СПОСОБ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ДОЖДЕВЫХ ЧЕРВЕЙ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/15 A61K35/56 

Предлагаемое изобретение относится к области фармацевтики и косметики, в частности включает оценку эффективности полученных на основе дождевых червей фармацевтических, косметических препаратов и биологически активных добавок - в процессе их производства, хранения и для подбора оптимальных доз.

В медицине и косметике все более широкое применение находят получаемые из дождевых червей вермипрепараты. Интерес к вермипрепаратам обусловлен их противоопухолевой, антибактериальной, антиоксидантной, иммуногенной и многими другими активностями. Известно большое число различных вермипрепаратов, но особенно широко используются такие вермипрепараты как "Люмбрикус", "Фунайкан", фибринолитический комплекс "Люмброкиназа", энзимный активатор сердца "Лонг-тонг", антимикробные пептиды люмбрицин, лизенин и т.д. Первый получают из тела половозрелого червя Е. fetida (или других родственных видов дождевых червей) в виде сухого мелкодисперсного порошка. Для изготовления "Люмброкиназы", "Лонг-тонг" из дождевых червей выделяют и очищают фракции активных белков, пептидов [Sun Zhenjun. Vermiculture and vermiprotein. China Agricultural University Press, 2003, P.367]. В связи с тем, что для производства вермипрепаратов используется живое сырье, то количество и качество биологически активных агентов, входящих в их состав, зависит от различных условий, в частности от исходного физиологического состояния дождевых червей. Поэтому столь актуальным является наличие простых методов экспрессной оценки их эффективности. К сожалению, на сегодня подобные методы практически отсутствуют.

Известен способ оценки активности фармацевтического препарата, изготовленного из дождевых червей, из "Китайская фармакопея" по активности протеаз [Китайская фармакопея, издание 1990 г., часть А, приложение, с.56]. В качестве единицы активности на грамм протеазы принимают невыпавший раствор, получаемый при гидролизе тирозина в течение одной минуты (пептиды, аминокислоты и др.) при длине волны 280 нм и содержании энзима, равном 1 мкмолю тирозина в контрольном растворе и растворе медикамента.

Ближайшим аналогом является способ оценки активности фармацевтического препарата, изготовленного из дождевых червей, из "Китайская фармакопея" по гемолизу крови кролика [Китайская фармакопея, издание 1990 г., часть А, приложение, с.56]. Венозную кровь берут шприцом из ушной вены кролика и быстро вводят в пластмассовую пробирку диаметром 2 мм. Пробирка до момента исследования хранится в морозильнике. Раствор медикамента и контрольный раствор переносится в отдельные пробирки. Подготовленный сгусток крови из пластмассовой пробирки вводится в каждую из тестируемых пробирок. Пробирки покрываются крышечками и переносятся в инкубатор с температурой 37°С. В исследуемой пробирке должен наступить гемолиз сгустка, зато в контрольной пробирке сгусток не подвергнется гемолизу.

Недостатками известных методов являются дороговизна, необходимость в обученных специалистах и соответственно оборудованная лаборатория. Рассмотренные методы не могут давать интегральную оценку активности вермипрепаратов, так как последняя складывается не только из белковой активности протеаз и гемолитических ферментов, но и из действия специфичных антимикробных пептидов, мукополисахаридов и других веществ небелковой природы.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка экспрессной оценки активности фармацевтических, косметических препаратов и биологически активных добавок из дождевых червей по остановке циклоза в клетках нителлы и клетках у основания листа элодеи.

Поставленная задача достигается помещением отдельных клеток нителлы и листочков элодеи в испытуемый раствор вермипрепарата. Затем фиксируют время остановки циклоза в клетках растений. Об активности вермипрепарата судят по времени остановки циклоза, сравнивая: контроль - пресная вода, контрольный вермипрепарат, полученный с максимальным соблюдением всех требований, и тестируемый на активность вермипрепарат.

Нами обнаружено, что фармацевтический вермипрепарат активно подавлял циклоз в клетках нителлы и элодеи. Действие ослабленного нагреванием при 100°С препарата проявлялось, а в некоторых случаях отсутствовало. Эту особенность фармацевтических вермипрепаратов можно использовать для оценки их биологической активности, эффективного использования, подбора оптимальных доз, контроля условий производства, хранения и потребления.

