ПРИМЕНЕНИЕ LACTOBACILLUS ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2011 года по МПК A61K35/74 A61P37/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного штамма пробиотических бактерий, выбранных из Lactobacillus, для производства фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики аутоиммунного заболевания.

Уровень техники

Пробиотические бактерии представляют собой живые микроорганизмы, которые при применении в адекватных количествах оказывают полезное воздействие на реципиента. Наиболее часто используемыми бактериями в пробиотических продуктах являются Lactobacilli и bifidobacteria. Эти бактерии в целом безопасны, как и пробиотики на основе этих организмов. Отсутствие патогенности распространяется на все возрастные группы и для индивидуумов с ослабленным иммунитетом. При приеме различных пробиотических бактерий были показаны благоприятные клинические воздействия при различных физиологических или патологических случаях. Самые ярко выраженные побочные эффекты выражались в диарее, вызванной терапией антибиотиками или ротавирусной инфекцией. Также есть исследования, в которых были показаны положительные клинические эффекты при воспалительных заболеваниях кишечника, атопическом дерматите и гиперхолестеринемии после приема пробиотических бактерий. Механизм действия пробиотических бактерий в отношении этих клинических улучшений не ясен. Исследования in vitro в отношении человека, а также in vivo и in vitro в отношении животных показали, что различные виды lactobacilli воздействуют по-разному на врожденную и приобретенную иммунную систему.

В основном, клинические исследования показали стимуляцию врожденной клеточной иммунной системы и усиление гуморальных иммунных реакций на спонтанные инфекции и системную или пероральную иммунизацию. Что касается влияния на врожденную иммунную систему, то были сообщения об усиленной фагоцитарной активности полиморфнонуклеарных клеток (PMN) и усиление противоопухолевой активности NK-клеток (натуральных киллеров). Сведения о клинических исследованиях, в которых продемонстрированы воздействия на специфическую клеточную иммунную систему после приема пробиотических бактерий, отсутствуют.

В настоящей заявке было исследовано, помимо прочего, влияние на врожденную и приобретенную иммунную систему после ежедневного приема lactobacilli или грамотрицательных бактерий P. lundensis. Интересно, что наблюдали активацию специфической клеточной иммунной системы у субъектов, получающих L. plantarum, и такие признаки у субъектов, получающих L. paracasei. Кроме того, у субъектов, получающих различные виды lactobacilli, наблюдали усиливающие иммунитет воздействия на врожденную иммунную систему, такие как увеличение популяции NKT-клеток и усиление фагоцитарной активности. При этом введение грамотрицательных бактерий P. lundensis не оказало влияния на различные иммунные параметры, измеренные в этом исследовании.

Усиливающаяся проблема западного мира - это аутоиммунные и связанные с ними заболевания, в которых иммунная система человека начинает разрушать сама себя по ошибке и у индивидуума может развиться серьезная болезнь. Аутоиммунные заболевания могут воздействовать на соединительные ткани и различные другие части тела, такие как специфические органы, такие как кожа, нервы, мозг, легкие, почки и суставы. Примером аутоиммунного заболевания в нервах и мозге является рассеянный склероз, а на коже - псориаз. Аутоиммунное заболевание может принимать множество различных форм и существует много способов лечения для них. Лечение зависит от типа заболевания и поврежденного органа.

Существует потребность в данной области для облегчения и лечения симптомов, связанных с аутоиммунными заболеваниями, а также для обеспечения профилактики до развития заболевания. Эти проблемы представляют предмет настоящего изобретения, которое будет далее раскрыто.

Краткое описание изобретения

Объектом настоящего изобретения является применение по меньшей мере одного штамма пробиотических бактерий, выбранных из Lactobacillus, для производства фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики аутоиммунных заболеваний.

Другим объектом настоящего изобретения является способ лечения аутоиммунного заболевания, где по меньшей мере один штамм пробиотических бактерий, выбранных из Lactobacillus, вводят индивидууму.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 показано количество добровольцев, сообщающих о любых незначительных неблагоприятных желудочно-кишечных воздействиях во время исследования.

На фигуре 2 показано начальное количество (день 0) различных лимфоцитов на мл крови (среднее значение±(SEM (стандартная ошибка среднего))).

На фигуре 3 показано начальное (день 0) процентное содержание или GMFI (среднее значение±(SEM)) лимфоцитов, положительных к различным активаторам клеток и маркерам памяти.

Фигура 4. Субъектов в произвольном порядке разделили на девять различных исследуемых групп. Исследование начинали с двухнедельного периода вымывания. После этого проводили активный период исследования. В течение этого периода субъекты потребляли одну дозу исследуемого продукта в сутки в течение 14 (группы L. plantarum Heal 19, L. fermentum, L. paracasei, L. gasseri, L. rhamnosus, P. Lundensis) или 35 дней (группы L. plantarum 299v и плацебо). Каждая доза содержала 10¹⁰ колониеобразующих единиц (КОЕ) (группы lactobacilli) или 10⁹ КОЕ бактерии (группа P. lundensis).

Фигура 5. Процентное содержание лимфоцитов, экспрессирующих фенотипы активации CD8CD25, CD8HLA-DR, CD4CD25 и CD4HLA-DR, анализировали проточной цитометрией. Показано среднее для группы (±SEM) по отдельным соотношениям день 14/день 0 и день 35/день 0 (только для групп L. plantarum и плацебо).

Фигура 6. Процентное содержание лимфоцитов, экспрессирующих фенотипы памяти CD8CD45RO и CD4CD45RO, анализировали проточной цитометрией. Показано среднее для группы (±SEM) по отдельным соотношениям день 14/день 0 и день 35/день 0 (только для групп L. plantarum и плацебо).

Фигура 7. Процентное содержание положительных лимфоцитов по маркерам NKT- клеток (CD56CD16CD3), анализировали проточной цитометрией. Расчеты для группы проводили по отдельным соотношениям (день 14/день 0).

