ПЕПТИД, ЯВЛЯЮЩИЙСЯ АНАЛОГОМ ФРАГМЕНТА АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА, КОНЪЮГАТ ПЕПТИДА С ДОКСОРУБИЦИНОМ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2008 года по МПК A61K38/08 C07K7/06 A61P35/00 

Изобретение относится к области медицины, фармацевтики и биохимии, а именно к лекарственным препаратам, содержащим пептиды, и может быть использовано в медицине для лечения онкологических заболеваний различной этиологии.

В настоящее время злокачественным новообразованиям принадлежит второе место среди заболеваний, приводящих к летальному исходу. Недостаточная эффективность и избирательность современной противоопухолевой терапии, а также высокая токсичность применяющихся лекарственных препаратов, делают крайне актуальной проблему поиска новых более действенных и высокоспецифичных лекарственных средств. Разработка препаратов направленного действия, избирательно поражающих раковые клетки и минимально воздействующих на нормальные здоровые клетки организма, является одним из наиболее эффективных путей решения данной проблемы и активно ведется в течение, как минимум, двух последних десятилетий.

За рубежом некоторые препараты направленного действия уже проходят клинические испытания, а некоторые из них, как, например, Gemtuzumab ozogamicin или Mylotarg®, одобрен Food and Drug Administration (PDA) США как препарат для лечения рецидивов острой промиелоцитарной лейкемии.

Как правило, подавляющее большинство препаратов направленного действия сконструированы на основе моноклональных антител или их фрагментов к тем или иным опухолевым маркерам (CD33 для острых лейкозов, CD20 для не-Ходжкинской лимфомы и т.д.), к которым с помощью ковалентной химической связи присоединены противоопухолевые антибиотики или токсины (RU 2071351, А61К 38/17, 10.01.1997; RU 2157701, A61K 39/385, A61K 38/19, C12N 15/62, A61P 35/00, 20.10.2000; RU 2129018, A61K 47/48, C12P 21/08, C12N 15/62, A61K 39/00, 20.04.1999; заявки РФ №№2003123100/13, С07К 16/18, C12N 15/13, C12Q 1/68, А61К 38/02, A61P 35/00, 10.03.2005; 2004135101/15, А61К 41/00, 27.06.2005). Кроме того, испытывается также ряд препаратов, на основе сывороточного альбумина и трансферрина - белков, которые активно накапливаются многими опухолями. Указанный подход позволяет значительно снизить многочисленные побочные эффекты, сопровождающие химиотерапевтическое лечение, что значительно расширяет область применения препаратов направленного действия.

Недостатком данного подхода является отсутствие универсальности, так как для каждого типа опухолей необходим свой препарат. Кроме того, многие опухолеспецифические антигены экспрессируются далеко не во всех клетках опухолей определенного типа. Также следует отметить, что использование белковых векторов (антител, онкофетальных белков, транспортных белков) предполагает предварительное их выделение и очистку, представляющие в большинстве случаев сложный многостадийный и дорогостоящий процесс. Поэтому предпочтительным является использование в качестве векторных молекул специфических пептидных фрагментов, которые можно легко синтезировать в необходимых количествах. Этот подход в настоящее время активно разрабатывается, что нашло отражение в ряде исследований (см., например, заявки РФ №№2002130203/15, А61К 45/08,27.03.2004; 2003137593/04, А61К 7/00, 20.05.2005).

Наиболее близкими к предлагаемому изобретению являются: пептид формулы MYIEALDSYAC, являющийся аналогом рецепторсвязывающего фрагмента эпидермального фактора роста (ЭФР) с 21-й по 31-ю аминокислоту и способный выполнять функцию векторной молекулы для направленной доставки противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки; конъюгат данного пептида с доксорубицином (ДОКС), в котором ДОКС ковалентно присоединен к пептиду через азометиновую связь; фармацевтическая композиция на основе указанного конъюгата для лечения онкологических заболеваний (RU 2196604, А61К 38/08, опубл. 20.01.2003 - прототип).

