Способ забора мазка-отпечатка с конъюктивы и роговицы для верификации диагноза синдрома сухого глаза и синдрома лимбальной недостаточности (варианты) Российский патент 2024 года по МПК A61B3/00 G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и предназначено для забора мазка-отпечатка с бульбарной и вековой части конъюнктивы у пациентов рефракционного профиля с последующим определением плотности бокаловидных клеток (БК) в изучаемом образце при проведении цитологического исследования, что является диагностическим критерием в определении функциональности водно-муцинового компонента слезной пленки (СП) при синдроме сухого глаза (ССГ), а также для забора мазка-отпечатка с поверхности роговицы у пациентов с васкуляризованными бельмами различной этиологии с последующим определением БК и специфических внутриклеточных белков-кератинов (К), являющихся диагностическим критерием синдрома лимбальной недостаточности (СЛН).

Одной из основных причин неудовлетворенности качеством зрительных функций после проведения кераторефракционной хирургии является индуцированный ССГ, проявляющийся в зрительном дискомфорте, ощущении сухости и инородного тела, расплывчатого изображения. В связи с этим важным аспектом перед проведением оперативного вмешательства у пациентов рефракционного профиля является дооперационное выявление признаков ССГ с последующим курсом консервативного лечения.

СЛН - это полиэтиологическое заболевание глазной поверхности, вызванное снижением пула и/или функциональной активности эпителиальных стволовых клеток лимба, что приводит к невозможности поддерживать нормальный гомеостаз роговичного эпителия. В связи с полным или частичным отсутствием источника регенерации роговичного эпителия, происходит миграция БК конъюнктивы на поверхность роговицы, что сопровождается врастанием новообразованных сосудов с формированием фиброваскулярного паннуса и, в тяжелых случаях, тотальным помутнением роговицы. Диагностика данного заболевания затруднительна ввиду схожести биомикроскопической картины с другими патологиями роговицы, именно поэтому определение БК конъюнктивы и специфических К на поверхности роговицы могут надежно диагностировать СЛН.

Наиболее актуальными лабораторными методами в диагностическом скрининге ССГ являются исследование медиаторов воспаления в слезной жидкости, изучение осмолярности слезы и проведение импрессионной цитологии БК конъюнктивы [McCauley НА, Guasch G. Three cheers for the goblet cell: maintaining homeostasis in mucosal epithelia. Trends in molecular medicine. 2015;21(8):492-503. doi: 10.1016/j.molmed.2015.06.003.].

Общеизвестно, что БК конъюнктивы выделяют растворимые муцины в водно-муциновый слой слезной пленки, выполняя защитную и регуляторную функции. В связи с этим для оценки состояния водно-муцинового слоя СП возможно проведение цитологического исследования БК конъюнктивы с целью верификации диагноза синдром ССГ. При выполнении цитологического исследования образца бульбарной конъюнктивы необходимо помнить о различии в распределении плотности БК в зависимости от зоны фиксации мазка-отпечатка [Kessing S. Mucous gland system of the conjunctiva: A quantitative normal anatomical study. Acta Ophthalmol suppl. 1968; 95:1-133]. В связи с этим, для получения достоверных данных о распределении плотности БК в исследуемом образце необходимо проводить фиксацию мазка-отпечатка в симметричных участках почти по всей поверхности бульбарной и вековой частей конъюнктивы на оба глаза.

Обнаружение БК возможно также и при СЛН, однако это не всегда является достоверным критерием, так как при тяжелой стадии заболевания БК могут вовсе отсутствовать [Dua HS, King AJ, Joseph A. A new classification of ocular surface burns. Br J Ophthalmol 2001; 85: 1379-1383]. Множеством зарубежных работ доказано, что наиболее точным методом диагностики СЛН является обнаружение К, специфичность которых заключается в избирательной экспрессии в цитоплазме клеток конъюнктивы или роговицы. Использовании данной методики включает сложное флюоресцентное окрашивание - иммуноцитохимический анализ (ИЦХА) реакции антиген-антител-флюорохром (свечение клеток).

