ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ Lactobacillus plantarum Российский патент 2022 года по МПК A61K35/747 A61P1/00 A61P3/00 A61P5/00 A61P17/00 

Данное изобретение относится к применению одного или более штаммов Lactobacillus plantarum для увеличения количества видов Oscillospira у субъекта. Предпочтительно, для лечения и/или профилактики дисбиоза видов Oscillospira у субъекта повышают количество видов Oscillospira.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

«Дисбиоз» представляет собой термин, обозначающий вредный дисбаланс или нарушение в норме разнообразной микробиоты (популяции микроорганизмов) желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Известно, что дисбиоз микробиоты может привести к широкому разнообразию вредных патологических состояний и/или заболеваний.

Дисбиоз видов Oscillospira характеризуется сниженными уровнями видов Oscillospira, и связан с несколькими нежелательными патологическими состояниями, расстройствами, синдромами и/или заболеваниями, включая желудочно-кишечные расстройства, метаболические расстройства и/или воспалительные расстройства или заболевания, такие как ожирение, высокий ИМТ (Tims et al., ISME J. (April 2013); 7(4): 707-717. doi:10.1038/ismej.2012.146.Epub 2012 Nov 29) и диабет 2 типа; аутизм и первазивное расстройство развития (De Angelis et al. (2013), PLOS ONE 8(10):e76993); метеоризм (Manichanh et al., Gut (2014); 63:401-408); проницаемость кишечника (Hamilton et al., AM J. Physiology (2015); 308 (10): G840-G851; и Lam et al. (2012), PLOS ONE 7(3):e34233); синдром раздраженного кишечника (СРК); и другие связанные с воспалением расстройства, такие как воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), включая болезнь Крона (Kaakoush et al., J. Clinical Microbiology (2012); 50(10):3258-3266), и/или язвенный колит; метаболический синдром у детей и подростков и/или атоническое заболевание; атеросклероз; неалкогольная жировая болезнь печени; дислипидемия; и диарея путешественников.

Тип et al., Microbiome (2017) 5:40 исследовали меры по снижению риска для здоровья избыточного веса (ожирения) и аллергических заболеваний. Они показали, что повышенное количество Oscillospira вызвано пренатальным и/или постнатальным воздействием домашних животных с шерстью. Они также отметили, что повышенное количество Oscillospira связано с худобой или снижением индекса массы тела (ИМТ) как у младенцев, так и у взрослых. Таким образом, увеличение количества Oscillospira может представлять собой механизм, посредством которого воздействие домашних животных с шерстью снижает риск метаболического и/или атонического заболевания у детей и подростков. И наоборот, они отметили, что в трех различных географических регионах было зарегистрировано уменьшение количества Oscillospira при ожирении, несмотря на существенные различия в составе микроорганизмов кишечника.

Атеросклероз является основной причиной инфаркта миокарда и инсульта, который является ведущей причиной смерти во всем мире. Атеросклероз представляет собой хроническое воспалительное заболевание артерий.

Chan et al., BMC Microbiology (2016) 16:264 исследовали атеросклероз у мышей, вызванный рационом с высоким содержанием жиров, и обнаружили, что сниженное количество Oscillospira было связано со значительным неблагоприятным атерогенным профилем, в частности, с размером атеросклеротических бляшек и повышенными уровнями в плазме белка, связывающего жирные кислоты адипоцитов, и холестерина. Они также пришли к выводу, что Oscillospira, скорей всего, защищают от атеросклероза.

Согласно Тип et al., Microbiome (2017)5:40 лечебно-профилактические эффекты Oscillospira до конца не изучены, но считается, что они продуцируют бутират, используя продукты ферментации, выделяемые другими бактериальными видами, или сахара, высвобождаемые из муцинов хозяина.

Бутират, по-видимому, представляет собой важную сигнальную молекулу с другими возможными преимуществами для здоровья, включая метаболическое здоровье. Ацетат, пропионат и бутират представляют собой три наиболее распространенные короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК), обнаруженные в толстой кишке.

Некоторые бактерии-комменсалы в кишечнике человека вырабатывают бутират. На уровне кишечника бутират играет регуляторную роль в транспорте трансэпителиальной жидкости, уменьшает воспаление слизистой оболочки и окислительный статус, усиливает эпителиальный защитный барьер и модулирует висцеральную чувствительность и перестальтику кишечника (Canani et al., World J. Gastroenterol (2011, March 28); 17(12):1519-1528). Кроме того, все большее число исследований подчеркивают роль бутирата в профилактике и ингибировании колоректального рака. Противовоспалительный эффект бутирата может зависеть от ингибирования провоспалительных макрофагов и дендритных клеток и стимулирования генерации регуляторных Т-клеток (Arpaia et al., Nature (19/26 Dec 2013) vol 504:451-455; Change al., P.N.A.S (Feb 11, 2014) vol 111(6):2247-2252; и Singh et al., Immunity (Jan 16, 2014); 40(1):128-139).

На системном уровне бутират оказывает потенциально полезное воздействие на многие патологические состояния, включая гемоглобинопатии, генетические метаболические заболевания, гиперхолестеринемию, резистентность к инсулину и ишемический инсульт (Canani et al., World J. Gastroenterol (2011, March 28); 17(12):1519-1528).

