СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2011 года по МПК G01N30/94 

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам разделения химических соединений методом тонкослойной хроматографии, и может быть использовано для анализа смесей веществ в различных областях химии, фармации, медицины, контроле состояния окружающей среды, пищевой промышленности и т.д.

Способ разделения соединений методом тонкослойной хроматографии является одним из наиболее распространенных, простых и экономичных вариантов жидкостной хроматографии [Гейсс Ф. Основы тонкослойной хроматографии. Москва, Научный совет РАН по хроматографии, 1999. т.I (405 с.), т.II (348 с.); Poole C.F. The Essence of Chromatography. Amsterdam, Elsevier, 2003, 925 с.; Nyiredy Sz. Planar Chromatography. A Retrospective View for the Third Millenium, Budapest, Springer, 2001, p.253; Златкис А., Кайзер P.E. (Ред.). Высокоэффективная тонкослойная хроматография. М.: Мир, 1979, с.248].

Методы тонкослойной хроматографии активно применяют во всем мире. Только в России ТСХ используют более чем в 10000 лабораторий. Она может быть применена для решения многих аналитических задач не только в промышленности, но и дома, в школе, в фельдшерских пунктах и т.д. Весьма перспективно также дальнейшее развитие ТСХ как пилотного метода для современной жидкостной хроматографии.

Широкое практическое использование тонкослойной хроматографии в современной промышленности, в науке и в других областях нашей жизни объясняется рядом ее преимуществ по сравнению с колоночной жидкостной хроматографией (КЖХ).

Однако основными недостатками традиционной тонкослойной хроматографии, по мнению большинства исследователей, работающих в России и за рубежом, является, во-первых, относительно большая продолжительность метода, т.е. период времени от начала эксперимента до получения аналитических результатов, достаточно велик, и, во-вторых, большой вклад ручного труда экспериментатора при реализации методики эксперимента [Гейсс Ф. Основы тонкослойной хроматографии. Москва, Научный совет РАН по хроматографии, 1999. т.I (405 с.), т.II (348 с.)].

Определение состава анализируемой смеси методом тонкослойной хроматографии, включая собственно хроматографический процесс разделения и последующую компьютерную обработку полученных результатов, в настоящее время включает следующие основные этапы:

1) нанесение анализируемых проб на пластинку ТСХ;

2) элюирование (проявление, развитие) анализируемых проб потоком жидкой подвижной фазы;

3) высушивание пластинки;

4) определение характеристик, расположенных на пластине хроматографических зон разделенных соединений, используя различные денситометры, интерфейсы и компьютер.

Изложенный выше широко используемый во всем мире способ определения состава анализируемой смеси методом тонкослойной хроматографии рассматривается авторами как прототип предлагаемого изобретения.

Для разделения химических соединений согласно описанному способу используют два основных метода:

1) хроматографическое разделение, например, в прямоугольной камере на вертикально расположенной горизонтальной пластине, когда подвижная фаза поднимается снизу вверх по хроматографической пластине;

2) разделение в плоской прямоугольной камере на горизонтально расположенной хроматографической пластине.

Методики разделения этих методов широко известны и описаны там же.

Однако к недостаткам описанного способа можно отнести следующее:

1) для проведения измерений и компьютерной обработки тонкослойной хроматограммы предварительно необходимо проведение специальной операции высушивания хроматографической пластины, что требует использования специального оборудования, определенных затрат времени и ручного труда;

2) измерение параметров хроматографических зон и обработку полученных хроматограмм проводят только после того, когда процесс разделения анализируемых соединений полностью завершен, т.е. когда фронт подвижной фазы «прошел» всю хроматографическую пластину до ее противоположного края (по отношению к краю, контактирующему с жидкой подвижной фазой).

Поэтому в традиционном методе тонкослойной хроматографии экспериментатор получает количественные данные по разделению только после того, когда вся хроматографическая пластина была проявлена, независимо от того, разделились ли интересующие экспериментатора соединения (зоны) ранее, вообще не разделились или разделились только в конце эксперимента.

Для регистрации результатов разделения в тонкослойной хроматографии используют различные методы и приборы [Сумина Е.Г., Штыков С.Н., Тюрина Н.В. Тонкослойная хроматография. Теоретические основы и практическое применение (2-е издание). Саратов, Изд-во Саратовского университета, 2006, 112 с.; Красиков В.Д. Основы планарной хроматографии. Санкт-Петербург, Химиздат, 2005, 232 с.; Коган Ю.Д. ООО «ИМИД» и развитие современной количественной тонкослойной хроматографии. В кн.: Курганов А.А. (ред.). Хроматография на благо России. Составители: Коломиец Л.Н., Волков А.А., Якубов Э.С. М.: Граница, 2007, с.480-491; Красиков В.Д., Малахова И.И., Тяглов Б.В., Тенникова Т.Б. Жидкостная хроматография - научно-технические и коммерческие разработки. В кн.: Курганов А.А. (ред.). Хроматография на благо России. Составители: Коломиец Л.Н., Волков А.А., Якубов Э.С.М.: Граница, 2007, с.492-517].