Способ осуществляется следующим образом.

Берут нителлу и элодею - широко распространенные и легко доступные для сбора водные макрофиты. В опытах используют гидрофиты, произрастающие в оз. Байкал, реке Ангаре и близлежащих водоемах. Для изготовления вермипрепаратов отбирают половозрелые особи дождевых червей Е. fetida Andrei boche. Для очищения кишечника и покровов от почвы дождевых червей выдерживают в течение 2-х суток в подкисленной воде без пищи. В дальнейшем живых червей гомогенизируют и лиофилизируют. Для ослабления активности часть готового вермипрепарата нагревают при 100°С в течение 30 минут. В опыте работают с водными суспензиями вермипрепаратов, для получения которых навеску вермипрепарата смешивают на магнитной мешалке с водой в массовых единицах 1:100 в течение 1 часа. Затем суспензию центрифугируют в течение 5 минут при 3000 об/мин. Концентрацию белка в супернатанте определяют по методу Лоури [Бузун Г.А, Джемухадзе К.Н., Милешко Л.Д. Определение белка в растениях с помощью амидо-черного // Физиол. растений. 1982, Т.29, Вып.1, С.198-204]. Испытуемый раствор хранят в герметичной посуде при +5°С не более суток. Контролем служила дехлорированная водопроводная вода.

Для определения активности вермипрепарата по остановке циклоза в клетках нителлы и элодеи растения и водоросли экспонируют в 1% (0,9 мг белка/мл) суспензиях вермипрепарата. Затем интенсивность движения цитоплазмы в клетках оценивают, микроскопируя их при увеличении в 100 раз.

Вермипрепарат останавливал циклоз в клетках элодеи через 4±0,3 часа, а в клетках нителлы через 2±0,1 часа. Вермипрепарат, ослабленный нагреванием, прекращал циклоз в клетках нителлы через 4±0,1 часа, и не приводил к остановке циклоза в листочках элодеи более суток.

Пример 1. Вермипрепарат суспензируют в воде, листочки высшего водного растения элодеи экспонируют в полученном после центрифугирования суспензии растворе, сравнивают время остановки циклоза в клетках растений между контролем - пресной водой, контрольным вермипрепаратом, полученным с максимальным соблюдением всех требований, и тестируемым на активность препаратом.

Пример 2. Вермипрепарат суспензируют в воде, клетки харовой водоросли нителлы экспонируют в полученном после центрифугирования суспензии растворе, сравнивают время остановки циклоза в клетках растения между контролем - пресной водой, контрольным вермипрепаратом, полученным с максимальным соблюдением всех требований, и тестируемым на активность препаратом.

Достоинствами предлагаемого нами способа являются его легкость в исполнении, техническая простота, дешевизна, экспрессность, возможность производить оценку качества вермисырья и вермипрепаратов в полевых условиях. Способ дает интегральную оценку активности вермипрепаратов в отличие от известных методов.

Изобретение относится к области фармацевтики и косметики, в частности к оценке эффективности полученных на основе дождевых червей фармацевтических и косметических препаратов. Способ оценки активности препарата, полученного из дождевых червей, по тест-реакции, в котором в качестве тест-реакции используют реакцию остановки движения цитоплазмы в клетках водных макрофитов, при этом показателем понижения активности препарата является отсутствие влияния на циклоз в клетках водных макрофитов или удлинение времени его остановки в сравнении с контрольным препаратом. Вышеописанный способ позволяет производить оценку качества вермисырья и вермипрепаратов в полевых условиях, легок в использовании, технически прост. 2 з.п. ф-лы.

1. Способ оценки активности препарата, полученного из дождевых червей, по тест-реакции, отличающийся тем, что в качестве тест-реакции используют реакцию остановки движения цитоплазмы в клетках водных макрофитов, при этом показателем понижения активности препарата является отсутствие влияния на циклоз в клетках водных макрофитов или удлинение времени его остановки в сравнении с контрольным препаратом.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве водного макрофита используют элодию.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве водного макрофита используют харовую водоросль нителлу.