Продуценты бутирата находятся в меньшем количестве у людей с метаболическими заболеваниями, такими как избыточный вес, метаболический синдром, резистентность к инсулину, диабет II типа и дислипидемия. Бутират повышает уровень ГПП-1 (глюкагоноподобного пептида-1) в L-клетках и может играть активную роль в контроле уровня глюкозы в крови и помогает субъектам с предиабетом поддерживать нормальную концентрацию глюкозы в крови / уменьшать гликемические реакции после приема пищи. (Yadav et al., J. Biol. Chem (Aug 30, 2013); vol 288 (35):25088-25097; Qin et al., Nature (Oct 4, 2012); vol 490:55-60; Karlsson et al., Nature (June 6, 2013); vol 498:99-103; и Vrieze et al., Gastroenterology (2012); 143:913-916).

Было показано, что пробиотические бактерии, продуцирующие бутират (Clostridium butyricum Miyairi 588), снижают отложение липидов в печени, вызванное холин-дефицитной, определяемой L-аминокислотами диетой (не алкогольная жировая болезнь печени), у грызунов и значительно улучшают содержание триглицеридов, резистентность к инсулину, уровни сывороточного эндотоксина и индексы воспаления печени (Endo et al., PLOS ONE (May 2013); vol 8(5):e63388. doi:10.1371/joumal.pone.0063388).

Krokowicz et al., Travel Med. Infect. Dis (Mar-Apr. 2014); 12(2):183-8 продемонстрировали, что применение бутирата натрия и короткоцепочечных жирных кислот снижает частоту возникновения диареи путешественников и может представлять собой новый способ профилактики диареи путешественников. Поскольку можно ожидать, что увеличение числа видов Oscillospira в соответствии с данным изобретением увеличит выработку бутирата, способы и наборы согласно данному изобретению, которые можно использовать, также могут найти применение в профилактике и/или лечении диареи путешественников.

Следовательно, бактерии, продуцирующие бутират, могут лечить или предотвращать метаболическое заболевание и/или воспалительные состояния посредством нескольких различных механизмов действия (Brahe et al., Int. Ass. For the Study of Obesity (2013):1-9. doi:10.1111/obr.12068).

Следовательно, существует необходимость в повышении уровней видов Oscillospira у субъекта для получения и предпочтительной поддержки полезных лечебно-профилактических эффектов, связанных с этим. В частности, существует необходимость в обеспечении материалов и способов для применения в лечении и/или профилактике дисбиоза видов Oscillospira. Тем не менее, особая проблема в разработке эффективных способов лечения заключается в том, что Oscillospira представляет собой анаэробный бактериальный род из кластера IV Clostridium, который не поддавался культивированию в течение более столетия с момента его первого наблюдения (см. Gophna et al., Environmental Microbiology (2017) 19(3), 835-841). Соответственно, не представляется возможным культивировать, получать и вводить виды Oscillospira субъекту, чтобы увеличить их количество.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно первому аспекту изобретение обеспечивает способ увеличения количества видов Oscillospira у субъекта, включающий введение субъекту по меньшей мере одного штамма Lactobacillus plantarum.

Предпочтительно способ предназначен для лечения и/или профилактики дисбиоза видов Oscillospira.

Во втором аспекте изобретение обеспечивает применение по меньшей мере одного штамма Lactobacillus plantarum для увеличения количества видов Oscillospira у субъекта. Предпочтительно применение предназначено для лечения и/или профилактики дисбиоза видов Oscillospira у субъекта.

В третьем аспекте изобретение обеспечивает по меньшей мере один штамм Lactobacillus plantarum для применения при изготовлении композиции для увеличения количества видов Oscillospira у субъекта. Предпочтительно применение заключается в лечении и/или профилактике дисбиоза видов Oscillospira у субъекта.

При дисбиозе видов Oscillospira снижается количество видов Oscillospira, а лечение и/или профилактика с использованием по меньшей мере одного штамма Lactobacillus plantarum в соответствии с изобретением эффективны для увеличения и предпочтительно поддержания повышенного количества видов Oscillospira у субъекта по сравнению с количеством видов Oscillospira у субъекта без лечения.

Под «увеличенным числом видов Oscillospira» мы подразумеваем, что общее количество бактерий Oscillospira любого и всех видов Oscillospira увеличивается у субъекта или в соответствующем образце из него.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В описании изобретения раскрыты различные варианты осуществления и/или отдельные компоненты. Как будет очевидно для обычного специалиста в данной области техники все комбинации таких вариантов осуществления и компонентов, раскрытых в описании, возможны и могут привести к предпочтительным вариантам осуществления данного изобретения.

Любые проценты и соотношения рассчитываются по массе, если не указано иное. Все проценты, части и соотношения рассчитаны на основе общего состава, если не указано иное.

Упоминаемые в данном документе обозначения могут быть торговыми наименованиями компонентов, включая различные ингредиенты, используемые в данном изобретении. Тем не менее, изобретатели не намерены ограничиваться материалами под определенным торговым наименованием. Материалы, эквивалентные тем, на которые ссылается торговая марка (например, материалы, полученные из другого источника под другим названием или каталожным номером), могут быть заменены и использованы в вариантах осуществления изобретения, описанных в данном документе.