Однако наиболее экономичным и эффективным способом в этой области, в том числе и в прототипе, являются методы, основанные на использовании видеоденситометров «Сорбфил», который разработан ООО «ИМИД» (г.Краснодар), и «Видеоскан», разработанный научно-техническим центром «Ленхром» (г.Санкт-Петербург) [Коган Ю.Д. ООО «ИМИД» и развитие современной количественной тонкослойной хроматографии. В кн.: Курганов А.А. (ред.). Хроматография на благо России. Составители: Коломиец Л.Н., Волков А.А., Якубов Э.С. М.: Граница, 2007, с.480-491; Красиков В.Д., Малахова И.И., Тяглов Б.В., Тенникова Т.Б. Жидкостная Хроматография - научно-технические и коммерческие разработки. В кн.: Курганов А.А. (ред.). Хроматография на благо России. Составители: Коломиец Л.Н., Волков А.А., Якубов Э.С. М.: Граница, 2007, с.492-517].

Задачей предлагаемого изобретения является создание нового способа разделения химических соединений методом тонкослойной хроматографии, который устраняет недостатки прототипа, т.е. в котором, во-первых, отсутствует операция высушивания хроматографической пластины, следовательно, сокращается продолжительность анализа и уменьшаются затраты ручного труда, во-вторых, процесс измерений параметров хроматографических зон и обработки тонкослойной хроматограммы проходит в процессе разделения анализируемой смеси мгновенно и многократно, т.е. в различные моменты времени в процессе продвижения фронта подвижной фазы вдоль всего сорбционного слоя хроматографической пластины, в-третьих, измерения хроматограмм проводят на «мокрой», т.е. смоченной подвижной фазой части хроматографической пластины, а не после завершения разделения на сухой пластине и создание устройства для его реализации.

Для решения поставленной задачи предложен способ разделения и определения химических соединений методом тонкослойной хроматографии, включающий нанесение пробы на хроматографическую пластину, проявление пластины жидкой подвижной фазой, регистрацию разделенных зон методом видеоденситометрии хроматограммы в условиях облучения хроматограммы на пластине дневным или ультрафиолетовым светом и проведение компьютерной обработки разделенных зон, в котором регистрацию разделенных зон проводят многократно квазинепрерывно, т.е. через относительно небольшие промежутки времени t₁, t₂…t_n, выбранные экспериментатором, в любой момент времени разделения и непосредственно в процессе хроматографического разделения анализируемой пробы, минуя стадии полного смачивания хроматографической пластины подвижной фазой и ее высушивания.

Выбор дневного или УФ-излучения зависит от природы разделяемых соединений. Если разделяемые соединения окрашены, то используют облучение дневным светом. Если же разделяемые соединения обладают поглощением или флюоресценцией при воздействии УФ-излучения, то соответственно используют ультрафиолетовый свет.

Поставленная задача решается также тем, что предложено устройство для разделения и определения химических соединений методом тонкослойной хроматографии, включающее хроматографическую камеру для расположения и проявления в ней хроматографической пластины и компьютерный видеоденситометр со светонепроницаемым корпусом, для определения состава анализируемой смеси по полученным на пластине результатам разделения, в котором хроматографическая камера частично или полностью выполнена из материала, пропускающего дневное или ультрафиолетовое излучение, и расположена на монтажной тележке внутри корпуса видеоденситометра, а корпус видеоденситометра имеет дверцу из светонепроницаемого материала для установки и/или смены монтажной тележки с хроматографической камерой и патрубки или решетки для вентиляции внутреннего пространства корпуса видеоденситометра.

В устройстве в качестве материала для хроматографической камеры используют плавленый SiO₂ или другой материал, пропускающий дневное или ультрафиолетовое излучение, а для вентиляции внутреннего пространства корпуса видеоденситометра оно снабжено источником повышенного или пониженного давления.