Ближайшим аналогом двух вариантов предлагаемого изобретения является способ взятия мазков-отпечатков с поверхности роговицы и конъюнктивы, который включает использование мембранного ацетат-целлюлозного фильтра Milipore (MCE Corp, Bedford, MA, USA) диаметром 13 мм, предварительно разделенным на две половины в форме буквы 'D'. Для ориентировки на кончике бумаги, который нужно приложить к носовой стороне, выполняется треугольная насечка. В глаз закапывается одна капля местного анестетика, излишки слезной жидкости и лекарства удаляются. Бумагу накладывают на бульбарную часть конъюнктивы и/или роговицу и/или на то и другое вместе, охватывая лимб. Экспозиция составляет примерно 5-10 секунд, поле чего бумагу убирают пинцетом и фиксируют в растворе нейтрального формалина. В последующем используются простые методы окрашивания ядер и муцина БК: гематоксилин-эозин и периодическая кислота Шиффа (ШИК реакция) [Singh R., Joseph A., Umapathy Т. et al. Impression cytology of the ocular surface // Br. J. Ophthalmol. - 2005. - Vol. 89. - P. 1655-1659].

Однако данный способ имеет ряд недостатков. Во-первых, предложенная модель используемого фильтра является довольно ломкой, извлечение диска из упаковки или с поверхности роговицы часто сопровождается его повреждением, и, как следствие, выбраковкой образца. Также данные диски находятся в упаковке в большом количестве, которые при вскрытии теряют свою стерильность. При этом, ввиду повышенной гигроскопичности, диски впитывают в себя излишние частицы пыли в воздухе, тем самым формируя множественные артефакты при исследовании образцов. Во - вторых, взятие цитологии эпителия с бульбарной конъюнктивы только в верхней и нижней частях и/или только с назальной и темпоральной половины не захватывают изучение всей анатомической области. Также в данном способе отсутствует методика взятия цитологии с конъюнктивы вековой части, являющейся местом наибольшего скопления БК. В-третьих, предварительное разделение диска на две половины в форме буквы 'D' и его аппликация к поверхности роговицы также не обеспечивают захват и изучение всей площади пораженного эпителия роговицы.

Задачей изобретения является создание двух вариантов способа забора мазка-отпечатка с бульбарной и вековой части конъюнктивы и роговицы у пациентов для верификации диагноза ССГ и СЛН, обеспечивающих получение информации о распределении плотности БК в исследуемом образце в симметричных зонах слизистой оболочки глаза, а также экспрессии специфических К с поверхности роговицы.

Техническим результатом обоих вариантов при использовании предлагаемого изобретения является стерильность каждого фильтра в индивидуальной упаковке и, как следствие, отсутствие артефактов при выполнении исследования образцов, а также изучение распределения плотности БК и экспрессии специфических К по всей поверхности конъюнктивы и роговицы.

Технический результат по первому варианту достигается тем, что в конъюнктивальную полость закапывают по одной капле глазного антисептика и местного анестетика с последующим наложением на веки блефаростата. Далее с помощью микрохирургических ножниц разделяют два фильтра «JET BIOFIL» MCE НЕЙЛОН PVDF PES PTFE CA SFCA PES Express диаметром 13 мм круглой формы и размером пор 0,45 мкм, одна сторона которого - гладкая, а другая - шероховатая, на две половины, получая четыре полукруга. Далее маркируют гладкую сторону каждого полукруга отдельным обозначением: N, Т, S, I. Затем соответственно маркировке, обратной, шероховатой стороной каждого полукруга прикладывают их к бульбарной конъюнктиве, обращая прямолинейный край полукруга к роговице, отступив от нее 2 мм, следующим образом: N - назальная сторона (по направлению к носу), Т - темпоральная сторона (по направлению к виску), S - верхняя сторона (по направлению к надбровной дуге), I - нижняя сторона (по направлению к подглазничному краю). Третий фильтр также разделяют на две части и, не маркируя, прикладывают к наружной и внутренней частям вековой конъюнктивы, предварительно вывернув нижнее веко наружу, после контакта каждого фильтра в течение 3-5 секунд их удаляют с поверхности глаза, фиксируют в 96 процентом растворе этанола и направляют на цитологический анализ для получения распределения плотности бокаловидных клеток.

