СПОСОБ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИИ ASCARIS LUMBRICOIDES В КЛИНИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ НА РАЗЛИЧНЫХ СТАДИЯХ ЗАБОЛЕВАНИЯ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/483 C07K14/00 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике и паразитологии, и может быть использовано для диагностики аскаридоза.

Несмотря на успехи, достигнутые в решении проблемы гельминтозов, одним из наиболее распространенных остается аскаридоз, вызываемый Ascaris lumbricoides и регистрирующийся во всем мире. В среднем по России ежегодно выявляется от 40 до 60 тыс. заболевших. В частности, в 2008 году только по официальным данным зарегистрировано 49409 инвазированных (Г.Г.Онищенко. Государственный доклад «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2008 году». // Справочник заведующего КДЛ. - 2009, 11. - С.37-58). Аскаридоз отличает тяжесть течения и отсутствие патогномоничной симптоматики (задержка физического развития, полуобморочные и эпилептиформные состояния, токсико-аллергические реакции, непроходимость кишечника, гнойные холангиты и множественные абсцессы печени, которые, в свою очередь, могут осложниться перитонитом, гнойным плевритом, сепсисом, абсцессами в брюшной полости и т.д.). Одним из наиболее эффективных способов профилактики в паразитологии рассматривают раннюю диагностику, что позволяет своевременно ограничить распространение возбудителя и необходимо для этиотропного лечения больных. Это обусловливает значительный интерес к проблеме раннего обнаружения и идентификации указанных паразитов.

Для этого в настоящее время применяются (Методики клинических лабораторных исследований: Справочное пособие. Том 3. / Под ред. В.В.Меньшикова. - М.: Лабора, 2009. - 880 с.):

1. Клинико-эпидемиологический метод, информативность которого наиболее высока в раннюю, миграционную фазу заболевания, основывающийся на клинической картине, результатах общего лабораторного исследования крови (эозинофилия, повышение СОЭ и т.д.), рентгенологических данных, исследовании мокроты на обнаружение личинок Ascaris lumbricoides.

2. Иммунологический метод (ИФА), также преимущественно информативный в миграционную и кишечную фазы заболевания и основанный на обнаружении в сыворотке крови больных специфических антител к Ascaris lumbricoides.

3. Метод овоскопии, обеспечивающий получение необходимых лабораторных данных только в кишечную фазу заболевания и основанный на визуальном обнаружении (световая микроскопия) в фекалиях зрелых особей Ascaris lumbricoides и их яиц (методы Като, предварительного обогащении по Калантарян, Фюллеборну и др.).

Однако все используемые методы имеют ряд существенных недостатков:

1. Клинико-эпидемиологический метод отличает низкая информативность ввиду отсутствия специфики клинических проявлений и изменений картины крови. Обнаружение личинок гельминта в мокроте пациента на практике большая редкость. Рентгенологическое выявление эозинофильных инфильтратов, мигрирующих в легочной ткани, достаточно субъективно и неспецифично, поскольку не позволяет дифференцировать анкилостомидоз и стронгилоидоз, а также поражения легких вследствие туберкулеза, пневмонии иной этиологии или опухолевого процесса.

2. Иммуноферментный метод, несмотря на высокую специфичность и чувствительность (около 80%), не всегда обеспечивает надежную корреляцию с результатами других исследований и, соответственно, единую интерпретацию данных.

3. Метод овоскопии обеспечивает диагностику лишь на поздних стадиях заболевания, преимущественно на этапе хронизации. При этом диагностика не всегда возможна, поскольку даже при наличии в кишечнике аскарид их яйца могут не обнаруживаться в испражнениях человека в течение 60-75 дней. Детекция Ascaris lumbricoides и/или их яиц невозможна, если паразитируют только самцы или однополые особи (около 3,5% случаев), неполовозрелые или не способные к яйцепродукции самки.

Известен способ диагностики гельминтоза, заключающийся в том, что в моче исследуют продукты обмена аскарид, например муравьиную, капроновую и пропионовую кислоты методом жидкостной хроматографии, и по увеличению их содержания диагностируют наличие аскарид (патент RU 2104534, 1998 г.). Данный способ позволяет осуществить диагностику заболевания на ранней стадии.

В решении проблемы диагностики аскаридоза могло бы оказаться полезным применение молекулярно-генетических методов, в частности полимеразной цепной реакции (ПЦР), которую отличает исключительно высокая чувствительность и специфичность, что позволит выявлять аскариды и/или их яйца в клиническом материале в любую стадию заболевания и, в особенности - в самом начале заболевания.

Прототипом предлагаемого изобретения является способ идентификации личинок аскарид в гомогенате печеночной ткани при использовании сиквенса рибосомальной ДНК (Ishiwata, K., A.Shinohara, К.Yagi, Y.Horii, К.Tsuchiya, and Y.Nawa. 2004. Identification of tissue-embedded ascarid larvae by ribosomal DNA sequencing. Parasitol. Res. 92:50-52).