Фигура 8. Фагоцитарная активность нейтрофилов анализировали, инкубируя клетки цельной крови с FITC-меченными E. coli или S. аureus. Отношение между средними значениями флуоресценции, полученными в 14 день и 0 день, определяли индивидуально, и групповые вычисления показаны на этой фигуре.

На фигуре 9 показана профилактика развития EAE, вес тела и клинические симптомы (эксперимент 3).

На фигуре 10 показано лечение хронического воспаления при лечении EAE, начатое в день после начала болезни (эксперимент 3).

На фигурах 11 и 12 показана задержка начала EAE при потреблении L. paracasei 8700:2 или L. plantarum HEAL 9 по сравнению с контролем.

На фигуре 13 показано подавление EAE при потреблении смеси пробиотических штаммов L. paracasei 8700:2, L. plantarum HEAL 9 и L. plantarum HEAL 19. Это дополнительно показывает, что эффект подавления был прерван при устранении CD4+ Т-клеток.

На фигуре 14 показано подавление EAE при потреблении смеси L. paracasei 8700:2, L. plantarum HEAL 9 и L. plantarum HEAL 19 по сравнению с контролем, метотрексатом и L. Delbrueckii.

На фигуре 15 показано отношение лимфоцитов, эксперессирующих фенотипы активации CD4CD25 в эксперименте 2.

На фигуре 16 показано отношение лимфоцитов, эксперессирующих фенотипы активации CD4⁺CD25⁺⁺ в эксперименте 2.

На фигуре 17 показано отношение лимфоцитов, эксперессирующих фенотипы активации CD8⁺HLADR⁺ в эксперименте 2.

На фигуре 18 показано отношение лимфоцитов, эксперессирующих фенотипы активации CD8⁺CD25⁺ в эксперименте 2.

На фигуре 19 показано отношение лимфоцитов, эксперессирующих фенотипы активации CD4CD45RO в эксперименте 2.

Подробное описание изобретения

В варианте выполнения изобретения по меньшей мере один штамм пробиотических бактерий, выбранных из Lactobacillus, применятся для производства фармацевтической композиции для лечения аутоиммунного заболевания, без ограничения выбранного из орган-специфической аутоиммунной реакции, такой как рассеянный склероз (MS), аллергия, псориаз, ревматоидный артрит, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, сахарный диабет типа 1, воспалительные заболевания кишечника или системная волчанка.

Любые другие аутоиммунные заболевания, конкретно здесь не указанные, на которые оказывают влияние пробиотические бактерии, также включены в объем притязаний изобретения.

В настоящем описании термин "лечение и/или предотвращение" включает профилактическое введение индивидууму, то есть введение пробиотических бактерий было начато до развития заболевания для предотвращения заболевания, а также лечение уже развитого у индивидуума заболевания. В последнем случае ожидается, например, облегчение симптомов или улучшение общего состояния пациента или более быстрое выздоровления пациента от заболевания. Таким образом, индивидуум может представлять собой человека с риском развития аутоиммунного заболевания или пациентом с заболеванием.

Lactobacillus, используемые по изобретению, могут быть без ограничения выбраны из группы, состоящей из Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus paracasei и Lactobacillus gasseri.

Естественно, другие пробиотические штаммы бактерий, отличные от конкретно раскрытых здесь, могут быть использованы по настоящему изобретению и включены в объем притязаний изобретения в той мере, пока они обеспечивают требуемое воздействие, то есть оказывают профилактическое действие на аутоиммунное заболевание или облегчают симптомы аутоиммунного заболевания.

Lactobacillus plantarum, используемые по изобретению, могут быть без ограничения выбраны из группы, состоящей из Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313 и Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316.

Lactobacillus paracasei, используемые по изобретению, могут быть без ограничения выбраны из группы, состоящей из Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434 и Lactobacillus paracasei 02A, DSM13432.

Lactobacillus gasseri, используемые по изобретению, могут быть без ограничения выбраны из группы, состоящей из Lactobacillus gasseri VPG44, DSM 16737.

В другом варианте выполнения изобретения по меньшей мере два пробиотических штамма применяют для лечения и/или профилактики указанного аутоиммунного заболевания. По меньшей мере два штамма выбраны из Lactobacillus, предпочтительно из Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus paracasei и Lactobacillus gasseri.

В варианте выполнения изобретения, где для лечения применяют по меньшей мере два пробиотических штамма, указанные по меньшей мере два штамма могут вводиться последовательно или одновременно. Таким образом, штаммы могут быть введены в смеси в одной композиции или они могут быть введены последовательно в разных композициях.

В дополнительном варианте выполнения изобретения указанная фармацевтическая композиция может представлять собой жидкий препарат или твердый препарат, где указанный твердый препарат выбирается из группы, состоящей из таблеток, сосательных таблеток, леденцов, жевательных таблеток, жевательных резинок, капсул, саше, порошков, гранул, частиц с покрытием, таблеток с покрытием, таблеток и капсул с кишечно-растворимым покрытием, рассасываемых полосок или пленок, и указанный жидкий препарат выбирается из группы, состоящей из пероральных растворов, суспензий, эмульсий и сиропов.

В еще одном варианте выполнения изобретения указанная композиция включает носитель, где указанный носитель независимо без ограничения выбран из группы, состоящей из овсяной муки, молочно-кислых ферментированных пищевых продуктов, устойчивого крахмала, диетических волокон, углеводов, белков и гликозилированных белков.