Недостатком известного решения, выбранного за прототип, является недостаточная селективность противоопухолевого препарата. Эффективность действия препарата-прототипа основана на способности пептида MYIEALDSYAC связывается с рецептором ЭФР на поверхности клеток и эндоцитироваться внутрь клетки вместе с присоединенным к нему ДОКС. Однако рецепторы ЭФР имеются не только на опухолевых клетках, но и на поверхности подавляющего большинства нормальных клеток организма (клеток эпителия, эндотелия, нейронов, глии и пр.), так как ЭФР является важным ростовым фактором и митогеном для многих клеток (Carpenter G., Cohen S. Epidermal growth factor. Ann. Rev. Biochem. 1979, v.48, p.193-216). Таким образом, известный препарат будет проникать не только в опухолевые, но и в нормальные (здоровые) клетки организма и за счет цитотоксического эффекта ДОКС вызывать нарушения в функционировании органов и тканей. Недостатком прототипа является также использование при синтезе конъюгата глутарового альдегида, так как при этом кроме целевого продукта образуется большое количество полимеров, агрегатов и других неидентифицированных побочных продуктов реакции, что затрудняет очистку конъюгата и значительно снижает его выход.

Задачей предлагаемого изобретения является создание нового пептида-вектора, способного обеспечить селективную доставку противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки. Задачей изобретения является также создание конъюгата нового пептида с противоопухолевым лекарственным средством ДОКС и разработка способа получения конъюгата с высоким выходом. Задачей изобретения является также разработка новой фармацевтической композиции для лечения онкологических заболеваний на основе полученного конъюгата, что позволит расширить арсенал противоопухолевых средств направленного действия и обеспечит повышение эффективности их терапевтического применения.

Решение поставленной задачи достигается предлагаемым пептидом формулы QMTOVNOG, являющимся аналогом рецепторсвязывающего фрагмента α-фетопротеина с 472-й по 479-ю аминокислоту, способным избирательно захватываться опухолевыми клетками и выполнять функцию векторной молекулы для направленной доставки противопухолевых препаратов в опухолевые клетки

Решение поставленной задачи достигается также предлагаемым конъюгатом пептида формулы QMTOVNOG с ДОКС, в котором ДОКС ковалентно присоединен к указанному пептиду через тиоэфирную связь.

Ковалентная тиоэфирная связь в предлагаемом конъюгате может быть создана путем взаимодействия SH-группы производного заявляемого пептида, полученного реакцией пептида с N-гидроксисукцинимидным эфиром S-ацетилтиогликолевой кислоты, и двойной связи малеимидной группы гидразона ДОКС, полученного реакцией ДОКС с 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбонилгидразидом.

Решение поставленной задачи достигается также предлагаемой фармацевтической композицией для лечения онкологических заболеваний, содержащей конъюгат ДОКС с векторной молекулой в эффективном количестве и подходящий для внутривенного введения фармацевтический носитель, которая в качестве конъюгата ДОКС содержит его конъюгат с пептидом формулы QMTOVNOG.

Предлагаемый пептид является аналогом фрагмента α-фетопротеина с 472-й по 479-ю аминокислоту. Фрагмент α-фетопротеина имеет формулу EMTPVNPG (глутаминовая кислота-метионин-треонин-пролин-валин-аспарагин-пролин-глицин) и отличается низкой стабильностью. Из-за наличия в его структуре глутаминовой кислоты существенно осложняется синтез данного пептида. В предлагаемом пептиде, имеющем формулу QMTOVNOG (глутамин-метионин-треонин-оксипролин-валин-аспарагин-оксипролин-глицин), без ущерба для активного центра пептида были произведены следующие замены: пролин-4 и пролин-7 заменены на оксипролин-4 и оксипролин-7, а глутаминовая кислота-1 заменена на глутамин-1. Замена пролинов на оксипролины позволила повысить стабильность пептида, что существенно облегчило работу при его модификации и привело к повышению стабильности конъюгата. Замена глутаминовой кислоты-1 на глутамин-1 была сделана для облегчения синтеза пептида с использованием метода твердофазного пептидного синтеза.

