СПОСОБ ПОДГОТОВКИ КЛЕТОК КОНЪЮНКТИВЫ К ЦИТОЛОГИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/48 G01N1/30 

Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии, и может использоваться при подготовке клеток конъюнктивы к цитологическому исследованию.

Впервые термин импрессионной цитологии был предложен в 1977 году 2 группами авторов. Egbert et al. [Brewitt H., Zierhut M. Trockenes Auge: Anatomie, Physiologie, Pathophysiologie, Diagnostik, Therapie. / H.Brewitt, M.Zierhut (Hrsg.). - Heilderberg: Kaden, 2001. - 180 S.] применял импрессионную цитологию для исследования плотности клеток Бехера, при помощи «отпечатка» конъюнктивы на фильтровальную бумагу. Teatcher et al. позиционировал ИЦ как метод анализа воспалительных изменений конъюнктивы [Brewitt Н., Zierhut М. Trockenes Auge: Anatomie, Physiologie, Pathophysiologie, Diagnostik, Therapie. / H.Brewitt, M.Zierhut (Hrsg.). - Heilderberg: Kaden, 2001. - 180 S.].

Импрессионной цитологии предшествовала эксфолиативная цитология, которая заключалась в «соскребании» материала конъюнктивы с помощью шпателя, который в англоязычной литературе обозначается как «скрапинг», либо «мазковая» цитология с помощью хлопкового тупфера или аспирационная цитология слезной пленки.

В настоящее время также известны способы подготовки клеток конъюнктивы к цитологическому исследованию, включающие соскоб эпителия бульбарной конъюнктивы. Например, способ подготовки препарата для диагностики изменений конъюнктивы глазного яблока [RU 2282843 C2, 200]. Сущность способа заключается в подготовке препарата для цитологического исследования, для чего проводят соскоб эпителия бульбарной конъюнктивы, при этом соскобный материал с бульбарной конъюнктивы берут расслаивателем (ALKON) после предварительной местной анестезии раствором 0,5% дикаина и наносят на поверхность чистого обезжиренного предметного стекла, высушивают естественным путем, фиксируют 96% этиловым спиртом, окрашивают по Романовскому-Гимзе, затем краску смывают проточной водой, соскобы высушивают естественным путем. Цитологические препараты микроскопируют.

Основным недостатком данного способа является его инвазивность. При осуществлении соскоба эпителия бульбарной конъюнктивы расслаивателем ALKON возможно повреждение конъюнктивы, геморрагии и расслоение слизистой, что в дальнейшем может привести к таким серьезным осложнениям, как кровоизлияние под конъюнктиву или перфорация конъюнктивы. Также 0,5% раствор дикаина, используемый в данном способе, является более токсичным для роговицы, чем современные анестетики (например, 0,4% инокаин).

Стандартом в сборе материала при импрессионной цитологии является методика Kruse F.Е. [Brewitt H., Zierhut M. Trockenes Auge: Anatomie, Physiologie, Pathophysiologie, Diagnostik, Therapie. / H.Brewitt, M.Zierhut (Hrsg.). - Heilderberg: Kaden, 2001. - 180 S.].

Данный способ выбран нами в качестве прототипа.

Для сбора материала эпителиальных клеток используется целлюлозно-ацетатный фильтр (Millipore VSWP 0,025 mm). Данные фильтры выпускаются диаметром 13, 25 и 27 мм. Диск из целлюлозно-ацетатного фильтра вырезают по шаблону соответственно площадке грузика, то есть 4 на 6 мм. Затем вырезанные диски упаковывают в индивидуальные эпендорфы для стерилизации. После стерилизации диск из целлюлозно-ацетатного фильтра прикрепляют клейкой стороной к тонометру. Таким образом, закрепленным диском из целлюлозно-ацетатного фильтра надавливают на бульбарную конъюнктиву в течение несколько секунд с силой 25-30 mm Hg в меридиане 12 часов в 2-3 мм над лимбом. Обследования проводят после инстилляций местных анестетиков. Для фиксации препарата используют дистиллированную воду, периоидную кислоту 0,5%, реагент Шиффа, метабисульфат калия 10%, гематоксилин Майера, карбонат лития 1,27Ф, а также спирт и ксилол. Для придания диску из целлюлозно-ацетатного фильтра прозрачности его растворяют.

Готовый препарат покрывают полистиролом и покровным стеклом и изучают методом световой микроскопии при увеличении 150-300.