В дополнительном варианте выполнения изобретения указанная фармацевтическая композиция без ограничения выбирается из медицинского пищевого продукта, функционального пищевого продукта, диетической добавки, питательного продукта или пищевого препарата. Таким образом, слово "фармацевтическая композиция", как здесь используется, не обязательно обозначает фармацевтическую композицию в ее обычном понимании, таком как лекарственное средство, но также может представлять собой продукт в области медицинских пищевых продуктов, функциональных пищевых продуктов, диетических добавок, питательных продуктов и пищевых продуктов. В случае, если она представляет собой пищевой продукт, он может быть без ограничения выбран из напитков, йогуртов, соков, мороженого, хлеба, бисквитов, продуктов из дробленого зерна, батончиков для здорового образа жизни и пастообразных продуктов.

Таким образом, применение композиции по изобретению может быть очень полезно для профилактики, то есть перед началом развития аутоиммунного заболевания. Поскольку применяемая фармацевтическая композиция не обязательно представляет собой лекарственное средство в его обычном понимании, но может также представлять собой диетическую добавку или функциональный пищевой продукт, что является очень удобным для нормального здорового индивидуума для профилактического потребления композиции по изобретению.

В варианте выполнения изобретения каждый указанный(ы) штамм(ы) присутствует(ют) в фармацевтической композиции в количестве от 1×10⁶ до приблизительно 1×10¹⁴ КОЕ, предпочтительно от приблизительно 1×10⁸ до приблизительно 1×10¹², и более предпочтительно от приблизительно 1×10⁹ до приблизительно 1×10¹¹.

Фармацевтическая композиция по изобретению, применяемая по изобретению или полученная по изобретению, может также включать другие вещества, такие как инертный носитель или фармацевтические приемлемые вспомогательные компоненты, носители, консерванты и т.д., которые известны специалистам в данной области.

Примеры

Пример 1

Субъекты и параметры исследований

Для слепого плацебо-контролируемого исследования были отобраны пятьдесят семь практически здоровых добровольцев в возрасте 18-55 лет (средний возраст 26 лет). Субъектов в произвольном порядке разделили на восемь групп, получавших одно из следующих грамположительных бактерий, L. plantarum 299v (n=7), L. Plantarum Heal 19 (n=7), L. fermentum 35D (n=7), L. paracasei 8700:2 (n=7), L. gasseri VPG44 (n=7), L. rhamnosus 271 (n=7), или грамотрицательных бактерий, P. lundensis (n=7) или плацебо (n=10). Доза бактерий составляла 10¹⁰ бактерий/день для lactobacilli и 10⁹ бактерий/день для P. lundensis. Контрольной группе давали сухое обезжиренное молоко (1г). В зависимости от группы, продолжительность исследования составляла 6 или 9 недель, состоящих из двухнедельного период вымывания, 2 или 5 недель активного периода исследования и 2 недель периода последующего наблюдения (фиг. 4). Каждому субъекту был выдан список продуктов, содержащих пробиотические продукты, которые не должны потребляться во время всего периода исследования. Образцы периферической крови отбирали у субъектов венопункцией два или три раза на 0 день, 14 день и 35 день. Дневник, в котором каждый субъект отмечал неблагоприятные эффекты, состояние здоровья и подтверждал прием исследуемого продукта, хранили в течение исследования.

Проточная цитометрия

Фенотипический анализ лимфоцитов в цельной крови выполняли проточной цитометрией. Следующие моноклональные антитела для человека были использованы в качестве поверхностных маркеров для различных клеточных популяций: CD3 FITC (SK7), CD4 APC (SK3), CD8 PerCP (SKl), CD19 PerCP (SJ25C1), CD56 PE (MY31), CD16 PE (B73.1), и CD5 FITC (L17F12). Следующие моноклональные антитела для человека были использованы для определения различной активации и маркеров: CD25 FITC (2A3), PE HLA-DR (L243), CD45RO PE (UCHL-I), CD38 PE (HB7), CD27 PE (L128), и CD11b PE (D12). Все антитела были закуплены у Becton-Dickinson (Erembodegum, Belgium). Цельную кровь (100 мкл) инкубировали с антителами (10 мкл/антитело) в течение 30 минут при 4°C в темноте. Затем добавляли 2 мл раствора для лизиса FACS (Becton-Dickinson) и инкубировали в течение 15 минут при 20°C в темноте. Клетки промывали добавлением 3 мл FACSFlow и центрифугировали при 300 x g в течение 5 мин. Промытые клетки ресуспендировали в 200 мкл FACSFlow и анализировали на FacsCalibur (Becton-Dickinson) с программным обеспечением CellQuest.

Исследование фагоцитоза

Фагоцитарную активность гранулоцитов и моноцитов количественно оценивали с использованием PHAGOTEST® (Orpegen Pharma, Heidelberg, Germany) в соответствии с инструкцией изготовителя с некоторыми изменениями. Кратко, 20×10⁶ E. coli меченые FITC или S. Aureus, меченные FITC, добавляли к предварительно охлажденной цельной крови (100 мкл). Клетки крови и бактерии инкубировали при 37°C для анализа 10 FacsCalibur с программным обеспечением CellQuest.

Расчеты

Изменения различных иммунных параметров индивидуумов определяли расчетом отношения между отдельными значениями, полученными в 14 день и 0 день, или значениями, полученными в 35 день и 0 день. Эти отношения использовали для всех групп расчетов и статистических вычислений.

Статистические вычисления

Все статистические исследования были выполнены, используя Stat-view. Критерий U Манна-Уитна использовался при сравнивании различных групп.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Клинические наблюдения

Пятьдесят четыре из пятидесяти семи добровольцев прошли полное исследование. Два индивидуума были исключены вследствие инфекции и терапии антибиотиками (один в группе плацебо и один в группе, получающей P. lundensis). Один индивидуум был исключен на 16 день вследствие беременности (группа плацебо). Во время приема исследуемых продуктов сообщали только об умеренных неблагоприятных желудочно-кишечных побочных эффектах (фиг. 1).