Задачей изобретения является разработка высокоспецифичного и высокочувствительного способа специфической детекции Ascaris lumbricoides на различных, в том числе ранней, стадиях заболевания.

Технический результат при использовании изобретения - повышение точности лабораторной диагностики аскаридоза у человека за счет достоверного обнаружения личинок, яиц и зрелых особей Ascaris lumbricoides.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе детекции Ascaris lumbricoides, включающем выделение тотальной нативной ДНК из исследуемого материала, включая секционный, проведение полимеразной цепной реакции, согласно изобретению в качестве исследуемого материала дополнительно используют кал, слизь, мокроту, кровь, проводят специфическую амплификацию фрагмента гена 18S рРНК Ascaris lumbricoides с использованием праймеров следующей структуры: 5′ ctg ggc tcc tgg gct agt tct gct 3′, 5′ ctg gtg gtg ccc ttc cgt ccat 3′ и при электрофоретическом обнаружении продукта амплификации размером 489 пн определяют наличие возбудителя.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Из клинического материала (кал, слизь, мокрота, кровь и др.) выделяют тотальную нативную ДНК, после чего проводят специфическую амплификацию (ПЦР) фрагмента гена 18S рибосомальной РНК (рРНК) Ascaris lumbricoides с использованием праймеров следующей структуры: 5′ ctg ggc tec tgg gct agt tct gct 3′, 5′ ctg gtg gtg ccc ttc cgt ccat 3′. При электрофоретическом обнаружении продукта амплификации размером 489 пн констатируют факт присутствия возбудителя в клиническом материале и подтверждают соответствующий диагноз.

ДНК выделяют из клинического материала (кал, слизь, мокрота, кровь, секционный материал). Для обеспечения необходимой степени чистоты ДНК и достаточного ее количества предлагается использовать методику Boom R. (Boom R., et al. 1990. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids. J. Clin. Microbiol. 28:495-503)

1. В пробирку с 300 мкл лизирующего раствора (5М гуанидин-тиоционат, 1% Triton X100) вносится 1 грамм исследуемого материала. Проба тщательно перемешивается на вортексе и прогревается 5 мин при температуре 65°С. После этого осаждается центрифугированием 2 мин при 12 тыс. об/мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость переносится в новую чистую пробирку.

2. Отдельным наконечником в пробирку вносят 25 мкл ресуспендированного сорбента (силикагель, SiO₂). Перемешивают на вортексе, ставят в штатив на 2 мин, еще раз перемешивают и оставляют в штативе на 5 мин.

3. Сорбент осаждается центрифугированием при 8 тыс. об/мин в течение 30 с. Надосадочная жидкость удаляется с использованием вакуумного отсасывателя.

4. Далее в пробирку с сорбентом вносится 300 мкл раствора для отмывки (5М гуанидинтиоционат). Образовавшуюся смесь тщательно ресуспендируют на вортексе.

5. Сорбент осаждается центрифугированием при 8 тыс. об/мин на микроцентрифуге в течение 30 с. Надосадочная жидкость удаляется с помощью вакуумного отсасывателя и чистого наконечника.

6. Добавляется 950 мкл отмывочного раствора 2 (70% этиловый спирт). Сорбент ресуспендируют на вортексе, центрифугируют 30 с при 10 тыс. об/мин на микроцентрифуге. Надосадочную жидкость удаляют, используя вакуумный отсасыватель и чистый наконечник.

7. Пробирку инкубируют при температуре 65°C 5-10 мин для подсушивания сорбента. При этом крышка пробирки должна быть открыта. В пробирку после подсушки добавляется 50 мкл ТЕ-буфера (1 мМ EDTA, 10 мМ TRIS-HCl рН 8.0) для элюции ДНК. Перемешивается на вортексе. Для лучшей элюции пробирка инкубируется в термостате при температуре 65°C в течение 5 мин с периодическим встряхиванием на вортексе.

8. Далее сорбент осаждается центрифугированием при 12 тыс. об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость, содержащая очищенную ДНК, готова к постановке ПЦР.

Раствор ДНК можно хранить при температуре -18°C в течение 6 месяцев.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) и амплификации нужного фрагмента гена 18S рРНК, выявляемого при помощи подобранных праймеров следующей структуры последовательности

Ascarfor - 5′ ctg ggc tcc tgg gct agt tct gct 3′

Ascarrev - 5′ ctg gtg gtg ccc ttc cgt ccat 3′

Амплификацию специфичного фрагмента гена 18S рРНК проводят в 30 мкл общего объема смеси, содержащей 67 мМ трис-НСl, 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄, 2-2,5 мМ MgCl₂, 0,01% Tween-20, 0,1 мкг геномной ДНК, по 30-50 пМ специфичных праймеров, по 250 мкМ дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ и 5-10 Ед. активности Taq-полимеразы.