Впервые блок устройств, используемых в традиционной тонкослойной хроматографии для реализации хроматографического разделения химических соединений, включающий хроматографическую камеру с установленной в ней хроматографической пластиной, на которую предварительно нанесены анализируемые пробы, разделяемые потоком подвижной жидкой фазы, перемещающейся по сорбционному слою хроматографичекой пластины, и блок устройств для определения разделенных соединений, включающий осветительную камеру, освещающую хроматографическую пластину дневным или ультрафиолетовым светом, цветную видеокамеру, блок ввода изображения хроматографической пластины с разделенными зонами в компьютер, снабженный программами для обработки тонкослойных хроматограмм, монитор и принтер объединены в общее устройство.

Подобные комплексные устройства для обработки хроматограмм, полученных в процессе разделения химических соединений методом тонкослойной хроматографии, в процессе их получения нам не известны.

Важным отличием предлагаемого устройство является то, что оно снабжено системой вентиляции внутреннего пространства корпуса видеосинтометра, содержащего пары летучих веществ, используемых в качестве подвижной фазы (а в некоторых случаях и пары разделяемых соединений) в виде решетки или патрубков, присоединенных к источнику вакуума или давления.

Кроме того, используемые в устройстве закрытые или полузакрытые хроматографические камеры для разделения соединений снабжены плоскими стеклами или материалами, пропускающими УФ-излучение, что также в литературе не описано.

Устройство, схема которого представлена на фиг.2, включает:

1 - корпус устройства из светонепроницаемого материала; 2 - дверца из светонепроницаемого материала для установки и/или смены монтажной тележки, на которой расположена хроматографическая камера (ХК) и другие стандартные устройства, необходимые для реализации хроматографического процесса; 3 - блок электронных приборов, включая источник излучения, видеокамеру, преобразователи и т.д., который электронно и функционально связан с компьютером); 4 - патрубок для соединения с источником вакуума или давления с целью вентиляции и удаления паров подвижной фазы из внутреннего объема корпуса (1); 5 - решетка или патрубки для поступления воздуха во внутренний объем корпуса видеоденситометра при использовании в качестве побудителя движения воздуха источника давления или вакуума (на рисунке не показан), соединенного с патрубком (4); 6 - емкость для жидкой подвижной фазы, используемой при проведении разделения методом ТСХ; 7 - монтажная тележка, на которой расположена хроматографическая камера (ХК) с горизонтально (вариант А) или вертикально (вариант В) расположенной хроматографической пластиной (8), 9 - капилляр для подачи подвижной фазы; 10 - питатель, устройство для питания подвижной фазой хроматографической пластины во время проведения хроматографического процесса разделения (вариант А), 11 - крышка из плавленого SiO₂ (или другого материала, пропускающего УФ-излучение).

Устройство работает следующим образом.

На монтажную тележку (7) устанавливают хроматографическую камеру (ХК), предназначенную для проведения хроматографического процесса разделения. На сухую хроматографическую пластину (8) наносят пробы химических соединений для разделения на группы соединений или отдельные компоненты. Подготовленную таким образом хроматографическую пластину располагают в хроматографической камере горизонтально или вертикально (соответственно вариант А или В).

В случае А: на хроматографическую пластину накладывают поперечный прямоугольный питатель для подачи на пластину подвижной жидкой фазы, которая поступает по капилляру (9) из емкости (6); прижимают питатель к хроматографической пластине с помощью двух металлических зажимов.

Хроматографическая камера (ХК) частично или полностью выполнена из материала пропускающего дневное или ультрафиолетовое излучение.

С этой целью для варианта А хроматографическую камеру накрывают крышкой (11) из плавленого SiO₂ или обычного стекла, в зависимости от источника облучения.

Для варианта В одна из сторон ХК (или полностью ХК) должна быть выполнена из плавленого SiO₂ или обычного стекла, в зависимости от источника облучения.

Затем быстро с помощью монтажной тележки через дверцу (2) помещают хроматографическую камеру в корпус (1). К патрубку (4) присоединяют источник вакуума для вентиляции внутреннего пространства корпуса потоком воздуха, поступающего через решетку (5). При необходимости создания принудительного потока газа через корпус (1), вместо решетки (5) используют патрубки, присоединенные к источнику газа повышенного давления (эта часть конструкции не показана).

Блок электронных приборов (3) следит за развитием хроматограммы на пластине. Этот процесс отражает для каждой анализируемой пробы ее разделение на группы соединений и(или) на отдельные компоненты. Переданные в компьютер данные обрабатываются, и экспериментатор (по своему желанию) в каждый момент времени может получить сведения о реальном разделении анализируемой смеси на отдельные зоны, об их относительном содержании в смеси и хроматографических характеристиках (эффективности и об удерживании). Следует отметить, что аналитик может получить вышеуказанные сведения в любой момент времени, поскольку обработка хроматограммы происходит с использованием компьютера очень быстро по сравнению с движением хроматографической зоны по хроматограмме ("эффект кино"). Поэтому во время выполнения вышеуказанных операций хроматограмму можно рассматривать как неподвижную.