Активация Т-клеткок при приеме lactobacilli

Наблюдали значительные единичные отклонения значений при исходных данных (день 0) в отношении маркеров активации на CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток. Исходные данные о процентном содержании клеток, экспрессирующих различные клеточные поверхностные маркеры, показаны на фиг. 2. Между различными группами в этой точке времени не было никакого значительного отличия. Поскольку наблюдали очень большие единичные отклонения в пределах значения, то проводили сравнение соотношения значений в 14 день и 35 день к значениям в день 0 для каждого индивидуума. Все вычисления и сравнения выполняли при этих значениях соотношений (день 14/день 0 и день 35/день 0). После 14 дней приема исследуемого продукта, содержащего L. plantarum 299v, наблюдали приблизительно двукратное увеличение экспрессии маркера активации CD25 на CD8⁺ Т-клетках (p=0,01) (фиг. 5). Также наблюдали сильный, хотя незначительный (p=0,12) показатель повышенной регуляции HLA-DR на CD8⁺ клетках после приема L. plantarum 299v. Кроме того, также наблюдали тенденцию к активации CD4⁺ Т-клеток после приема L. Plantarum 299v. Прием других видов lactobacilli, включенных в это исследование, а также грамотрицательных бактерий P. lundensis не активировал ни CD8⁺, ни CD4⁺ Т-клетки. Однако наблюдали тенденцию увеличения экспрессии HLA-DR на CD4⁺ Т-клетках (р=0,18) при приеме L. paracasei.

Прием lactobacilli вызывает фенотип памяти CD4+ Т-клеток

Средние геометрические значения флуоресцентной интенсивности (GMFI) экспрессии CD45RO на CD4+ и CD8+ Т-клетках сравнивали между группами, получающими различные исследуемые продукты. Как отмечалось выше, для сравнения использовали расчеты для групп, основанные на отдельных соотношениях значений (день 14/день 0 и день 35/день 0). После 35 дней приема исследуемого продукта, содержащего L. Plantarum 299v, CD45RO GMFI на CD4+ Т-клетках значительно увеличились (p=0,03). Также наблюдали тенденцию к увеличению экспрессии CD45RO на CD8+ Т-клетках после приема L. plantarum (фиг. 6). Кроме того, прием L. paracasei, как представляется, оказывает положительные эффект на усиление регуляции CD45RO на CD8+ Т-клетках (p=0,10) (фиг. 6).

Влияние на различные группы клеток после приема исследуемого продукта

Прием L. paracasei вызвал увеличение процентного содержания лимфоцитов, идентифицируемых как NKT-клетки (р=0,06) (фиг.7). Относительное увеличение/уменьшение по сравнению с 0 днем не могли быть обнаружены в отношении других групп клеток, таких как CD4+ Т-клетки, CD8+ Т-клетки, B-клетки, B-1-клетки (CD19+CD5+), NK-клетки, гранулоциты и моноциты.

Фагоцитарная активность

Гранулоциты и моноциты идентифицировали по диаграмме FSC-SSC. Тестировали свойства этих клеток к фагоцитозу FITC-меченных грамположительных или грамотрицательных бактерий. Как показано на фиг. 8, гранулоциты от добровольцев, получавших L. plantarum 299v (p=0,064), L. plantarum Heal 19 (p=0,064), L. fermentum (p=0,064) или L.paracasei (p=0,05), были более эффективны, чем лейкоциты от добровольцев, получавших плацебо, при фагоцитозе грамотрицательных бактерий E.coli. Однако, не было обнаружено какого-либо отличия между группами при фагоцитозе грамположительных бактерий S. aureus. Не были обнаружены какие-либо различия фагоцитарной активности моноцитов (данные не показаны).

Обсуждение

Основная задача иммунной системы заключается в быстрой и резкой реакции на микроорганизмы, таким образом предотвращая и излечивая инфекцию. При уничтожении микроорганизмов используются мощные механизмы, которые также оказывают вред нашим собственным тканям. Поэтому необходимо отсутствие реакции на наши собственные ткани и на безвредные вещества, присутствующие в среде. Поэтому иммунная система развивается и обеспечивает толерантность как к компонентам нашего собственного тела, так и к пищевым продуктам и белками, попадающими при дыхании. Если она дает сбой, то может возникнуть множество заболеваний. Способ достижения специфической иммунной переносимости является основной задачей иммунной системы.

Центральная роль во всех иммунных реакциях принадлежит Т-клеткам-хелперам. Если Т-клетка-хелпер активируется ее специфическим антигеном, она становится активируемой, делится, созревает и вырабатывает ряд цитокинов, которые управляют действием других типов клеток в иммунной системе, таких как цитотоксические Т-клетки и B-клетки. Активация Т-клеток-хелперов необходима для получения большой части типов иммунных реакций, включая выработку антител. Наоборот, при отсутствии активации Т-клеток-хелперов отсутствует большая часть типов иммунных реакций.

Существует несколько механизмов, обеспечивающих активацию Т-клеток-хелперов и поддержание толерантности. Один из механизмов заключается в устранении в тимусе Т-клеток, распознающих и реагирующих с тканями. Однако, это устранение не является полным и, кроме того, мы должны также развивать специфическую иммунную толерантность к экзогенным антигенам. В противном случае мы резко реагировали бы на любой тип веществ, которые попадают внутрь, что привело бы к общему воспалению и потратило впустую иммунные ресурсы.

Регуляторная Т-клетка представляет собой тот тип клетки, который является центральным для поддержания толерантности. Этот тип клетки может быть распознан некоторыми маркерами, такими как поверхностная экспрессия CD4 и CD25, захват внутриклеточного CTLA-4 и транскрипция ядерного белка Foxp3. Регуляторные Т-клетки способны предотвращать активацию других Т-клеток при встрече с безопасными веществами и, следовательно, предотвращать любые типы нежелательных иммунных реакций.