Технический результат по второму варианту достигается тем, что в конъюнктивальную полость закапывают по одной капле глазного антисептика и местного анестетика с последующим наложением на веки блефаростата. При заборе клеток с поверхности роговицы используется одноразовый стерильный фильтр «JET BIOFIL» MCE НЕЙЛОН PVDF PES PTFE CA SFCA PES Express, гладкую сторону которого маркируют обозначениями: одна линия, соответствующая назальной стороне, и две линии, соответствующие темпоральной стороне. Затем соответственно маркировке, обратной, шероховатой стороной фильтр прикладывают к поверхности роговицы. После контакта фильтра в течение 3-5 секунд его удаляют с поверхности глаза, фиксируют в 96 процентом растворе этанола и направляют на ИЦХА для выявления экспрессии специфических маркеров - кератинов.

Таким образом, предложенные варианты способа забора мазка-отпечатка с бульбарной и вековой частей конъюнктивы или роговицы у пациентов рефракционного профиля и с СЛН позволяют получить мазок-отпечаток по всей анатомической области, что при последующем цитологическом и ИЦХ анализе покажет распределение плотности БК и экспрессии специфических К. Это в свою очередь, служит достоверной оценкой состояния водно-муцинового слоя СП и оценкой состояния эпителия роговицы и является диагностическими критериями в верификации диагноза ССГ и СЛН.

Пример 1. Пациент А., 25 лет, диагноз миопия слабой степени стационарная на оба глаза, планирует проведение кераторефракционной хирургии. Пациент А. иногда отмечает ощущение сухости и зрительного дискомфорта, увлажняющие глазные капли не использует. Пациенту А. проведен забор мазка - отпечатка с бульбарной и вековой конъюнктивы по первому варианту предложенного способа с последующим проведением цитологического анализа. Результаты цитологического исследования показали уменьшение плотности БК по всем четырем сторонам бульбарной конъюнктивы, и конъюнктивы вековой части, что привело к дисфункции водно-муцинового слоя СП и к ССГ, что требует консервативного лечения до проведения кераторефракционной хирургии.

Пример 2. Пациент Р., 26 лет, диагноз миопия слабой степени стационарная на оба глаза, планирует проведение кераторефракционной хирургии. Пациент Р. иногда отмечает ощущение сухости и зрительного дискомфорта, увлажняющие глазные капли не использует .Пациенту Р. проведен забор мазка - отпечатка с бульбарной и вековой части конъюнктивы по первому варианту предложенного способа с последующим проведением цитологического анализа. Результаты цитологического исследования показали уменьшение плотности БК по двум сторонам бульбарной конъюнктивы, и конъюнктивы вековой части, что привело к дисфункции водно-муцинового слоя слезной пленки и к ССГ, что требует консервативного лечения до проведения кераторефракционной хирургии.

Пример 3. Пациент П., 27 лет, диагноз миопия средней степени стационарная на оба глаза, планирует проведение кераторефракционной хирургии. Пациент П. активных жалоб не предъявляет, увлажняющие глазные капли не использует. Пациенту П. проведен забор мазка-отпечатка с бульбарной и вековой частей конъюнктивы по первому варианту предложенного способа с последующим проведением цитологического анализа. Результаты цитологического исследования показали сохранение плотности БК конъюнктивы во всех изучаемых участках, что характеризует функциональность водно-муцинового слоя слезной пленки и отсутствие ССГ у пациента П., планирующего проведение кераторефракционной хирургии.