Поэтому аналитик после получения данных о разделении интересующих его проб анализируемых соединений сразу же может использовать полученную информацию, что особенно важно в тех случаях, когда ТСХ, например, используется для контроля химического процесса.

Нижеприведенные примеры реализации предлагаемого изобретения иллюстрируют, но никоим образом не ограничивают его область.

Пример 1

Разделение смеси соединений методом ТСХ при горизонтальном расположении пластинки ТСХ

Разделение и определение химических соединений проводят в хроматографической камере с горизонтально расположенной в ней хроматографической пластиной (вариант А) типа «Сорбфил» ПТСХ-АФ-В- УФ (Краснодар, Россия) размером 10×10 см, используя в качестве подвижной фазы толуол (чда).

В качестве анализируемой смеси для разделения применяют смесь красителей: сиба-Ф II, индофенол, ариабел красный, судан синий, судан II и диметиламиноазобензол (1:1:1:1:1:1).

После проведения холостого опыта на хроматографическую пластину с помощью микрошприца для ТСХ наносят пробы указанной смеси красителей на расстоянии 15 мм от края пластины. Затем на хроматографическую пластину устанавливают питатель; хроматографическую пластину накрывают стеклянной крышкой так, чтобы между адсорбционным слоем пластины и крышкой оставался зазор в 2 мм (или менее).

Для разделения окрашенных соединений хроматографическую пластину в процессе разделения облучают дневным светом для регистрации результатов во времени.

Хроматограммы разделения получают после 3, 5 и 7 см движения фронта подвижной фазы(естественно, возможно получать хроматограммы разделения на любом отрезке движения фронта ПФ по пластинке: от 1 до 7-8 см). Полученные хроматограммы при прохождении фронтом подвижной фазы расстояния в 3 и 7 см приведены на фиг.1.

Напротив хроматографической пластины расположена web-камера или любое другое устройство для фиксации изображения, которое соединено с компьютером. Используемое программное обеспечение позволяет быстро и эффективно обрабатывать полученные хроматограммы (программа «Videodensitometer»).

Приведенные на фиг.1 хроматограммы свидетельствуют о том, что предложенный способ позволяет ограничиться движением фронта подвижной фазы по хроматографической пластине на расстояние 3 см, не ожидая, пока фронт пройдет по ней на расстояние 7 см (или более).

Пример 2

Разделение смеси соединений на вертикально расположенной хроматографической пластине

Разделение химических соединений проводят в хроматографической камере с вертикально расположенной в ней хроматографической пластиной (вариант В) типа ПТСХ-П-А (фирма «Сорбфил», Краснодар, Россия) размером 10×10 см. Разделение и определение химических соединений проводят аналогично примеру 1.

В качестве подвижной фазы используют смесь бутилацетата и этанола (в соотношении 1:1), причем хроматографическую пластину предварительно модифицируют 1% раствором NaOH.

В качестве разделяемой смеси используют смесь флюоресцирующих красителей: ксиленоловый оранжевый, флуорексон, родамин С, нейтральный красный, причем все красители находятся в растворе в одинаковых концентрациях. Анализируемые пробы красителей наносят на хроматографическую пластину на расстояние 15 мм от края.

Хроматографическую пластину в процессе разделения облучают ультрафиолетовым светом с длиной волны λ=365 нм, непосредственно наблюдая разделение веществ, что особенно важно для бесцветных соединений.

С этой целью по крайней мере одна из сторон хроматографической камеры обращена к источнику УФ-облучения и выполнена из плавленого SiO₂, пропускающего УФ-облучение.

Напротив хроматографической пластины расположена web-камера или любое другое устройство для фиксации изображения, которое соединено с компьютером. Используемое программное обеспечение позволяет быстро и эффективно обрабатывать полученные хроматограммы (программа «Videodensitometer»).

После прохождения фронтом подвижной фазы определенного расстояния (например, в 1 см, причем отсчет расстояния движения фронта подвижной фазы проводят от линии нанесения образцов проб, подлежащих разделению), хроматографическую пластину, размещенную в закрытой хроматографической камере, используют для получения «фотохроматограммы», которую затем обрабатывают по компьютерной программе, разработанной фирмой «Сорбфил». Указанная программа предназначена для регистрации и практически для мгновенной обработки полученной на хроматографической пластине ТСХ-хроматограммы.