В настоящем контексте символ "+" в сочетании каким-либо маркером, таком как CD4+ и CD25+, означает, что маркер экспрессируется на Т-клетке. Например CD4+CD25+ Т-клетки представляет собой Т-клетки, которые экспрессируют как CD4 маркер, так и CD25 маркер на поверхности. Однако, это указывает, что маркер присутствует, но не дает сведений о количестве маркера, который экспрессируется. В настоящем описании символ "++" в сочетании с маркером, таком как CD4++ или CD25++, означает, что в данном случае экспрессируется большое количество маркера. Регуляторные Т-клетки представляю собой клетки с большим количеством CD25 на поверхности, то есть CD4+CD25++ клетки. С другой стороны, CD4+CD25+ Т-клетки представляют собой только активируемые Т-клетки. Иногда символы "+" и "++" не используются, например, только CD4CD25, это означает что клетки активируемые, такие как CD4+CD25+ клетки. Таким образом, CD4CD25 то же самое, что CD4+CD25+. При упоминании о регуляторных Т-клетках они всегда написаны как CD4+CD25++ клетки.

Это слепое плацебо-контролируемое исследование уникально в том, что оно представляет собой первое исследование, в котором сравнивается влияние приема различных грамположительных lactobacilli или грамотрицательных бактерий P. lundensis на ряд иммунных параметров. Интересно, что прием P. lundensis не оказал влияния ни на один из измеренных параметров. Напротив, прием lactobacilli оказал влияние на различные компоненты как специфической, так и врожденной иммунной системы. Новые сведения, полученные при этом исследовании, заключались в том, что прием L. plantarum оказал явный положительный эффект на активацию и индукцию клеток памяти в группах Т-клеток. Наблюдали значительное усиление регуляции IL-2 рецептора α цепи (CD25) и сильную тенденцию к усилению регуляции HLA-DR на цитотоксических Т-клетках. Тенденцию к усилению регуляции этих маркеров активации также наблюдали в отношении Т-хелперов после приема L. plantarum. Экспрессия маркеров активации показывает, что Т-клетки начинают пролиферировать в ответ на антигенспецифические или неспецифические воздействия и что эти клетки быстрее проявляют их эффекторные функции по сравнению с Т-клетками в покое. Механизмы против L. plantarum вызвали активацию Т-клеток, могут осуществляться посредством антигенпрезентирующих клеток, которые активируются toll-подобными рецепторами, связывающимися с микробными соединениями. Активация антигенпрезентирующих клеток делает их более эффективными в представлении антигена к Т-клеткам. Кроме того, как хелперные, так и цитотоксические Т-клетки показали различные экспрессии toll-подобных рецепторов, которые вероятно делают эти клетки чувствительными к неспецифической активации микробными компонентами и продуктами.

По аналогии с Т-хелперными клетками, экспрессия CD45RO также, кажется, метит популяции клеток памяти среди цитотоксических Т-клеток. Было обнаружено значительное увеличение экспрессии этого клеточного маркера памяти на Т-хелперах, и тенденция к усилению регуляции на цитотоксических Т-клетках во время приема L. plantarum в течение 35 дней. Кроме того, прием L. paracasei также показал тенденцию к усилению регуляции CD45RO на цитотоксических Т-клетках. Что касается наивных Т-клеток, то CD45RO+ Т-клетки могут секретировать широкий спектр цитокинов. Кроме того, CD45RO+ Т-клетки могут пролиферировать и продуцировать IL-2, при стимуляции комплекса CD3-TCR в близких к оптимальным условиях, тогда как наивные Т-клетки требуют сильной стимуляции CD3-TCR для выполнения этих функции. Формирование Т-клеток памяти важно для индукции эффективного иммунного ответа после инфекции и прививки.

На врожденную клеточную иммунную систему также воздействовали введением пробиотических бактерий. Было продемонстрировано, что популяция натуральных киллерных T (NKT) клеток увеличилась после приема L. paracasei. NKT-клетки составляют субпопуляцию лимфоцитов, которая совместно экспрессирует маркер CD56 NK-клеткок и рецепторный комплекс маркер CD3-Т-клетки. Исследования как на людях, так и на мышах показали, что NKT-клетки играют центральную роль в регуляции аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз, диабет типа I и системная волчанка. NKT-клетки также проявляют эффекторные функции против клеток, инфицированных опухолью и вирусами. Таким образом, NKT-клетки являются плейотропными по своим свойствам. Другие клинические исследования, оценивающие иммунологические эффекты пробиотических бактерий, показали, что прием L. rhamnosus HN001 и Bifidobacterium lactis HN019 усиливает противоопухолевую активность NK-клеток (включая NKT) K562 клеток. В этом исследовании также было подтверждено наблюдение, что фагоцитарная активность полиморфнонуклеарных клеток увеличивается после приема различных lactobacilli. В результате наблюдаемых воздействий на различные иммунные параметры в настоящем исследовании можно предположить, что совместная активация цитотоксических Т-клеток и увеличение NKT-клеток направлены на усиление иммунной защиты против вирусных инфекций и/или опухолей. Полученные in vitro результаты о том, что lactobacilli стимулирует одноядерные клетки секретировать IL-12 и IL-18, поддерживают теорию, что прием этих бактерий стимулирует активность, опосредованную клетками.

В соответствии с настоящим изобретением были сделаны выводы, что прием L. plantarum и L. paracasei оказывает сильный эффект на специфическую и врожденную клеточную иммунную систему.

Пример 2

Цель этого примера заключалась в том, чтобы исследовать воздействие на иммунную систему, при введении одинаковых видов lactobacilli в течение более длительного периода времени, по сравнению с последовательным введением нескольких видов lactobacilli (различных видов).