Lactobacillus plantarum

По меньшей мере один штамм Lactobacillus plantarum для применения в соответствии с изобретением может представлять собой любой жизнеспособный и/или мертвый штамм Lactobacillus plantarum. Предпочтительно штамм представляет собой пробиотик, то есть жизнеспособный штамм, который после введения обеспечивает лечебно-профилактический эффект млекопитающему-реципиенту, предпочтительно человеку. Композиция может содержать один вид или штамм пробиотической бактерии или она может содержать комбинацию одного или более видов или штаммов.

Особенно предпочтительные пробиотические штаммы Lactobacillus plantarum для применения в изобретении выбирают из одного или более штаммов Lactobacillus plantarum 299v (DSM 9843, депонированный 16.03.1995); Lactobacillus plantarum 299 (DSM 6595, депонированный 02.07.1991); Lactobacillus plantarum HEAL 9 (DSM 15312, депонированный 27.11.2002); Lactobacillus plantarum HEAL 19 (DSM 15313, депонированный 27.11.2002); Lactobacillus plantarum HEAL 99 (DSM 15316, депонированный 27.11.2002); и Lactobacillus plantarum Gos 42 (DSM 32131, депонированный 02.09.2015), которые были депонированы компанией Probi AB, 41 A, SE-223 701 Lund, Sweden в депозитарий DSMZ, расположенный по адресу Inhoffenstrasse 7B, 38124 Брауншвейг, Германия, в соответствии с положениями Будапештского договора.

Другие предпочтительные пробиотические штаммы Lactobacillus plantarum могут быть выбраны из одного или более из следующего: Lactobacillus plantarum LB3e (DSM 17852 и Lactobacillus plantarum LB7c (DSM 17853, оба депонированы 01.01.2006 компанией ProBac AB, Box 3049, Se-903 02 Umea, Sweden); и Lactobacillus plantarum LB931 (DSM 11918, депонированный 01.09.1998 компанией Essum AB (www.essum.se), Nygatan 74, SE-903 02 Sweden). Все три штамма были депонированы в DSMZ по адресу: Inhoffenstrasse 7B, 38124 Брауншвейг, Германия.

Наиболее предпочтительным штаммом для применения согласно изобретению является Lactobacillus plantarum 299v (DSM 9843).

Lactobacillus plantarum 299 (DSM 6595) был депонирован 2 июля 1991 года в DSM-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH компанией Probi.

Lactobacillus plantarum 299v (DSM 9843) был депонирован 16 марта 1995 года в DSM-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH no адресу Mascheroder Weg 1b, D-38124 Брауншвейг, Германия компанией Probi AB.

Lactobacillus plantarum HEAL 9 (DSM 15312), Lactobacillus plantarum HEAL 19 (DSM 15313) и Lactobacillus plantarum HEAL 99 (DSM 15316) были депонированы 27 ноября 2002 г. в DSMZ- DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREB GmbH по адресу Mascheroder Weg 1b, D-38124 Брауншвейг, Германия компанией Probi AB.

Lactobacillus plantarum GOS42 (DSM 32131) был депонирован 2 сентября 2015 г. в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур DSMZ института Лейбница по адресу Inhoffenstr. 7 В, D-38124 Брауншвейг, Германия, компанией Probi AB.

Lactobacillus plantarum LB3e (DSM 17852) и Lactobacillus plantarum LB7c (DSM 17853) были депонированы 6 января 2006 г. в DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH по адресу Mascheroder Weg 1b, D-38124 Брауншвейг, Германия компанией Probac AB. Все права и обязанности в отношении депонированных DSM 17852 и DSM 17853 были переданы и приняты Probi AB, которая в настоящее время является депонентом указанных штаммов.

Lactobacillus plantarum LB931 (DSM 11918) был депонирован 9 января 1998 года в DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH по адресу Mascheroder Weg 1b, D-38124 Брауншвейг, Германия компанией Essum AB, который был предоставлен для публичного ознакомления путем раскрытия в выданном патенте ЕР 1060240.

Жизнеспособность пробиотических бактерий может быть подтверждена путем посева бактерий на подходящую среду (например, затвердевший агар в чашке Петри стандартного размера) и подсчета количества образовавшихся колоний. Показатель, колониеобразующая единица (или КОЕ), используется для количественной оценки количества жизнеспособных (живых) бактерий в композиции.

Таким образом, от количества влаги в композиции частично зависят исходные колониеобразующие единицы (КОЕ) и сохраняющаяся стабильность и жизнеспособность. Как описано в данном документе композицию упаковывают и хранят в контейнерах (предпочтительно в герметичном контейнере) для обеспечения барьера для кислорода и влаги, чтобы защитить целостность пробиотических бактерий в композиции.

Колониеобразующие единицы (КОЕ), упоминаемые в контексте композиции согласно данному изобретению, представляют собой КОЕ в однократной дозе после приготовления композиции.

Эффективные количества Lactobacillus plantarum

Предпочтительно по меньшей мере один штамм бактерий Lactobacillus plantarum присутствует в композициях согласно изобретению в КОЕ на дозу от 10³-10¹² КОЕ/доза до 10⁸-10¹¹ КОЕ/доза, наиболее предпочтительно 10¹⁰ КОЕ/доза.