Селективность нового пептида формулы QMTOVNOG была показана in vitro на примере его флуоресцентно меченного производного при исследовании связывания и эндоцитоза пептида опухолевыми клетками в сравнении с лимфоцитами периферической крови здорового человека (см. фиг.1 и пример 2). Было установлено, что пептид QMTOVNOG избирательно связывается с опухолевыми клетками и эндоцитирует внутрь этих клеток в отличие от лимфоцитов периферической крови.

Эффективность предлагаемого пептида QMTOVNOG в качестве векторной молекулы для направленной доставки противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки подтверждена на примере его конъюгата с ДОКС, для чего был разработан способ получения заявляемого конъюгата. Было установлено, что применение глутарового альдегида нецелесообразно из-за большого количества побочных реакций и низкого выхода целевого продукта. Модификация известных методик для создания тиоэфирной связи позволила получать заявляемый конъюгат с высоким выходом.

ДОКС является лекарственным средством для внутривенного способа введения, поэтому предложена также фармацевтическая композиция, содержащая заявляемый конъюгат в эффективном количестве (0,05-0,1%), и приемлемый для внутривенного введения носитель: физиологический раствор, фосфатно-солевой буфер, раствор обезболивающих или других препаратов, применяемых в онкологической практике. Количество дополнительных препаратов в предлагаемой фармацевтической композиции не должно превышать 50 вес.% от общего веса композиции.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение пептида QMTOVNOG.

Пептид был получен методом твердофазного пептидного синтеза по стандартной методике с использованием Fmoc-защищенных аминокислот. На каждом шаге пептидной конденсации карбоксильную группу аминокислот активировали превращением в гидроксибензотриазоловый эфир с помощью N-гидроксибензотриазола и N,N-ди-изопропилкарбодиимида. В конце каждого цикла синтеза защиту снимали с помощью пиперидина. Полученный пептид был очищен методом обращеннофазовой ВЭЖХ на колонке Luna 5u С 18 в градиенте 20% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте - вода и охарактеризован методом масс-спектрометрии (молекулярный ион - 875). После очистки пептид QMTOVNOG лиофилизировали и хранили при -20°С.

Пример 2. Связывание и эндоцитоз пептида QMTOVNOG опухолевыми клетками и лимфоцитами периферической крови человека.

А. Синтез флуоресцентно меченного производного пептида QMTOVNOG.

К раствору пептида QMTOVNOG (900 мкг в 100 мкл бикарбонатного буферного раствора, рН 9,5) добавляли при перемешивании 600 мкг флуоресцеинизотиоционата (ФИТЦ) в 50 мкл этого же буферного раствора (1,7-кратный избыток ФИТЦ). Через 3 часа реакционную смесь разделяли на колонке Delta-Pack 300 C₁₈, 5 мкм (3,9×150 мм) в градиенте от 0 до 100% фазы В за 30 мин (фаза А - 10% ацетонитрила в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), рН 7,4; фаза В - 60% ацетонитрила, 40% ФБС, рН 7,4). Детекцию проводили по поглощению в области 495 нм. Собирали фракцию со временем выхода 12,6 мин, замораживали и хранили при -70°С.

Б. Исследование связывания и эндоцитоза пептида QMTOVNOG.

1) Культивирование клеток.

Клетки аденокарциномы молочной железы человека линии MCF-7 культивировали в пластиковых культуральных флаконах (Coming-Costar) в среде DMEM (ICN), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco) и 50 мкг/мл гентамицина (ICN) в CO₂-инкубаторе при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO₂. Клетки карциномы яичника человека линии SKOV3 культивировали в аналогичных условиях, но с использованием среды RPMI 1640 (ICN). Лимфоциты периферической крови здоровых добровольцев выделяли с помощью центрифугирования крови через градиент раствора фиколл-пак по методу Boyum (Boyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Scand. J. Lab. Clin. Invest., 1968, 21, Suppl. 97, p.9-18). 10 мл цельной гепаринизированной крови разбавляли ФСБ в 2 раза. В две пластиковые стерильные центрифужные пробирки (Coming-Costar) объемом 15 мл вносили по 5 мл раствора фиколл-пак (Pharmacia), сверху аккуратно наслаивали по 10 мл разбавленной крови и центрифугировали 30 мин при 400 g (центрифуга Beckman). Верхний слой аккуратно удаляли и отбирали клетки из интерфазы. Отобранные клетки трижды отмывали 15 мл ФСБ, каждый раз отделяя осадок центрифугированием (400 g, 15 мин), после чего ресуспендировали осадок в ФСБ или среде RPMI 1640.