Пример 4. Пациент К., 38 лет, диагноз васкуляризованное бельмо роговицы, состояние после ожога. СЛН под вопросом. Для дальнейшей тактики хирургического лечения выполнен забор мазка-отпечатка с поверхности роговицы по второму варианту предложенного способа с последующим проведением ИЦХА. Результаты исследования показали положительную экспрессию конъюнктивального К на всей поверхности образца, что требует восстановление эпителиального слоя роговицы по технологии лимбальной послойной кератопластики.

Пример 5. Пациент Т., 56 лет, диагноз васкуляризованное бельмо роговицы, состояние после перенесенного кератита (в стадии ремиссии). СЛН под вопросом. Для дальнейшей тактики хирургического лечения выполнен забор мазка-отпечатка с поверхности роговицы по второму варианту предложенного способа с последующим проведением ИЦХА. Результаты исследования показали положительную экспрессию роговичного К на всей поверхности образца, полное отсутствие конъюнктивальных маркеров, что требует проведение сквозной кератопластики роговицы.

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и предназначено для забора мазка-отпечатка с бульбарной и вековой части конъюнктивы у пациентов рефракционного профиля с последующим определением плотности бокаловидных клеток (БК) в изучаемом образце при проведении цитологического исследования, что является диагностическим критерием в определении функциональности водно-муцинового компонента слезной пленки (СП) при синдроме сухого глаза (ССГ). Техническим результатом способа является стерильность каждого фильтра в индивидуальной упаковке и, как следствие, отсутствие артефактов при выполнении исследования образцов, а также изучение распределения плотности БК по всей поверхности конъюнктивы и роговицы. Технический результат достигается тем, что в способе забора мазков-отпечатков с поверхности глаза, согласно изобретению, берут три одноразовых стерильных фильтра «JET BIOFIL» MCE НЕЙЛОН PVDF PES PTFE CA SFCA PES Express, два из которых разделяют на две половины, получая четыре полукруга, маркируют гладкую сторону каждого полукруга отдельным обозначением: N, Т, S, I; прикладывают обратной, шероховатой стороной каждого полукруга к бульбарной части конъюнктивы, обращая прямолинейный край полукруга к роговице, отступив от нее 2 мм, следующим образом: N - назальная сторона, Т - темпоральная сторона, S - верхняя сторона, I - нижняя сторона; третий фильтр также разделяют на две половины и прикладывают шероховатой стороной соответственно к наружной и внутренней частям вековой конъюнктивы, предварительно вывернув нижнее веко наружу; после контакта каждого фильтра в течение 3-5 секунд их удаляют с поверхности глаза, фиксируют в 96-процентом растворе этанола и направляют на цитологический анализ для получения распределения плотности бокаловидных клеток.

Способ забора мазков-отпечатков с поверхности глаза, отличающийся тем, что берут три одноразовых стерильных фильтра «JET BIOFIL» MCE НЕЙЛОН PVDF PES PTFE CA SFCA PES Express, два из которых разделяют на две половины, получая четыре полукруга, маркируют гладкую сторону каждого полукруга отдельным обозначением: N, Т, S, I; прикладывают обратной, шероховатой стороной каждого полукруга к бульбарной части конъюнктивы, обращая прямолинейный край полукруга к роговице, отступив от нее 2 мм, следующим образом: N - назальная сторона, Т - темпоральная сторона, S - верхняя сторона, I - нижняя сторона; третий фильтр также разделяют на две половины и прикладывают шероховатой стороной соответственно к наружной и внутренней частям вековой конъюнктивы, предварительно вывернув нижнее веко наружу; после контакта каждого фильтра в течение 3-5 секунд их удаляют с поверхности глаза, фиксируют в 96-процентом растворе этанола и направляют на цитологический анализ для получения распределения плотности бокаловидных клеток.