Недостатки прототипа

Выполнение способа, выбранного нами в качестве прототипа, неудобно и длительно, так как включает в себя несколько этапов:

- вырезание дисков из целлюлозно-ацетатного фильтра по шаблону соответственно площадке грузика 4 на 6 мм;

- «упаковывание» в эпендорфы;

- стерилизация вырезанных дисков из целлюлозно-ацетатного фильтра;

- фиксация стерильных дисков из целлюлозно-ацетатного фильтра к грузику для тонометрии;

- фиксация диска из целлюлозно-ацетатного фильтра на предметное стекло с помощью прозрачного клейкого материала;

- растворение диска из целлюлозно-ацетатного фильтра для придания ему прозрачности.

К недостатку способа прототипа можно также отнести его высокую стоимость. Стоимость упаковки из 100 целлюлозно-ацетатных фильтров (Millipore VSWP 0,025 mm) составляет 433 доллара (13000 рублей). Стоимость одного фильтра, из которого необходимо вырезать диск, составляет 130 руб.

Техническим результатом изобретения является упрощение способа подготовки клеток конъюнктивы к цитологическому исследованию, сокращение времени его проведения, а также уменьшение стоимости способа.

Технический результат достигается тем, что сбор пробы, состоящей из клеток конъюнктивы, осуществляют путем надавливания на бульбарную конъюнктиву исследуемого глаза в 2-3 мм над лимбом в меридиане 12 часов мягкой контактной линзой (МКЛ), установленной вогнутой стороной на тонометре. Затем МКЛ снимают с тонометра и выворачивают с возможностью нахождения полученной пробы на дне МКЛ, фиксируют ее в 95% спирте путем однократного погружения. После чего МКЛ промывают дистиллированной водой, затем окрашивают ее гематоксилином в течение 10-15 секунд, промывают дистиллированной водой и подсушивают на воздухе. Затем МКЛ размещают на поверхности предметного стекла для цитологического исследования.

Способ осуществляется следующим образом.

Забор материала осуществляют при помощи МКЛ. Нами использовались однодневные линзы 1 day ACUVUE, рефракция - 3,0;8,5. Диаметр МКЛ 14,2 мм, радиус кривизны - 8,6. После инстилляции местного анестетика (Sol.Inokaini 0,4%) извлеченную из блистера МКЛ и предварительно «подсушенную» на воздухе при комнатной температуре МКЛ устанавливают «вогнутой» стороной на тонометр Маклакова. Затем тонометр с МКЛ прикладывают к бульбарной конъюнктиве в 2-3 мм над лимбом в меридиане 12 часов на 2-3 секунды (как при измерении ВГД). Затем МКЛ снимают с тонометра и выворачивают таким образом, чтобы полученный материал находился на «дне» МКЛ. Такую же манипуляцию проделывают с другим глазом, то есть для каждого глаза используют «свою» МКЛ. МКЛ фиксируют 95% этиловым спиртом в течение 10 минут путем однократного погружения. Затем промывают дистиллированной водой, окрашивают гематоксилином в течение 10-15 секунд, промывают дистиллированной водой и подсушивают на воздухе. МКЛ укладывают на предметное стекло, не фиксируя ее покровным стеклом, для удобства перемещения ее под объективом.

Затем производят цветовую микроскопию на микроскопе Leica LEITZ DM RB при увеличении 200 (объектив×20, окуляр×10) и фотографируют полученные результаты.

Отличительными существенными признаками заявляемого способа являются:

- мягкую контактную линзу устанавливают вогнутой стороной на тонометр и надавливают ею на бульбарную конъюнктиву исследуемого глаза;

- затем МКЛ снимают с тонометра и выворачивают с возможностью нахождения полученной пробы на дне МКЛ;

- МКЛ фиксируют в 95% спирте путем однократного погружения, промывают дистиллированной водой;

- затем окрашивают гематоксилином в течение 10-15 секунд, промывают дистиллированной водой и подсушивают на воздухе.

Причинно-следственная связь между существенными отличительными признаками и достигаемым результатом

- Установка МКЛ на тонометре не требует ее закрепления, так как, имея вогнутую поверхность, а также диаметр 14,2 мм, радиус кривизны 8,5, МКЛ удерживается на тонометре (как бы «обтекает» его) и поэтому не требует дополнительной фиксации. МКЛ не требует также стерилизации и растворения для придания ей прозрачности, так как МКЛ стерильна и прозрачна. МКЛ не требует также фиксации на предметном стекле.

Использование МКЛ в качестве материала для сбора пробы, состоящей из клеток конъюнктивы, позволяет упростить способ и сократить время его проведения за счет исключения таких этапов способа, присущих прототипу, как:

- вырезание дисков из целлюлозно-ацетатного фильтра по шаблону соответственно площадке грузика;

- «упаковывание» в эпендорфы;

- стерилизация вырезанных дисков из целлюлозно-ацетатного фильтра;

- фиксация диска из целлюлозно-ацетатного фильтра к грузику для тонометрии;

- фиксация диска из целлюлозно-ацетатного фильтра на предметное стекло с помощью прозрачного клейкого материала;

- растворение диска из целлюлозно-ацетатного фильтра для придания ему прозрачности.