Операцию по мгновенному определению характеристик разделения выполняют на 1, 3, 5 и 7 см движения фронта подвижной фазы.

Полученные результаты показаны в табл.1. Как следует из представленных результатов, разделение смеси анализируемых красителей происходит уже при прохождении фронтом подвижной фазы расстояний в 3 и 5 см, т.е. ранее, чем вся хроматографическая пластина будет смочена подвижной фазой.

Таким образом, выше приведены результаты экспериментов, в которых, в отличие от известных, уже описанных в литературе, впервые показана возможность экспрессного получения хроматографических результатов.

Реализация предложенного способа тонкослойной хроматографии имеет принципиальное значение, т.к. позволяет не только повысить экспрессность тонкослойной хроматографии, но и расширить область его применения, в которой только своевременное, быстрое получение данных о составе реакционной смеси позволяет использовать этот метод для решения большой группы аналитических задач в промышленности, медицине, науке и т.д., например, при использовании тонкослойной хроматографии для контроля технологических или биохимических процессов).

Таблица 1. Разделение смеси флюоресцирующих красителей в ультрафиолетовом свете (N - число теоретических тарелок, R_f - подвижность анализируемого красителя). Название Положения на пластинке ТСХ фронта ПФ, при которых регистрировали хроматографические характеристики разделяемых соединений 1 см 3 см 5 см 7 см N R_f N R_f N R_f N R_f Ксиленоловый оранжевый 35 0,21 49 0,11 77 0,07 201 0,05 Флуорексон 1361 0,33 1280 0,47 3110 0,52 Родамин С 105 0,76 1030 0,78 1260 0,84 4080 0,86 Нейтральный красный 1120 0,86 1420 0,91 5320 0,94 Результаты разделения анализируемой смеси во времени при использовании предлагаемого способа Частичное разделение на 2 хроматографичес-кие зоны Недостаточно четкое разделение на 4 хроматографические зоны Полное разделение всех 4 соединений анализируемой смеси Полное разделение всех 4 соединений анализируемой смеси

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам разделения химических соединений методом тонкослойной хроматографии, и может быть использовано для анализа смесей веществ в различных областях химии, фармации, медицины, контроле состояния окружающей среды, пищевой промышленности и т.д. Предложеный способ разделения и определения химических соединений методом тонкослойной хроматографии; включает нанесение пробы на хроматографическую пластину. Затем осуществляют проявление пластины жидкой подвижной фазой, регистрацию разделенных зон методом видеоденситометрии хроматограммы в условиях облучения хроматограммы на пластине дневным или ультрафиолетовым светом. Далее проводят компьютерную обработку разделенных зон, в которой регистрацию разделенных зон проводят многократно в любой момент времени разделения и непосредственно в процессе хроматографического разделения анализируемой пробы, минуя стадии полного смачивания хроматографической пластины подвижной фазой и ее высушивания. Техническим результатом изобретения является обеспечение экспрессности тонкослойной хроматографии, а также расширение области применения и сокращение продолжительности анализа, при котором измерения параметров хроматографических зон и обработка тонкослойной хроматограммы проходит в процессе разделения анализируемой смеси мгновенно и многократно. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 ил.

1. Способ разделения и определения химических соединений методом тонкослойной хроматографии, включающий нанесение пробы на хроматографическую пластину, проявление пластины жидкой подвижной фазой, регистрацию на пластине разделенных зон хроматограммы методом компьютерной видеоденситометрии в условиях облучения пластины дневным или ультрафиолетовым светом, с последующим проведением компьютерной обработки результатов разделения, отличающийся тем, что регистрацию разделенных зон проводят многократно в любой момент времени разделения непосредственно в процессе хроматографического разделения анализируемой пробы на мокрой пластине, минуя стадии полного смачивания хроматографической пластины подвижной фазой и ее последующего высушивания.

2. Устройство для разделения и определения химических соединений методом тонкослойной хроматографии, включающее хроматографическую камеру для расположения и проявления в ней хроматографической пластины и компьютерный видеоденситометр со светонепроницаемым корпусом, для определения состава анализируемой смеси по полученным на пластине результатам разделения, отличающееся тем, что хроматографическая камера частично или полностью выполнена из материала, пропускающего дневное или ультрафиолетовое излучение, и расположена на монтажной тележке внутри корпуса видеоденситометра, а корпус видеоденситометра имеет дверцу из светонепроницаемого материала для установки и/или смены монтажной тележки с хроматографической камерой и патрубки или решетки для вентиляции внутреннего пространства корпуса видеоденситометра.

3. Устройство по п.2, отличающееся тем, что в качестве материала для хроматографической камеры используют плавленый SiO₂.