2) Анализ связывания и эндоцитоза.

До начала эксперимента клетки инкубировали 2 часа в среде без сыворотки. Далее клетки снимали с пластика с помощью раствора трипсин/этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) (0,05% трипсина, 0,02% ЭДТА), отмывали ФСБ, подсчитывали клетки и ресуспендировали в ФСБ в концентрации 10⁶ клеток/мл.

Для анализа связывания клетками пептида QMTOVNOG раствор ФИТЦ-меченого производного пептида (QMTOVNOG-ФИТЦ) в диапазоне концентраций 62-2000 нМ добавляли к суспензии клеток на холоду и инкубировали при 4°С в течение 1 часа.

При исследовании эндоцитоза инкубацию проводили при 37°С.

После окончания инкубации клетки трижды отмывали ледяным ФСБ и измеряли интенсивность флуоресценции на проточном цитофлуориметре EPICS-C (Coulter Electronics). Флуоресценцию клеток возбуждали аргоновым лазером (λ возбуждения = 488 нм, λ эмиссии = 520 нм). Для флуоресцентной детекции использовали трехразрядное логарифмическое усиление. Средние значения интенсивности флуоресценции рассчитывали по программе STAT PACK для 10⁴ клеток в каждом образце. Перерасчет данных, полученных в режиме трехразрядного логарифмического усиления, проводили по формуле:

условные единицы флуоресценции = 10^{[(номерканалов/333})^-1].

На фиг.1 приведены полученные данные проточной цитофлуориметрии по связыванию (+4°С) и эндоцитозу (+37°С) QMTOVNOG-ФИТЦ опухолевыми клетками человека (карцинома яичника SKOV3 и аденокарцинома молочной железы MCF-7) в сравнении с лимфоцитами периферической крови здорового человека. Установлено, что пептид QMTOVNOG селективно накапливается в клетках опухолевых линий человека в отличие от лимфоцитов крови: связывание пептида с лимфоцитами крови при +4°С почти не превышало фоновый уровень, а эндоцитоз практически отсутствовал. Таким образом, показано, что новый транспортный пептид QMTOVNOG можно использовать в качестве селективной векторной молекулы для направленной доставки противоопухолевых препаратов в раковые клетки.

Пример 3. Синтез конъюгата пептида QMTOVNOG с доксорубицином (QMTOVNOG-ДОКС).

Схема синтеза конъюгата представлена на фиг.2.

А. Активация пептида с помощью SATA.

К раствору пептида QMTOVNOG (I) (1,2 мг в 200 мкл ФСБ, рН 7,0) добавляли при перемешивании 0,29 мкг N-гидроксисукцинимидного эфира S-ацетилтиогликолевой кислоты (SATA, Fluka) в 10 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) (30%-ный мольный избыток). Реакцию контролировали с помощью ВЭЖХ (градиент от 0 до 60% фазы В за 15 мин; фаза А - ФСБ, рН 7,0; фаза В - ацетонитрил). Через 1 час реакционную смесь разделяли на колонке Symmetry 300 С 18, 5 мкм (4,6×250 мм) (Waters) в указанных выше условиях с детекцией при 214 нм и 280 нм. Полученное активированное производное пептида (II) в объеме 800 мкл аликвотировали по 200 мкл и хранили при -20°С.

Б. Получение гидразона ДОКС (III).