Добровольцам давали порошок с высушенными замораживанием бактериями в течение 14 или 35 дней. В качестве грамположительных бактерий использовали пробиотические бактерии Lactobacillus plantarum 299v, отдельно или в комбинации с L. rhamnosus, L. fermentum, L. paracasei и L. gasseri. В качестве грамотрицательных бактерий использовали Psedomonas lundensis.

Были исследованы следующие группы:

1) Lactobacillus plantarum 35 дней

2) L. plantarum 7 дн, L. rhamnosus 7 дн, L. fermentum 7 дн, L. paracasei 7 дн, L. gasseri 7 дн. Всего 35 дней (Последовательно)

3) смесь L. plantarum, L. rhamnosus, L. fermentum, L. paracasei, L. gasseri. Всего 14 дней

4) L. rhamnosus 14 дней

5) L. fermentum 14 дней

6) L. paracasei 14 дней

7) L. gasseri 14 дней

8) Pseudomonas lundensis 14 дней

Контрольная группа 1) Плацебо 35 дней

Контрольная группа 2) Плацебо 14 дней

Пробы крови отбирали на 0, 14 и 35 день. Содержание Т-хелперов (CD4+), экспрессирующих большие количества CD25, определяли в каждой группе поточной цитометрией, как было указано в примере 1.

Результаты

На 14 день наблюдали пограничное состояние увеличения CD4+CD25++ Т-клеток, у индивидуумов, потребляющих последовательно пять различных штаммов lactobacilli.

Обсуждение

Было показано, что Т-клетки-хелперы (CD4+), экспрессирующие c высокой плотностью CD25 молекулы (CD4+CD25++), являются важными для предотвращинея аутоиммунных заболеваний, аллергий и воспалительных заболеваний кишечника. Обнаружено, что количество этих клеток увеличивается после последоватеьно приема различных lactobacilli, что показывает, что прием этих бактерий может быть полезен для индивидуумов с риском развития вышеупомянутых заболеваний.

Пример 3

Животные

Восьминедельные C57BL/6 мыши были куплены у Taconic Europe (Denmark). Животных содержали и кормили в помещении для лабораторных животных на кафедре биологии клетки и организма, Lund University, и все эксперименты выполняли в соответствии с этическим комитетом в Malmö-Lund, Sweden. Мышей кормили в соответствии c нормальной диетой и давали воду в неограниченном количестве, и обеспечили период адаптации к новой среде в течение по меньшей мере одной недели до начала экспериментов. Мышей, использованных в экспериментах EAE, взвешивали, исследовали на предмет наличия клинических симптомов EAE и каждый день в течение эксперимента оценивали по шкале, описанной в разделе клинической оценки. Мышам с оценкой 6 один раз в день вводили 0,5 мл физиологического раствора подкожно, чтобы избежать дегидратации. Пищевой продукт помещали на дне клетки при проявлении симптомов клинического заболевания у какой-либо мыши. Мышей с оценкой 7 усыпили по этическим причинам. Эксперименты были завершены через 24 дня после иммунизации.

Антигены

Энцефалогенный пептид из миелинового олигодендроцита гликопротеида (MOG) использовали для индуцирования EAE (экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит) у мышей. Синтетический пептид, аминокислоты 35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK), был куплен у Schafer-N, Copenhagen, Denmark. Чистота использованного пептида составляла 99%.

Иммунизация

EAE индуцировали у самок C57BL/6 мышей, как было описано ранее. Кратко, каждое животное иммунизировали под анестезией изофлураном в стандартных условиях инъекцией в пах 100 мкл 1:1 эмульсии 200 мкг MOG_35-55 в PBS и CFA, содержащей Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco, Детройт, МИ). Сразу же после этого и спустя 48 часов после иммунизации мышам делали внутрибрюшинную инъекцию 0,1 мл 4 мкг/мл токсина коклюша (Sigma).

Клиническая оценка

Клинические симптомы EAE оценивали по шкале от 0 до 8 следующим образом: 0 - симптомы клинического заболевания отсутствуют; 1 - слабость хвоста; 2 - парализованный хвост; 3 - парез задней конечности и нарушение походки; 4 - паралич одной задней конечности; 5 - полный паралич задних конечностей с парезом задней части тела, мышь активна и перемещается с использованием передних конечностей; 6 - полный паралич задних конечностей с парезом задней части тела и со значительным затруднением подвижности; 7 - квадриплегия, отсутствие подвижности, агония; 8 - смерть.

Бактериальные штаммы и лечение

L. plantarum HEAL 9 и L. paracasei 8700:2 были обеспечены Probi AB (Ideon Ideon, Lund, Sweden). Бактерии собирали центрифугированием, один раз промывали и ресуспендировали в водопроводной воде до конечной концентрации в колбе 2×10⁹ колониеобразующих единиц (КОЕ)/100 мл. В третей колбе готовили смесь L. plantarum HEAL 9 и L. paracasei 8700:2 с конечной концентрацией 2×10⁹ КОЕ/100 мл. Каждый день колбы промывали и готовили носители, включающие бактерии. Эксперименты проводили на десяти мышах в каждой группе лечения. Каждое животное потребляло 4-5 мл носитель/день, включающего приблизительно 10⁸ КОЕ. Контрольные животные получали водопроводную воду.