Режим амплификации следующий: начальная денатурация при 94°С в течение 2 мин; 10 циклов, включая денатурацию при 94°С, - 10 с, отжиг праймеров и синтез ДНК при 65°С, - 1 мин; 20 циклов, включая денатурацию при 94°C, - 10 с, отжиг праймеров при 61°С - 50 с, синтез ДНК при 72°С - 30 с. Амплифицированные фрагменты ДНК разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле и после окрашивания геля бромидом этидия идентифицируют в ультрафиолетовом свете. В качестве электролита для электрофореза применяют 0,5 X боратный буфер (0,089 М трис HCl, рН 7,9; 0,089 М борная кислота, 0,002 ЭДТА, рН 8,0).

Электрофорез проводят при постоянном напряжении 150 В после 5-минутного преэлектрофореза. Детекцию результатов проводят путем окрашивания агарозного геля бромистым этидием в течение 10 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Продукт амплификации размером 489 пн обнаруживается в виде светящейся полосы красно-оранжевого цвета.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Мама больной З. (4 года) обратилась с ребенком к гастроэнтерологу по направлению участкового педиатра. При обращении предъявляла жалобы на утомляемость девочки, раздражительность, тревожный сон, скрип зубами во сне.

Анамнез: Двоюродная сестра девочки, с которой она провела лето в деревне у бабушки, болела аскаридозом.

Симптомы:

Жалобы на понижение аппетита, тошноту, боли в эпигастрии, иногда схваткообразного характера (кишечная колика).

Результаты лабораторных исследований:

В крови лейкоциты - 6,0×10%, эозинофилы - 45%. При исследовании фекалий по Като, Калантарян, Фюллеборну яйца аскарид не обнаружены.

Предварительный диагноз: аскаридоз?

Результаты ПНР: в кале методом полимеразной цепной реакции обнаружены и идентифицированы специфичные для Ascaris lumbricoides фрагменты гена 18S рРНК.

Окончательный диагноз: аскаридоз, кишечная фаза, лейкемоидная реакция эозинофильного типа.

Результаты повторных лабораторных исследований:

Через два месяца при повторной сдаче кала обнаружены яйца аскарид.

Пример 2.

Девочка А. (5 лет). Ночью ребенка посадили на горшок, в котором мама впоследствии обнаружила 2 зрелые аскариды, которые принесла для уточнения в лабораторию. На основании макроскопии представленных гельминтов был выставлен соответствующий диагноз - аскаридоз, после чего проводилась этиотропная терапия противогельминтными препаратами. Однако через месяц мама обратилась к гастроэнтерологу повторно в связи с сохранившимися симптомами заболевания.

Симптомы:

Постоянный жидкий стул. При осмотре ребенок вялый, бледный. Рост и вес ребенка не соответствуют возрасту. На коже ребенка имеются проявления аллергодерматита. Ночной сон - беспокойный. Отхождения взрослых особей не отмечено.

Результаты лабораторных исследований:

В ходе овоскопии кала яйца Ascaris lumbricoides не обнаружены.

Результаты ПЦР: в кале методом полимеразной цепной реакции обнаружены и идентифицированы специфичные для Ascaris lumbricoides фрагменты гена 18S рРНК.

Окончательный диагноз: аскаридоз, кишечная фаза.

После проведения повторного курса лечения симптоматика заболевания исчезла. В ходе контрольного клинико-лабораторного исследования, включая предложенный способ, в кале и крови Ascaris lumbricoides не обнаружены. Констатирован факт полного выздоровления.

Таким образом, предлагаемый способ специфической детекции Ascaris lumbricoides в клиническом материале на различных стадиях заболевания в отличие от клинико-эпидемиологического, иммунологического и микроскопического методов позволяет выявлять и идентифицировать личинки и яйца Ascaris lumbricoides в доступном клиническом материале в различные фазы заболевания (ранний период, хронизация), что надежно коррелирует с результатами других исследований и, соответственно, обеспечивает единую интерпретацию данных.

Изобретение относится области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике и паразитологии, и касается способа специфической детекции Ascaris lumbricoides в клиническом материале на различных стадиях заболевания. Сущность способа заключается в том, что выделяют тотальную ДНК из исследуемого материала. В качестве исследуемого материала используют кал, слизь, мокроту, кровь, секционный материал. Проводят специфическую амплификацию фрагмента гена 18S рРНК Ascaris lumbricoides с использованием специфических праймеров. При электрофоретическом обнаружении продукта амплификации размером 489 пн определяют наличие возбудителя. Использование изобретения позволяет объективно установить факт инфицированности человека Ascaris lumbricoides и поставить диагноз аскаридоза вне зависимости от вида исследуемого материала и стадии заболевания.

Способ детекции Ascaris lumbricoides, включающий выделение тотальной нативной ДНК из исследуемого материала, включая секционный, проведение полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что в качестве исследуемого материала дополнительно используют кал, слизь, мокроту, кровь, проводят специфическую амплификацию фрагмента гена 18S рРНК Ascaris lumbricoides с использованием праймеров следующей структуры: 5′ ctg ggc tec tgg get agt tct get 3′, 5′ ctg ggc tcc tgg gct agt ccat 3′ и при электрофоретическом обнаружении продукта амплификации размером 489 пн определяют наличие возбудителя.