К раствору 2,58 мг ДОКС гидрохлорида в 400 мкл диметилформамида добавляли при перемешивании 1,7 мг 4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбонилгидразида (Pierce) и инкубировали в темноте в течение 24 часов. Гидразон ДОКС (III) выделяли с помощью ВЭЖХ в вышеуказанных условиях при детектировании при 495 нм. Концентрацию III определяли спектрофотометрически, используя коэффициент молярной экстинкции ДОКС при 495 нм (ε₄₉₅=10650 л·моль^-1·см^-1). Раствор гидразона ДОКС аликвотировали по 125 нмолей и хранили при -20°С.

В. Создание тиоэфирной связи между пептидом QMTOVNOG и ДОКС - синтез конъюгата QMTOVNOG-ДОКС (IV).

К 200 мкл собранной фракции активированного пептида (II) добавляли 40 мкл 0,5 М NH₂OH-HCl, 0,025 М ЭДТА и 0,1 М Na₂HPO₄ (pH 7,5), через 5 мин добавляли 200 мкл раствора, содержащего 125 нмоль гидразона ДОКС (III). Реакцию контролировали с помощью ВЭЖХ, конъюгат (IV) образовался менее чем за 15 мин.

Реакционную смесь разделяли с помощью ВЭЖХ в указанных выше условиях, концентрацию ДОКС в конъюгате IV определяли спектрофотометрически по поглощению при 495 нм. Молярное соотношение пептид : ДОКС в конъюгате составляет 1:1. Профиль элюции конъюгата представлен на фиг.3. Концентрация конъюгата по ДОКС составила 93 мкМ. Выход по ДОКС - 74,4%. Конъюгат (IV) аликвотировали и хранили до использования при -20°С.

Пример 4. Накопление конъюгата QMTOVNOG-ДОКС и свободного ДОКС в опухолевых клетках в сравнении с лимфоцитами периферической крови здоровых доноров.

А. Культивирование клеток.

Клетки аденокарциномы молочной железы человека линии MCF-7 и карциномы яичника человека линии SKOV3 культивировали, как описано в примере 2. Клетки устойчивой к ДОКС аденокарциномы молочной железы человека линии MCF-7^AdrR и гепатоцеллулярной карциномы человека линии HepG2 культивировали в пластиковых культуральных флаконах (Coming-Costar) в среде DMEM (ICN), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco) и 50 мкг/мл гентамицина (ICN) в CO₂-инкубаторе при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO₂. Клетки устойчивой к ДОКС карциномы яичника человека линии SKVLB, В-клеточной лимфомы человека линии Namalva и Т-клеточной лимфомы человека линии Jurkat культивировали в аналогичных условиях, но с использованием среды RPMI 1640 (ICN). Лимфоциты периферической крови здоровых добровольцев выделяли, как описано в примере 2.

Б. Исследование накопления конъюгата QMTOVNOG-ДОКС и свободного ДОКС в опухолевых и здоровых клетках методом проточной цитофлуориметрии.

Клетки указанных выше линий высевали в пластиковые чашки Петри (Coming-Costar) диаметром 6 см. Через 2 суток клетки промывали дважды средой, не содержащей сыворотки, и инкубировали 2 часа в среде без сыворотки (5 мл/чашку). Монослойные культуры (MCF-7, MCF-7^AdrR HepG2, SKOV3 и SKVLB) снимали с пластика с помощью раствора трипсин/ЭДТА (0,05% трипсина, 0,02% ЭДТА, Sigma), отмывали ФСБ, подсчитывали клетки в камере Горяева и ресуспендировали в ФСБ в концентрации 10⁶ клеток/мл. Суспензионные культуры (Namalva, Jurkat) и лимфоциты крови центрифугировали (1500 оборотов/мин, 5 мин, центрифуга Beckman). Супернатант удаляли, осадок промывали ФСБ и далее обрабатывали клетки так же, как и монослойные культуры.