Композиции, содержащие Lactobacillus

Композиции, содержащие Lactobacillus, согласно изобретению могут быть представлены в виде различных одно- и/или многодозовых лекарственных форм, включая капсулы, таблетки и порошки. Предпочтительно композиции согласно изобретению приспособлены для перорального введения субъекту.

Композиции и лекарственные формы

Пробиотические штаммы согласно изобретению являются предпочтительно лиофилизированными.

Пробиотические штаммы согласно изобретению могут быть предоставлены вместе с подходящим носителем, разбавителем или наполнителем в виде твердой или жидкой лекарственной формы, которая может представлять собой фармацевтическую композицию в соответствии с вариантом осуществления.

Примеры подходящего жидкого носителя включают воду и другие водные растворители.

Примеры подходящего твердого носителя включают мальтодекстрин, инулин, картофельный крахмал, кукурузный крахмал или другой растительный крахмал, микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ) и сахарные спирты.

Композиция может представлять собой сухую ферментированную или неферментированную композицию. В случае сухой неферментированной композиции ферментация происходит в желудочно-кишечном тракте после приема композиции субъектом.

При использовании пробиотический(е) штамм(ы) согласно изобретению может быть смешан с жидким или твердым носителем перед введением субъекту. Например, субъект может смешивать штамм(ы) с носителем, состоящим из воды или какого-либо другого водного растворителя, или напитка перед употреблением. Аналогично, Пробиотические штаммы могут быть смешаны с носителем, состоящим из одного или более продуктов питания. Предпочтительные продукты питания представляют собой продукты без глютена, такие как ферментированные или неферментированные молочные продукты, такие как йогурты, фруктовые соки; напитки, супы, продукты растительного происхождения, такие как продукты из сои, мюсли-батончики, детское питание, питание для младенцев, молочная смесь первого уровня, заменители грудного молока с рождения.

Молоко для питания детей или младенцев представляет собой особенно предпочтительный носитель для пробиотического штамма(ов) Lactobacilli согласно изобретению. Оно может быть в форме сухого порошка для смешивания с водой перед кормлением младенцев в готовой к употреблению жидкой форме. Его, как правило, изготавливают из коровьего молока, и он содержит сывороточный белок и казеин.

Пробиотический штамм(ы) согласно изобретению также может быть представлен в композиции вместе с одним или более ингредиентами из известных биологически активных добавок к пище, например, микроэлементов, таких как витамины и минералы.

Упаковка

Композиции согласно данному изобретению, как правило, помещают в герметичный контейнер, который обеспечивает барьер для кислорода и влаги для защиты и поддержания жизнеспособности любых живых бактерий в композиции.

Предпочтительно композицию упаковывают в герметичные стик-пакеты из алюминиевой фольги, причем каждый стик-пакет содержит одну дозу композиции, то есть одну дозу пробиотических бактерий.

Способы введения и применения

Композиции, содержащие Lactobacillus plantarum, согласно изобретению, описанные в данном документе, предпочтительно вводят перорально, хотя могут быть рассмотрены и другие пути, включая ректальное введение.

Используемый в данном документе термин «пероральное введение» по отношению к субъекту означает, что млекопитающее глотает, или человек собирается вводить или он ввел себе (или другому человеку или другому животному) одну или более представленных в данном документе композиций. В тех случаях, когда человеку предписано вводить композицию, такое предписание может быть таким, которое инструктирует и/или информирует человека о том, что применение композиции может обеспечить и/или обеспечит указанное преимущество, например, ослабление одного или более симптомов, связанных с болезнью или патологическим состоянием. Например, таким направлением может быть устное предписание (например, посредством устной инструкции, например, от врача, фармацевта, медсестры или другого медицинского работника), радио или телевизионные средства массовой информации (т.е. реклама) или письменное предписание (например, посредством письменного предписания от, например, медицинского работника (например, рецепты), специалиста по продажам или организации (например, посредством, например, маркетинговых брошюр, брошюр, печатных материалов (например, Интернета, электронной почты или других связанных с компьютером средств информации) и/или упаковки, связанной с композицией (например, этикетки, присутствующей на контейнере, содержащем композицию). Используемый в данном документе термин «письменный» означает слова, картинки, символы и/или другие визуальные дескрипторы. Такая информация не должна использовать фактические слова, используемые в данном документе, например, «человек» или «лечение», а скорее всего в рамках объема данного изобретения предполагают использование слов, изображений, символов и тому подобного, передающих одинаковое или подобное значение.

Введение могут осуществлять по мере необходимости или по желанию, чтобы увеличить и предпочтительно поддерживать повышенное количество видов Oscillospira, например, один раз в месяц, один раз в неделю или ежедневно, в том числе несколько раз в сутки, чтобы достичь общей суточной дозы или количества пробиотических бактерий, вводимых каждые сутки, один раз в неделю, один раз в месяц или в определенный день по мере необходимости. Количество используемой композиции может зависеть от множества факторов, включая состояние здоровья субъекта-млекопитающего, возраст, пол или другие подобные факторы, которые обычно учитываются.

Предпочтительно субъект, которого лечат в соответствии с изобретением, представляет собой млекопитающее, наиболее предпочтительно человека, быка, собаку или кошку; или птицу, наиболее предпочтительно один или более видов домашней птицы, таких как куры или индейки.