Использование МКЛ в качестве материала для сбора пробы позволяет также снизить стоимость способа. Стоимость одного целлюлозно-ацетатного фильтра Millipore VSWP 0,025 mm (D=13 мм), из которого вырезают диск, у фирмы поставщика составляет 130 руб., а стоимость одной мягкой контактной линзы составляет 25 руб., так как стоимость одной упаковки 1 day ACUVUE из 30 МКЛ у фирмы поставщика составляет 750 рублей.

- Выворачивание МКЛ после снятия ее с тонометра с возможностью нахождения полученной пробы на дне МКЛ необходимо для сохранности максимального количества клеток конъюнктивы.

- МКЛ с полученной пробой фиксируют в 95% спирте путем однократного погружения, промывают дистиллированной водой, так как данная фиксация является достаточной для такого объекта, как одноразовая мягкая контактная линза.

В ходе разработки заявляемого способа нами были опробованы три варианта фиксации полученного материала.

1. МКЛ фиксировали 95% этиловым спиртом в течение 10 минут путем однократного погружения. Затем МКЛ извлекали из спирта, промывали дистиллированной водой и помещали в промаркированный контейнер.

2. МКЛ фиксировали 95% этиловым спиртом в течение 10 минут путем однократного погружения. Затем МКЛ извлекали из спирта и помещали в промаркированный контейнер, заполненный физиологическим раствором (0,9% NaCl).

3. МКЛ с полученной пробой « прикладывали» к промаркированному обезжиренному 95% этиловым спиртом предметному стеклу. Материал на стекле фиксировали в течение 10 минут 95% этиловым спиртом, затем промывали проточной водой, высушивали на воздухе.

Из всех апробированных нами вариантов фиксации был выбран вариант №1 как наиболее оптимальный, так как при применении этого способа сохраняется максимальное количество клеток.

- Окрашивание гематоксилином в течение 10-15 секунд является достаточным для такого объекта, как одноразовая мягкая контактная линза. Временной режим окрашивания подобран нами опытным путем.

- Промывание дистиллированной водой и подсушивание на воздухе после окрашивания необходимо для возможности проведения цитологического исследования.

Совокупность отличительных существенных признаков является новой и позволяет по сравнению с прототипом упростить способ подготовки клеток конъюнктивы к цитологическому исследованию, сократить время его проведения, а также снизить стоимость способа.

Пример конкретного выполнения способа

Пациентка - Б. 24 года, Дата забора материала 15.07.09 - №11.

Диагноз - Хронический аллергический конъюнктивит, синдром «сухого глаза» средней степени тяжести обоих глаз.

Цель исследования - Цитологическое исследование бульбарной конъюнктивы.

После инсталляции местного анестетика (Sol.Inokaini 0,4%) извлеченную из блистера МКЛ и предварительно «подсушенную» на воздухе при комнатной температуре МКЛ установили «вогнутой» стороной на тонометр Маклакова весом в 10 г. Нами использовались однодневные линзы 1 day ACUVUE, рефракция - 3,0;8,5. Диаметр МКЛ 14,2, радиус кривизны 8,5. Затем тонометр с МКЛ прикладывали к бульбарной конъюнктиве в 3 мм над лимбом в меридиане 12 часов на 3 секунды. Затем МКЛ вывернули таким образом, что полученный материал оказался на «дне» МКЛ. Такую же манипуляцию проделали с другим глазом. МКЛ сняли с тонометра и зафиксировали 95% этиловым спиртом в течение 10 минут путем однократного погружения.

МКЛ промыли дистиллированной водой, окрасили гематоксилином в течение 15 секунд, промыли дистиллированной водой и подсушили на воздухе. МКЛ уложили на предметное стекло, не фиксируя ее покровным стеклом. Затем произвели цветовую микроскопию на микроскопе Leica LEITZ DM RB при увеличении 200 (объектив×20, окуляр×10) и сфотографировали полученные результаты.

При микроскопии на МКЛ визуализировали эпителий округлой или полигональной формы, одноядерный. В умеренном количестве встречали полиморфные эпителиальные клетки. В малом количестве встречали клетки эпителия с вакуольной дистрофией цитоплазмы с трудно различимым ядром. Обнаруживали лейкоциты (нейтрофилы) до 6 в поле зрения, эозинофилы не были выявлены.

Нами проведено 56 исследований.

Было обследовано 7 человек (14 глаз) в основной группе - пациенты с синдромом «сухого глаза» (ССГ), ассоциированным хроническим аллергическим конъюнктивитом; 7 человек (14 глаз) в группе сравнения I - пациенты с хроническим аллергическим конъюнктивитом без наличия синдрома «сухого глаза»; 9 человек (18 глаз) в группе сравнения II с ССГ не ассоциированным хроническим аллергическим конъюнктивитом; 5 человек (10 глаз) - контрольная группа, которую составили здоровые люди без признаков аллергических заболеваний и ССГ.

