс транслокации кишечной микрофлоры в системный кровоток и развитие инфекционных осложнений при использовании в эксперименте острого стресса, снижает летальность экспериментальных животных.

Способ профилактики инфекционных осложнений у животных при стрессовом воздействии в эксперименте, заключающийся в том, что экспериментальным животным, подвергаемым в ходе эксперимента острому стрессу, в течение 10 дней до начала эксперимента в рацион в качестве компонента рациона питания включают биологически активную добавку «Ультрасорб» из расчета 3 г/сут.