Результаты

Введение пробиотиков подавляет развитие EAE, индуцированного MOG

Для исследования противовоспалительного эффекта пробиотиков, три группы животных предварительно обрабатывали пробиотиками, L. plantarum HEAL 9, L. paracasei 8700:2 и смесью L. plantarum HEAL 9 и L. paracasei 8700:2, за двенадцать дней и иммунизировали для развития EAE эмульсией CFA и MOG_35-55 в 0 день. Затем животных обрабатывали в течение всего эксперимента (до 24 дня). Четвертая группа животных получила только водопроводную воду в качестве контроля. Как показано на фиг. 10, введение L. plantarum HEAL 9 или L. paracasei 8700:2 успешно предотвратило развитие хронического EAE в течение 10 дней по сравнению с мышами контроля, у которых наблюдали тяжелый EAE, начиная с 11 дня. Мыши, которые получали смесь бактерий, также показали задержку начала развития болезни в течение от пяти дней по сравнению с контролем. У этих мышей наблюдали развитие более тяжелого EAE по сравнению с мышами, которые получали один вид бактерий. В 24 день случаи заболевания животных были значительно снижены, 14% животных, которым вводили один вид бактерий, по сравнению с 91% мышей контроля. Количество случаев у животных, получающих смесь бактерий, составляло 60%. При анализе изменения веса животных в течение эксперимента неожиданно было показано, что введение смеси двух видов бактерий замедляло уменьшение веса, которое обычно наблюдается перед началом заболевания (фиг.9). У животных, которые получали один вид бактерий, наблюдали такое же снижение веса, как и у мышей контроля, несмотря отсутствие каких-либо симптомов паралича.

Профилактика EAE

Животных обрабатывали пробиотиками с целью профилактики за 12 дней до иммунизации и в течение эксперимента.

Каждый день готовили 100 мл свежей питьевой воды, включающей различные бактерии. Приблизительно 1,108 бактерий/мышь/день. Мыши контроля получали только воду.

N_plantarum=7, N_paracasei=7, N_Mix=10, N_Control=11

Результаты показаны на фиг. 9.

Лечение хронического воспаления при EAE

После начала EAE один раз в день перорально вводили пробиотики. Животных обрабатывали индивидуально кормлением с иглы.

Приблизительно 1,108 бактерий/мышь/день. Мыши контроля получали стерильный NaCl 9 мг/мл.

N_plantarum=6, N_paracasei=6, N_Mix=8, N_Control=8

Результаты показаны на фиг.10.

Эксперимент 4

Подавление хронического воспаления центральной нервной системы при пероральном приеме Lactobacillus Paracasei и Lactobacillus Plantarum

Цель этого исследования заключалась в исследовании, могут ли пробиотики воздействовать на хроническое воспаление центральной нервной системы, опосредованное Т-клетками. Авторы предположили, что пероральное введение пробиотиков оказывает противовоспалительный эффект посредством иммунной модуляции патогенных Т-клеток эффекторов.

Материалы и методы

Экспериментальная модель на животном

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE), экспериментальная модель рассеянного склероза на животном, вызывают иммунизацией миелинового олигодендроцитного гликопротеида (MOG) пептида 35-55 в полном адъюванте Фрейнда. Токсин коклюша также вводят при иммунизации для дополнительного усиления воспалительной реакции. Через две недели у животных начинают проявляться клинические симптомы. Симптомы EAE оценивают по восьми категориям: 0 - отсутствие симптомов клинического заболевания; 1 - слабость хвоста; 2 - паралич хвоста; 3 - парез и нарушение походки; 4 - паралич одной конечности; 5 - паралич двух конечностей; 6 - паралич двух конечностей и парез третьей конечности, при этом мышь способна двигаться; 7 - квадриплегия, отсутствие подвижности и агония; 8 - смерть.

Пробиотические бактериальные штаммы

Lactobacillus Paracasei 8700:2, Lactobacillus Paracasei defacti, Lactobacillus Plantarum Heal 9, Lactobacillus Plantarum Heal 19, Lactobacillus Plantarum 299v и Lactobacillus Delbrueckii были обеспечены Probi AB.

Протоколы лечения

Профилактика. 100 мл питьевой воды, включающей 1,10⁹-1,10¹⁰ различных бактерий, готовили каждый день. Каждая мышь выпивает приблизительно 5 мл ≈1,10⁸-1,10⁹ бактерий/мышь/день. Животных обрабатывали за 7-14 дней до иммунизации и в течение всего эксперимента. Мыши контроля получали только воду. В предыдущем эксперименте животных обрабатывали кормлением с иглы через 10 дней после иммунизации, на каждый второй день в течение эксперимента.

Лечение. Через десять дней после начала развития болезни каждое животное получило 1,10⁹ бактерий посредством кормления с иглы каждый второй день в течение эксперимента. Мыши контроля получали солевой раствор.

Метотрексат (MTX). MTX вводили интраперитонеально в конечной концентрации 2,5 мг/кг каждый второй день в течение эксперимента.

Анализ

Различные органы и материалы были выделены от животных для дополнительного исследования; мозг, спинной мозг, селезенка, лимфатические узлы (мезентериальные, ингвинальные), кишечный тракт (области, включающие пейеровы бляшки) и кровь. Некоторые органы обрабатывали изопентаном для иммуногистохимического анализа. Клетки селезенки и лимфатических узлов анализировали проточной цитометрией (FACS) или помещали в культуры и стимулировали MOG пептидом, анти-CD3 и LPS для дополнительного цитокинового исследования ELISA.

Результаты

Профилактика

Животных обрабатывали 1,10⁸ Lactobacillus Paracasei 8700:2 или Lactobacillus Plantarum Heal 19 в течение семи дней до иммунизации. Наблюдали значительное подавление EAE в течение короткого периода времени.

Животных обрабатывали 1,10⁹ Lactobacillus Paracasei 8700:2 или Lactobacillus Plantarum Heal 9 в течение двенадцати дней до иммунизации. Начало развития EAE было отсрочено на более чем одну неделю и привело к более мягкому развитию EAE (см. фиг. 11 и 12).

Иммуногистохимический анализ спинного мозга показал значительно более низкое количество воспалительных Т-клеток у животных, которым давали пробиотики. Исследование пролиферации спленоцитов in vitro показало одинаковую MOG специфическую пролиферацию Т-клеток, но, что интересно, они продуцировали значительно более низкие количества воспалительных цитокинов TNF-α и IFN-γ и более высокие количества IL-4 и IL-10. У животных, которые получали Paracasei, наблюдали более высокие концентрации полного IgG и антител IgA в плазме. FACS анализ мезентериальных лимфатических узлов показал увеличение CD4+CD25+ Т-клеток. Иммуногистохимический анализ селезенки показал увеличение Foxp3⁺  (T_reg) клеток.