В предпочтительном варианте осуществления субъект представляет собой человека, выбранного из младенца мужского или женского пола в возрасте от 0 до 6 месяцев; ребенка мужского или женского пола от 6 месяцев до 16 лет, особенно от 6 месяцев до 6 лет; и взрослого мужчины или женщины.

Взрослому мужчине или женщине может быть от 16 до 65 лет или более 65 лет. Взрослая женщина может быть детородного возраста или в постменопаузе.

Обнаружение и подсчет видов Oscillospira

Предпочтительно количество видов Oscillospira обнаруживают в соответствующих биологических образцах. Например, образцы могут быть взяты из рубца (образцы жидкости или всего содержимого рубца) травоядных млекопитающих, таких как домашний скот или овцы; образцы кала и/или образцы также могут быть взяты из соответствующих областей желудочно-кишечного тракта человека.

Подходящие молекулярные методы для обнаружения и подсчета видов Oscillospira. описаны в Mackie et al. Applied and Environmental Microbiology, Nov 2003, p 6808-6815 и включают использование праймеров для ПЦР, основанных на последовательностях гена РНК рибосомной 16S, специфических для Oscillospira.

В частности, Mackie et al. (2003), описывают процедуры ПЦР и ПЦР-денатурирующий градиентный гель электрофорез (ДГГЭ DGGE- denaturing gradient gel electrophoresis) для обнаружения видов Oscillospira. Они использовали указанные методы для определения наличия этой бактерии у различных жвачных животных, включая крупный рогатый скот, овец и северных оленей.

Klindworth et al., Nucleic Acids Research vol. 41, No. 1 (опубликовано в Интернете 28 августа 2012 г.) оценивали общие ПЦР-праймеры гена 16S рибосомной РНК и дают рекомендации по выбору подходящих пар праймеров для изучения уровней и разнообразия микроорганизмов для классических исследований и исследований на основе сиквенирования нового поколения.

Уровень видов Oscillospira в указанном исследуемом образце можно сравнить с уровнем указанных видов Oscillospira в контрольном образце. Контрольный образец может быть преимущественно получен от здорового субъекта или из пула образцов от здоровых субъектов и предпочтительно обработан таким же способом, как и исследуемый образец. Таким образом, предпочтительно, контрольный образец отбирают таким же образом, как и исследуемый образец, при необходимости нуклеиновую кислоту выделяют таким же образом, как и для исследуемого образца, и при необходимости гибридизацию или количественную амплификацию проводят в тех же условиях, чтобы обеспечить достоверное сравнение исследуемого образца и контрольного образца. Нет необходимости определять уровень видов Oscillospira в контрольном образце каждый раз, когда измеряют исследуемый образец; после того, как в контрольном образце достоверно определен уровень, значения уровня могут быть сохранены, например, в компьютере, и использованы в сравнительных целях.

Другие подходящие способы подсчета видов Oscillospira у субъекта раскрыты в US 2012/0238468, раскрытие которой касается определения и сравнения уровней видов Oscillospira в образцах от здоровых и больных субъектов включается в данный документ посредством ссылки.

Уровень указанных видов Oscillospira в исследуемом образце можно сравнить с теми же бактериями в контрольном образце. Пониженный уровень видов Oscillospira связан с диагнозом, согласно которому исследуемый образец взят от субъекта, страдающего дисбиозом видов Oscillospira, например, от синдрома раздраженного кишечника.

Используемый в данном документе уровень бактерий Oscillospira в исследуемом образце является повышенным, когда он значительно выше, чем уровень бактерий Oscillospira в контрольном образце. Также считается повышенным, когда уровень бактерий Oscillospira в исследуемом образце по меньшей мере в 1, 2, 5, 10, 100, 1000 или более раз превышает количество бактерий Oscillospira в контрольном образце.

Используемый в данном документе количество или уровень бактерий Oscillospira в исследуемом образце является сниженным, когда он значительно ниже, чем уровень указанных бактерий Oscillospira в контрольном образце. Также считается сниженным, когда уровень бактерий Oscillospira в исследуемом образце по меньшей мере в 1, 2, 5, 10, 100 раз или 1000 раз ниже уровня Oscillospira в контрольном образце.

Уровни последовательностей нуклеиновых кислот в исследуемом образце могут быть подвергнуты статистическому и/или биоинформатическому анализу для получения проанализированных данных; и проанализированные данные указанного исследуемого образца можно сравнить с анализируемыми данными для контрольного образца для определения того, принадлежит ли исследуемый образец субъекту, страдающему дисбактериозом видов Oscillospira и любым сопутствующим расстройством, таким как синдром раздраженного кишечника. Например, схемы гибридизации на микрочипе, содержащем последовательности нуклеиновых кислот, могут быть обработаны с использованием статистического и/или биоинформационного анализа, такого как метод главных компонент (РСА - Principal Component Analysis) и/или анализ избыточности (RDA - Redundancy Analysis). Затем проанализированные данные можно сравнить с проанализированными данными для контрольного образца, который подвергали такому же статистическому и/или биоинформатическому анализу.