Раствор конъюгата QMTOVNOG-ДОКС разводили ФСБ до концентраций 0,5 мкМ, 1 мкМ и 2 мкМ. 100 мкл каждого разведения добавляли к 100 мкл суспензии клеток в микропробирках. Конечная концентрация конъюгата QMTOVNOG-ДОКС составляла 0,25 мкМ, 0,5 мкМ и 1 мкМ. Аналогичным образом обрабатывали клетки свободным ДОКС. Далее клетки инкубировали при 37°С на шейкере при помешивании в течение 15 мин и 1 часа. После окончания инкубации клетки дважды отмывали холодным (+4°С) ФСБ, ресуспендировали в 200 мкл ФСБ и измеряли интенсивность флуоресценции на проточном цитофлуориметре EPICS-C (Coulter Electronics). Флуоресценцию клеток возбуждали аргоновым лазером (λ возбуждения = 488 нм, λ эмиссии - 620-700 нм). Для флуоресцентной детекции использовали трехразрядное логарифмическое усиление. Средние значения интенсивности флуоресценции рассчитывали по программе STAT PACK для 10⁴ клеток в каждом образце. Перерасчет данных, полученных в режиме трехразрядного логарифмического усиления, проводили, как указано в примере 2.

Накопление в клетках конъюгата QMTOVNOG-ДОКС и свободного ДОКС (DOX) носило дозозависимый характер и зависело от времени инкубации (см. фиг.4А и 4Б). Интенсивность захвата опухолевыми клетками конъюгата была значительно выше по сравнению со свободным ДОКС. Уровень накопления конъюгата QMTOVNOG-ДОКС в лимфоцитах периферической крови был значительно ниже, чем в опухолевых клетках (см. фиг.4) и был практически таким же, как и для свободного ДОКС (см. таблицу 1), что указывает на специфичность доставки ДОКС в опухолевые клетки с помощью пептида.

На основании полученных данных были рассчитаны коэффициенты эффективности накопления (КЭФ) конъюгата QMTOVNOG-ДОКС для концентрации 1 мкМ.

КЭФ = УЕФ_{конъюгатаQKTOVNOG-ДОКС}/УЕФ_ДОКС, где УЕФ - среднее значение интенсивности флуоресценции клеток, выраженное в условных единицах флуоресценции.

КЭФ для опухолевых линий клеток и лимфоцитов представлены в таблице 1.

Таблица 1.Коэффициенты эффективности накопления (КЭФ) QMTOVNOG-ДОКС (1 мкМ) для опухолевых линий клеток человека и лимфоцитов периферической крови.Линия клетокКЭФ, 15 минКЭФ, 1 часMCF-79.35.9MCF-7^AdrR9.331.8SKOV379SKVLB2.210.9Namalva9.63.9Jurkat2.352HepG25.2-Лимфоциты периферической крови1.51

В. Исследование накопления и распределения конъюгата QMTOVNOG-ДОКС в опухолевых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии.

Клетки SKOV3 высевали на покровные стекла диаметром 12 мм в 24-луночные планшеты в количестве 30 тыс./лунку в 0,5 мл культуральной среды и инкубировали 20 час. Перед экспериментом клетки инкубировали 2 часа в среде DMEM, не содержащей сыворотки. Далее среду удаляли, добавляли в каждую лунку 1 мкМ QMTOVNOG-ДОКС в 0,5 мл культуральной среды и инкубировали 1, 4 и 24 часа в стандартных условиях (в СО₂-инкубаторе при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO₂). По окончании инкубации клетки трижды отмывали ФСБ, фиксировали параформальдегидом (2% раствор параформальдегида (Sigma) в ФСБ, рН 7,2) в течение 20 мин при комнатной температуре, затем трижды отмывали ФСБ и заключали в мовиол (0,4 г мовиола (CalBiochem) смешивали с 1 мл Н₂O и 1 г глицерина, растворяли при перемешивании в течение 2 час при 25°С, после чего добавляли 0,4 мл 10-кратного ФСБ и 1,6 мл Н₂O и инкубировали ночь при 50°С. Раствор центрифугировали, супернатант отбирали, разаликвочивали по 50 мкл и хранили в низкотемпературном морозильнике при -70°С). Распределение пептида в клетках исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа Opton IM35 при увеличении 400х. Для детекции ДОКС использовали комбинацию фильтров G 510-560, FT 580, LP 520. Фотографировали клетки с помощью цифровой камеры DXM 1200 (Nikon).