Скрининг 1:

Для пяти различных lactobacilli (Lactobacillus Paracasei 8700:2, Lactobacillus Paracasei defacti, Lactobacillus Plantarum Heal 9, Lactobacillus Plantarum Heal 19 и Lactobacillus Plantarum 299v) проводили скрининг на предмет подавления EAE в соответствии с протоколом профилактики. Лучшее подавление наблюдали при применении Lactobacillus Paracasei 8700:2, Lactobacillus Plantarum Heal 9, и Lactobacillus Plantarum 299v.

Трансфер 1:

Животным давали Lactobacillus Paracasei 8700:2, Lactobacillus Plantarum Heal 9 или смесь обоих штаммов в течение двух недель. Затем собирали клетки мезентериального лимфатического узла и вводили реципиентам (i.v), через один день после трансфера проводили иммунизацию для EAE. EAE значительно подавлялся клетками животных, которые получали смесь двух штаммов. Эффект подавления был прерван при устранении CD4+ Т-клетки, (см. фиг. 13).

Этот эксперимент повторили, включив группу животных, котором давали смесь трех штаммов, включающих Lactobacillus Paracasei 8700:2, Lactobacillus Plantarum Heal 9 и Lactobacillus Plantarum Heal 19. Животных иммунизировали для развития EAE. Через 10 дней после начала EAE, им вводили смесь Lactobacillus Paracasei 8700:2, Lactobacillus Plantarum Heal 9 и Lactobacillus Plantarum Heal 19. Развившееся заболевание EAE было значительно подавлено по сравнению с контролем, получающим солевой раствор. Этот эксперимент успешно повторили с подобным результатом. Обработка неспецифическими бактериями Lactobacillus Delbrueckii или метотрексатом (как обычным противовоспалительным лекарственным средством) было неэффективным, что показывает уникальный терапевтический эффект этого протокола.

Противовоспалительные механизмы действия этого лечения все еще не известны, но результат, полученный авторами, ясно показывает ключевую роль популяции CD4⁺CD25⁺ Foxp3⁺ регуляторных Т-клеток (см. фиг. 14).

Изобретение относится к медицине и фармакологии и представляет собой применение по меньшей мере одного штамма пробиотических бактерий Lactobacillus, выбранных из Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313, и Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316, Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434 и Lactobacillus paracasei 02A, DSM 13432, для производства фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения рассеянного склероза (MS). Изобретение обеспечивает лечение и/или предотвращение рассеянного склероза, 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 19 ил.

1. Применение по меньшей мере одного штамма пробиотических бактерий Lactobacillus, выбранных из Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313, и Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316, Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434 и Lactobacillus paracasei 02A, DSM 13432, для производства фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения рассеянного склероза (MS).

2. Применение по п.1, где по меньшей мере два пробиотических штамма используют для лечения и/или профилактики указанного рассеянного склероза (MS).

3. Применение по п.2, где указанные по меньшей мере два штамма вводятся последовательно или одновременно.

4. Применение по п.1, где указанная фармацевтическая композиция представляет собой жидкий препарат или твердый препарат.

5. Применение по п.4, где указанный твердый препарат выбирают из группы, состоящей из таблеток, рассасываемых таблеток, леденцов, жевательных таблеток, жевательных резинок, капсул, саше, порошков, гранул, частиц с покрытием и таблеток с покрытием, таблеток и капсул с кишечно-растворимым покрытием, и рассасываемых полосок и пленок.

6. Применение по п.4, где указанный жидкий препарат выбирают из группы, состоящей из пероральных растворов, суспензий, эмульсий и сиропов.

7. Применение по п.4, где указанная композиция включает носитель.

8. Применение по п.5, где указанная композиция включает носитель.

9. Применение по п.4, где указанная фармацевтическая композиция представляет собой медицинский пищевой продукт, функциональный пищевой продукт, диетическую добавку, питательный продукт или пищевой препарат.

10. Применение по п.7, где указанный носитель независимо выбирают из группы, состоящей из овсяной муки, молочнокислых ферментированных пищевых продуктов, устойчивого крахмала, диетических волокон, углеводов, белков и гликозилированных белков.

11. Применение по п.8, где указанный носитель независимо выбирают из группы, состоящей из овсяной муки, молочнокислых ферментированных пищевых продуктов, устойчивого крахмала, диетических волокон, углеводов, белков и гликозилированных белков.

12. Применение по п.9, где указанный пищевой препарат выбирают из группы, состоящей из напитков, йогуртов, соков, мороженого, хлеба, бисквитов, продуктов из дробленого зерна, батончиков для здорового образа жизни и пастообразных продуктов.

13. Применение по любому из пп.1-12, где каждый указанный штамм(ы) присутствует(ют) в композиции в количестве от приблизительно 1·10⁶ до приблизительно 1·10¹⁴ КОЕ, предпочтительно от приблизительно 1·10⁸ до приблизительно 1·10¹², и более предпочтительно от приблизительно 1·10⁹ до приблизительно 1·10¹¹.

14. Способ лечения и/или предотвращения рассеянного склероза (MS), где по меньшей мере один штамм пробиотических бактерий Lactobacillus, выбранных из Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313, и Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316, Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434 и Lactobacillus paracasei 02A, DSM 13432, вводят индивидууму.

15. Способ по пункту 14, где для лечения и/или профилактики указанного рассеянного склероза (MS) используют по меньшей мере два штамма пробиотических бактерий.

16. Способ по п.15, где указанные штаммы вводят последовательно или одновременно.