Статистический анализ микромассивов (SAM - Significance Analysis of Microarrays) для определения дифференциально экспрессированных транскриптов можно использовать для сравнения уровней указанных трех или более последовательностей нуклеиновых кислот из указанного исследуемого образца с уровнями последовательности нуклеиновых кислот из контрольного образца. Специалист в данной области техники способен выполнить анализ SAM. Анализ SAM подробно описан Tusher et al. (Proc Natl Acad Sci USA, 2001, vol 98:5116-5121), который включен в данный документ посредством ссылки.

Прогностический анализ для микромассивов (РАМ - Prediction Analysis of Microarray) можно использовать для сравнения уровней указанной последовательности нуклеиновой кислоты из указанного исследуемого образца с уровнями последовательности нуклеиновой кислоты из контрольного образца. Специалист в данной области техники способен выполнить анализ РАМ. Анализ РАМ подробно описан Tibshirani et al. (Proc Natl Acad Sci USA, 2002, vol 99:6567-6572), который включен в данный документ посредством ссылки.

Анализ избыточности (RDA) можно использовать для сравнения уровней последовательности нуклеиновой кислоты из указанного исследуемого образца с уровнями последовательности нуклеиновой кислоты из контрольного образца. Специалист в данной области техники способен выполнить анализ RDA. Анализ RDA подробно описан Leps и Smilauer (2003. Cambridge University Press: Multivariate analysis of ecological 780 data using CANOCO), который включен в данный документ посредством ссылки.

ПРИМЕРЫ

Следующие неограничивающие примеры воплощают определенные аспекты изобретения и описаны со ссылкой на прилагаемые фигуры, на которых:

На Фиг. 1 и 2 продемонстрированы результаты анализа избыточности (RDA).

RDA представляет собой метод многомерного анализа, который определяет разницу между группами образцов, которую можно объяснить при помощи набора переменных. На Фиг. 1 и 2 в RDA различные свойства образца (например, группа лечения; пациенты, ответившие на лечение и т.д.) объясняются составами микробиоты на уровне рода.

На Фиг. 1 и 2 в RDA каждая точка представляет собой образец. Черные стрелки представляют роды, а точка в прямой представляет образцы, в которых род является очень распространенным. Для дискретных классов цвета и форма символов образцов указывают на класс образца. Цветные полигоны («огибающие кривые») охватывают все образцы в классе. Большие треугольники представляют собой центроиды («среднюю выборку» класса).

На Фиг. 1 анализ избыточности (RDA) 93 образцов продемонстрировал, что 4 недели лечения Lactobacillus plantarum привели к другому составу микробиоты в группе (активная - символ в виде круга), которая получала лечение Lactobacillus plantarum (10¹⁰ КОЕ один раз в сутки в капсуле, содержащей лиофилизированные бактерии Lactobacillus plantarum и порошок-наполнитель) по сравнению с группой плацебо (= символ в виде квадрата), причем активная группа демонстрирует повышенное количество видов Oscillospira.

На Фиг. 2 продемонстрирован анализ избыточности 24 образцов от индивидуумов, которые были определены как «пациенты с болью в животе, ответившие на лечение, в соответствии с рекомендациями ЕАЛС (Европейское агентство лекарственных средств)» (т.е. чувствовали себя на ≥30% лучше по сравнению с их средним исходным показателем для ≥ 0% периода лечения). Уровни видов Oscillospira выше в группе, которая получала лечение Lactobacillus plantarum (активная), чем в группе, которая получала плацебо.

На Фиг. 3(а)-3(с) продемонстрирована разница между «активной» и «плацебо» для каждого субъекта. Вопрос, к которому относятся данные: для конкретного таксона, отличается ли изменение численности в группах «активная» и «плацебо» «до» лечения и «после» него? Вертикальная ось: 2 log (после/до), где увеличение по вертикальной оси означает увеличение численности со временем. При помощи анализа выявлен селективный эффект: в первых двух диаграммах размаха имеется только одно статистически значимое различие: на Фиг. 3(а) Lactobacillaceae, отражающие Lactobacillus plantarum, введенные субъектам; и уровни на Фиг. 3(b) видов Oscillospira, (на Фиг. 3(с)) Streptococcus не зависят от лечения Lactobacillus plantarum.

ПРИМЕР

Клиническое исследование: исследование представляло собой рандомизированное, плацебо-контролируемое, двойное слепое, параллельное, интервенционное исследование с добровольными амбулаторными пациентами с СРК в соответствии с Римскими критериями III. После скринингового визита и 2-недельного подготовительного периода пациенты с болью в животе от 3-6 до 0-10 по шкале Ликерта с частотой не менее двух дней в неделю были рандомизированы для получения или Lactobacillus plantarum 299v (10¹⁰ КОЕ/капсула) или плацебо по одной капсуле в сутки в течение 4 недель. Образец кала отбирали в конце подготовительного периода и в конце периода лечения. Вопросник по питанию и физической активности был заполнен при визите рандомизации и при последнем визите.