Хорошо выраженная красная флуоресценция ДОКС в клетках, обработанных конъюгатом QMTOVNOG-ДОКС (см. фиг.5), свидетельствует о том, что ДОКС в составе конъюгата эффективно захватывается опухолевыми клетками. С увеличением времени инкубации интенсивность флуоресценции возрастает. Следует отметить преимущественное накопление ДОКС в ядрах клеток, характерное для ДОКС в свободном состоянии, означающее, что ДОКС в составе предлагаемого конъюгата способен проникать в ядра клеток и взаимодействовать со своей мишенью - ДНК.

Пример 5. Исследование цитотоксической активности конъюгата QMTOVNOG-ДОКС в сравнении со свободным ДОКС in vitro.

Клетки аденокарциномы молочной железы человека линии MCF-7 и карциномы яичника человека линии SKOV3 культивировали, как описано в примере 2. Лимфоциты периферической крови человека выделяли, как описано в примере 2. Предварительно лимфоциты стимулировали фитогемагглютинином (ФГА). Для этого 20×10⁶ лимфоцитов помещали в пластиковую чашку Петри (Coming-Costar) диаметром 10 см в 10 мл среды RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco), 50 мкг/мл гентамицина (ICN) и 10 мкг/мл ФГА, и оставляли в СО₂-инкубаторе при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO₂, на 48 час.

Для оценки цитотоксической активности опухолевые клетки высевали в 96-луночные планшеты (Coming-Costar) по 5-10 тысяч клеток в лунку за сутки до эксперимента в соответствующей среде для культивирования (см. пример 4). Конъюгат QMTOVNOG-ДОКС и свободный ДОКС добавляли к клеткам в диапазоне концентраций 10-1000 нМ, в трех параллелях, и инкубировали в стандартных условиях в течение 72 час. Стимулированные лимфоциты высевали в 96-луночные планшеты по 200 тысяч клеток в лунку и добавляли конъюгат QMTOVNOG-ДОКС и свободный ДОКС в диапазоне концентраций 10-500 нМ. Жизнеспособность клеток определяли с помощью МТТ-теста (Denizot F., Lang R. Rapid colometric assay for cell growth and survival. Modifications to this tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J. Immunol. Meth., 1986, v.89, p.271-277). За 4 часа до окончания инкубации в каждую лунку добавляли по 50 мкл раствора МТТ (Sigma) в концентрации 1 мг/мл в среде для культивирования клеток. После развития окраски среду удаляли, выпавшие кристаллы формазана растворяли в 100 мкл ДМСО и измеряли интенсивность окраски по поглощению при 540 нм на планшетном ридере (Labsystem). Выживаемость клеток оценивали в процентах от необработанного контроля. На основании полученных данных строили кривые выживаемости (см. фиг.6). Для построения графиков использовали программу Origin (OriginLab Corporation). По кривым выживаемости определяли значения IC₅₀ (концентрацию вещества, ингибирующую рост клеток на 50%) для каждой линии клеток. Значения IC₅₀ приведены в таблице 2. Из данных, приведенных на фиг.6 и в таблице 2, следует, что цитотоксичность конъюгата QMTOVNOG-ДОКС для опухолевых клеток близка к цитотоксичности ДОКС в свободном состоянии, в то время как для лимфоцитов цитотоксичность конъюгата QMTOVNOG-ДОКС ниже (по сравнению со свободным ДОКС) более чем в 10 раз.

Результаты по исследованию цитотоксичности хорошо согласуются с данными по накоплению конъюгата QMTOVNOG-ДОКС в клетках. В отношении опухолевых клеток, где уровень накопления конъюгата достаточно высок, конъюгат проявляет высокую цитотоксическую активность. В лимфоцитах уровень накопления конъюгата крайне низок - на уровне неспецифики, соответственно и цитотоксическая активность его тоже низка. Таким образом, полученные in vitro результаты свидетельствуют об избирательности действия конъюгата по отношению к опухолевым клеткам.