Результаты

1. Основная группа.

В препаратах - клетки плоского эпителия в количестве 15-15-12 в поле зрения, округлой формы, с равномерной цитоплазмой, нейтрофилы 0-1 в поле зрения, эозинофилы не обнаружены.

У 10% обследованных пациентов в 30% клеток отмечается перинуклеарное просветление.

2. Группа сравнения I.

Клетки эпителия округлой формы, с равномерной цитоплазмой, нейтрофилы 0-1 в поле зрения, эозинофилы не обнаружены. У 15% обследованных пациентов в умеренном количестве встречаются полиморфные эпителиальные клетки.

3. Группа сравнения II.

Эпителий округлой формы с четким правильным ядром, расположенным в центре клетки. Цитоплазма однородная, без признаков дистрофии. Дегенеративных клеток эпителия нет. Нейтрофилы 1-2-3 в поле зрения, эозинофилы отсутствуют. В 5% случаев обнаруживаются эпителиальные в большом количестве округлой формы или полигональной формы, одноядерные. В умеренном количестве встречаются полиморфные эпителиальные клетки. В малом количестве встречаются клетки эпителия с вакуольной дистрофией цитоплазмы с трудно различимым ядром. Лейкоциты (нейтрофилы) до 6 в поле зрения.

4. Контрольная группа.

В препаратах - клетки плоского эпителия в количестве 15-15-12 в поле зрения, округлой формы, с равномерной цитоплазмой, нейтрофилы 0-1 в поле зрения, эозинофилы не обнаружены.

Заявляемый способ подготовки клеток конъюнктивы к цитологическому исследованию по сравнению со способом-прототипом позволяет:

- значительно упростить способ и сократить время его проведения, так как исключаются такие этапы, присущие способу прототипу, как:

вырезание диска из целлюлозно-ацетатного фильтра по шаблону соответственно площадке тонометра;

«упаковка» в эпендорф;

стерилизация диска из целлюлозно-ацетатного фильтра; фиксация диска из целлюлозно-ацетатного фильтра к грузику для тонометрии;

фиксация диска из целлюлозно-ацетатного фильтра на предметное стекло с помощью прозрачного клейкого материала;

растворение диска из целлюлозно-ацетатного фильтра для придания ему прозрачности.

- снизить стоимость способа.

Заявляемый способ подготовки клеток конъюнктивы к цитологическому исследованию разработан на кафедре офтальмологии Санкт-Петербургской Государственной Педиатрической Академии и во Всероссийском центре экстренной и радиационной медицины МЧС.

Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии, и может использоваться при подготовке клеток конъюнктивы к цитологическому исследованию. Сущность способа заключается в том, что сбор пробы, состоящей из клеток конъюнктивы, осуществляют путем надавливания на бульбарную конъюнктиву глазного яблока исследуемого глаза в 2-3 мм над лимбом в меридиане 12 часов мягкой контактной линзой (МКЛ), установленной вогнутой стороной на тонометре. Затем МКЛ снимают с тонометра и выворачивают таким образом, чтобы полученная проба находилась на дне МКЛ, которую фиксируют в 95% спирте путем однократного погружения. После чего МКЛ промывают дистиллированной водой, затем окрашивают ее гематоксилином в течение 10-15 секунд, промывают дистиллированной водой и подсушивают на воздухе. Затем МКЛ размещают на поверхности предметного стекла для цитологического исследования. Изобретение позволяет упростить способ подготовки клеток конъюнктивы к цитологическому исследованию, сократить время его проведения, а также снизить его стоимость.

Способ подготовки клеток конъюнктивы к цитологическому исследованию, заключающийся в сборе пробы, состоящей из клеток конъюнктивы, путем надавливания на бульбарную конъюнктиву глазного яблока исследуемого глаза в 2-3 мм над лимбом в меридиане 12 ч, установленным на тонометре материалом для сбора пробы с последующей его фиксацией, окраской и размещением на поверхности предметного стекла для цитологического исследования, отличающийся тем, что сбор пробы, состоящей из клеток конъюнктивы, осуществляют с помощью мягкой контактной линзы (МКЛ), которую устанавливают вогнутой стороной на тонометр, затем МКЛ после надавливания на бульбарную конъюнктиву глазного яблока снимают с тонометра и выворачивают с возможностью нахождения полученной пробы на дне МКЛ, которую фиксируют в 95%-ном спирте путем однократного погружения, промывают дистиллированной водой, после чего окрашивают гематоксилином в течение 10-15 с, промывают дистиллированной водой и подсушивают на воздухе.