Профилирование генов 16S рРНК: были созданы и сиквенированы библиотеки ампликонов гена 16S рРНК при помощи Illumina. Вкратце, баркодированные ампликоны из области V3-V4 генов 16S рРНК были получены с использованием 2-этапной ПЦР. 10-25 нг геномной (г) ДНК использовали в качестве матрицы для первой ПЦР с общим объемом 50 мкл с использованием специфических праймеров к 16S рРНК 341F (5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3', SEQ ID NO: 1) и 805R (5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3', SEQ ID NO: 2), присоединенных к адапторным последовательностям Illumina. Продукты ПЦР очищали, а размер продуктов ПЦР проверяли на биоанализаторе (Agilent) и количественно определяли с помощью флуоресцентного анализа. Очищенные продукты ПЦР использовали для 2-й ПЦР в комбинации со специфическими для образца баркодированными праймерами (набор Nextera XT Index Kit, Illumina). Затем продукты ПЦР очищали, проверяли на биоанализаторе (Agilent) и количественно определяли с последующим мультиплексированием, кластеризацией и сиквенированием на Illumina MiSeq с использованием протокола с (2х) 300 парами оснований и индексацией. Последовательность сиквенирования была проанализирована с помощью программного обеспечения Illumina CASAVA (v1.8.3) с демультиплексированием на основе баркодов для конкретных образцов. Полученные необработанные данные сиквенирования были обработаны с удалением прочтений последовательности слишком низкого качества (были выбраны только прочтения, «проходящие фильтр») и отбрасыванием прочтений, содержащих последовательности адаптера или контроль PhiX, с использованием внутреннего протокола фильтрации. Оценка качества оставшихся прочтений была выполнена с использованием инструмента для контроля качества FASTQC версии 0.10.0.

Биоинформатика: Анализ состава микробиоты: состав микробиоты определяли с использованием модифицированного конвейерного программного обеспечения Qiime 1.8. Пример кластеризации был выполнен с помощью скрипта «pick_openreference_otus» для конвейерного программного обеспечения (97% идентичность) для версии 13.8 базы данных GreenGenes с использованием инструмента Usearch в качестве методов кластеризации. Удаление химеры на основании референтной базой данных было сделано с помощью инструмента Uchime.

• Многомерная статистика: анализ избыточности (RDA) проводили с использованием Сапосо 5.0.

• Одномерную статистику выполняли в Scientific Python с использованием непараметрических критериев (критерий Манна-Уитни и критерий Краскела-Уоллиса для независимых выборок, критерий Уилкоксона для зависимых выборок).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Как показатели количества клетчатки, так и оценка Бристольской шкалы формы кала (BSS) оказались факторами, искажающими результаты, и были скорректированы в анализах. Образцы кала без соответствующей оценки BSS за этот день были удалены из анализа.

Анализ избыточности (RDA) выявил тенденцию к дифференцированному составу микробиоты в группе плацебо по сравнению с активной группой в конечной точке. Одномерный анализ продемонстрировал, что численность рода Oscillospira была значительно выше в активной группе в конечной точке после коррекции для множественного тестирования.

Согласно рекомендациям Европейского агентства лекарственных средств (ЕАЛС) по оценке лекарственных средств для лечения синдрома раздраженного кишечника (СРК) от 25 сентября 2014 года, пациент с СРК классифицируется как пациент с болью в животе, ответивший на лечение, если в течение не менее 50% периода лечения у него наблюдается боль в животе, которая облегчилась как минимум на 30% по сравнению с их исходным показателем.

На Фиг. 1 анализ 93 образцов продемонстрировал, что после нескольких недель лечения Lactobacillus plantarum (10¹⁰ КОЕ в день) в группе, которая получала лечение Lactobacillus plantarum (активная) по сравнению с группой, принимавшей плацебо, наблюдали другой состав микробиоты, при этом в активной группе наблюдали увеличенное количество видов Oscillospira.

На Фиг. 2 продемонстрирован анализ 24 образцов от пациентов с болью в животе, ответивших на лечение, в соответствии с рекомендациями ЕАЛС (т.е. они чувствовали себя на ≥30% лучше по сравнению с их средним исходным показателем для ≥50% периода лечения). Уровни видов Oscillospira выше в группе, которая получала лечение Lactobacillus plantarum (активная), чем в группе, которая получала плацебо;

На Фиг. 3(а)-3(с) продемонстрирована разница между «активная» и «плацебо» для каждого субъекта в сочетании с данными «до» и «после». Вопрос, к которому относятся данные: для конкретного таксона, отличается ли изменение численности в группах «активная» и «плацебо» «до» лечения и «после» него? Селективный эффект выявлен при помощи анализа: в первых двух диаграммах размаха имеется только одно статистически значимое различие после коррекции для множественного тестирования: на Фиг. 3(а) Lactobacillaceae, отражающие Lactobacillus plantarum, введенные субъектам; и уровни на Фиг. 3(b) видов Oscillospira, (на Фиг. 3(с)) Streptococcus не зависят от лечения Lactobacillus plantarum.