Таблица 2.IC₅₀ конъюгата QMTOVNOG-ДОКС и свободного ДОКС для опухолевых клеток (SKOV3 и MCF-7) и для лимфоцитов периферической крови.Линия клетокIC₅₀ для ДОКСIC₅₀ для конъюгата QMTOVNOG-ДОКСSKOV3305 нМ260 нМMCF-7320 нМ320 нМЛимфоциты170 нМ>1000нМ

Пример 6. Получение фармацевтической композиции.

Фармацевтическую композицию для инъекций получают растворением конъюгата QMTOVNOG-ДОКС в физрастворе или ФСБ (рН растворов около 7,4) до достижения концентрации 0,05-0,1% непосредственно перед внутривенным введением.

Таким образом, из полученных экспериментальных данных следует, что предлагаемый пептид формулы QMTOVNOG способен избирательно проникать в опухолевые клетки и может выполнять функцию селективной векторной молекулы для направленной доставки противоопухолевых препаратов в раковые клетки. Разработана методика получения конъюгата QMTOVNOG-ДОКС с высоким выходом, в котором пептид ковалентно связан с ДОКС прочной тиоэфирной связью. Полученный конъюгат обладает высокой цитотоксической активностью, сравнимой с активностью доксорубицина в отношении опухолевых клеток человека исследованных линий, и при этом практически не поражает здоровые клетки. Конъюгат QMTOVNOG-ДОКС активно эндоцитирует в опухолевые клетки, быстро попадает в ядро, где ДОКС воздействует на свою основную мишень - ДНК. В отличие от свободного ДОКС, который способен проникать во все клетки по градиенту концентрации, конъюгат QMTOVNOG-ДОКС обладает селективностью и токсичен только для опухолевых клеток, что позволяет расширить область применения данного препарата (по сравнению с ДОКС).

Изобретение относится к области медицины, фармацевтики и биохимии, а именно к лекарственным препаратам, содержащим пептиды, и может быть использовано в медицине для лечения онкологических заболеваний различной этиологии и касается применения пептида формулы QMTOVNOG, являющегося аналогом фрагмента α-фетопротеина с 472-й по 479-ю аминокислоту, способного избирательно захватываться опухолевыми клетками и выполнять функцию векторной молекулы для направленной доставки противопухолевых препаратов в опухолевые клетки, конъюгата указанного пептида с доксорубицином, в котором доксорубицин ковалентно присоединен к пептиду через тиоэфирную связь, а также фармацевтической композиции для лечения онкологических заболеваний, содержащей конъюгат доксорубицина с пептидом QMTOVNOG в качестве векторной молекулы в эффективном количестве и подходящий для внутривенного введения фармацевтический носитель. Изобретение обеспечивает селективность действия конъюгата, что позволяет расширить область применения препарата. 3 н.п. ф-лы, 2 табл., 6 ил.

1. Применение пептида формулы QMTOVNOG, являющегося аналогом фрагмента α-фетопротеина с 472-й по 479-ю аминокислоту, способного избирательно захватываться опухолевыми клетками, в качестве векторной молекулы для направленной доставки противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки.2. Конъюгат пептида формулы QMTOVNOG с доксорубицином, в котором доксорубицин ковалентно присоединен к указанному пептиду через тиоэфирную связь, в котором ковалентная тиоэфирная связь между ними создана путем взаимодействия SH-группы производного пептида, полученного реакцией пептида с N-гидроксисукцинимидным эфиром S-ацетилтиогликолевой кислоты, и двойной связи малеимидной группы гидразона доксорубицина, полученного реакцией доксорубицина с 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбонилгидразидом.3. Фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний, содержащая конъюгат доксорубицина с векторной молекулой в эффективном количестве и подходящий для внутривенного введения фармацевтический носитель, отличающаяся тем, что в качестве конъюгата доксорубицина она содержит конъюгат по п.2.