В целом, данные результаты демонстрируют, что лечение Lactobacillus plantarum эффективно для увеличения количества видов Oscillospira у субъекта. Кроме того, результаты демонстрируют, что увеличение количества Oscillospira связано с положительным эффектом в отношении боли у пациентов с СРК, получавших Lactobacillus plantarum. Следовательно, изобретение должно найти применение в лечении и/или профилактике широкого спектра других расстройств и заболеваний, которые связаны с низкими уровнями Oscillospira, который является спрогнозированным продуцентом бутирата, и/или с расстройствами и заболеваниями, которые связаны с низкой численностью продуцентов бутирата.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к гастроэнтерологии и терапии, и предназначена для увеличения количества видов Oscillospira у субъекта. Применяют по меньшей мере один штамм Lactobacillus plantarum в способе увеличения количества видов Oscillospira у субъекта путем введения по меньшей мере одного штамма Lactobacillus plantarum для достижения увеличенного количества видов Oscillospira у субъекта. В другом воплощении представлен способ увеличения численности видов Oscillospira у субъекта, включающий введение субъекту по меньшей мере одного штамма Lactobacillus plantarum, при этом Lactobacillus plantarum вводят в количестве 10³ – 10¹² КОЕ в суточной дозе. Также, обеспечивается набор для использования в способе увеличения количества видов Oscillospira у субъекта для лечения и/или профилактики дисбиоза видов Oscillospira spp. Использование группы изобретений позволяет повысить уровни видов Oscillospira у субъекта для получения и предпочтительной поддержки полезных лечебно-профилактических эффектов, связанных с этим. 3 н. и 14 з.п. ф-лы, 1 пр., 3 ил.

1. Применение по меньшей мере одного штамма Lactobacillus plantarum в способе увеличения количества видов Oscillospira у субъекта, включающее введение по меньшей мере одного штамма Lactobacillus plantarum для достижения увеличенного количества видов Oscillospira у субъекта.

2. Применение Lactobacillus plantarum по п. 1, отличающееся тем, что указанный способ предназначен для лечения и/или профилактики дисбиоза видов Oscillospira.

3. Способ увеличения численности видов Oscillospira у субъекта, включающий введение субъекту по меньшей мере одного штамма Lactobacillus plantarum, при этом Lactobacillus plantarum вводят в количестве 10³ – 10¹² КОЕ в суточной дозе.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что указанный способ предназначен для лечения и/или профилактики дисбиоза видов Oscillospira.

5. Способ по п. 3 или 4, дополнительно включающий проведение инструктирования субъекта до введения в отношении применения или приема Lactobacillus plantarum для увеличения количества видов Oscillospira.

6. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что лечение является эффективным для поддержания увеличения количества видов Oscillospira у субъекта.

7. Применение по п. 1 или 2 или способ по любому из пп. 3-5, отличающиеся тем, что по меньшей мере один штамм Lactobacillus plantarum вводят перорально.

8. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что Lactobacillus plantarum вводят в количестве 108 – 1011 КОЕ в суточной дозе, предпочтительно 1010 КОЕ в суточной дозе.

9. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что по меньшей мере один штамм Lactobacillus plantarum выбирают из одного или более из следующего: Lactobacillus plantarum 299v (DSM 9843); Lactobacillus plantarum 299 (DSM 6595); Lactobacillus plantarum HEAL 9 (DSM 15312); Lactobacillus plantarum HEAL 19 (DSM 15313); Lactobacillus plantarum HEAL 99 (DSM 15316); и Lactobacillus plantarum Gos 42 (DSM 32131); Lactobacillus plantarum LB3e (DSM 17852); Lactobacillus plantarum LB7c (DSM 17853); и/или Lactobacillus plantarum LB931 (DSM 11918).

10. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что по меньшей мере один штамм Lactobacillus plantarum представляет собой Lactobacillus plantarum 299v (DSM 9843).

11. Применение или способ по п. 7, отличающиеся тем, что по меньшей мере один штамм Lactobacillus plantarum содержится в композиции в комбинации с наполнителем или материалом-носителем.

12. Применение или способ по п. 11, отличающиеся тем, что наполнитель представляет собой фармацевтически приемлемый наполнитель.

13. Применение или способ по п. 11 или 12, отличающиеся тем, что материал-носитель представляет собой пищевую субстанцию для человека и/или животных.

14. Применение или способ по 13, отличающиеся тем, что по меньшей мере один штамм Lactobacillus plantarum предоставлен в виде композиции в комбинации с пищевой добавкой, такой как минеральное вещество и/или витамин.

15. Применение или способ по любому из пп. 11-14, отличающиеся тем, что композицию модифицируют для перорального введения.

16. Применение по п. 2 или способ по п. 4 или 5, отличающиеся тем, что дисбиоз видов Oscillospira связан с желудочно-кишечным расстройством; метаболическим и/или воспалительным расстройством, синдромом и/или заболеванием, таким как ожирение, высокий ИМТ, дислипидемия и диабет 2 типа; аутизм и общее расстройство психологического развития; метеоризм; проницаемость кишечника; синдром раздраженного кишечника (СРК); и другие воспалительные расстройства, такие как воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), включая болезнь Крона и язвенный колит; метаболическое и/или атопическое заболевание у детей и подростков; атеросклероз; неалкогольная жировая болезнь печени; и диарея путешественников.

17. Набор для использования в способе увеличения количества видов Oscillospira у субъекта для лечения и/или профилактики дисбиоза видов Oscillospira spp., представленный в композиции как это определено по п. 14, содержащий (i) по меньшей мере один штамм Lactobacillus plantarum как это определено по любому из пп. 11-15; в комбинации с (ii) информацией и/или инструкциями, предписывающими человеку принимать, получать и/или вводить указанный по меньшей мере один штамм Lactobacillus plantarum для увеличения количества видов Oscillospira у человека или субъекта, которому вводится указанный по меньшей мере один штамм Lactobacillus plantarum.