Способ получения линии гуманизированных мышей, содержащих инсерцию 3974insT в гене mGrin2a (mice glutamate [NMDA] receptor subunit epsilon-1), приводящую к преждевременному прекращению трансляции белка grin2a Российский патент 2022 года по МПК A01K67/27 

Область техники

Изобретение относится к областям молекулярных биотехнологии и медицины и касается мышиной модели, содержащей инсерцию 3974insT в гене grin2a. Изобретение может быть использовано для детального изучения патогенеза и разработки терапии детской эпилепсии, сопровождающейся задержкой развития.

Изобретение создано при финансовой поддержке Министерства Науки и Высшего образования Российской Федерации в рамках Соглашения № 075-15-2019-1661 от 31.10.2019.

Уровень техники

Синдром эпилепсии-афазии (EAS) - группа состояний, ключевыми особенностями которых являются нарушение языковых навыков (афазия) и пароксизмальная электрическая активность в головном мозге, зарегистрированная на электроэнцефалографе. Синдром эпилепсии-афазии включает Синдром Ландау-Клеффнера (LKS) или Доброкачественная эпилепсия с центро-темпоральными спайками (BECTS), Эпилептическую энцефалопатию с продолженной спайк-волновой активностью во сне (ECSWS), Аутосомно-доминантную роландическую эпилепсию с речевой диспраксией (ADRESD).

N-метил-d-аспартатный рецептор (NMDA) - гетеротетрамер, образующий ионный канал, который играет ключевую роль в синаптической пластичности, что имеет решающее значение в процессах обучения и формирования памяти. Состоит из двух облигатных субъединиц GluN1 и двух других субъединиц из подсемейств GluN2 или GluN3A.

Мутации в гене GRIN2A вызывают конформационные изменения в субъединице GluN2A (NMDA) что, во-первых, приводит к уменьшению числа рецепторов NMDA с GluN2А-субъединицей, в результате чего передача сигналов в ЦНС осуществляется через другие типы NMDA-рецепторов; во-вторых, возможно формирование аберрантных GluN2A, вызывающих атипичную активность нейронов.

EAS проявляется состояниями различной степени тяжести. В легкой форме развиваются клинические проявления обычной Роландической эпилепсии, часто связанной с речевым и оромоторным дефицитом, а также с нарушениями чтения, внимания и памяти. Эпилептическая энцефалопатия с продолженной спайк-волновой активностью во сне (ECSWS) проявляются более тяжелыми фенотипическими проявлениями синдрома эпилепсии-афазии в виде глобального регресса в обучении, памяти, моторике и социальных навыках. Синдром Ландау-Клеффнера (LKS) характеризуется катастрофической афазией у детей, при этом с сохранными когнитивными функциями.

Для разработки терапевтических подходов и доклинических исследований перспективных препаратов необходимы адекватные животные модели. Известны трансгенные мыши (K. Sakimura, T. Kutsuwada, I. Ito, T. Manabe, C. Takayama, E. Kushiya, T. Yagi, S. Aizawa, Y. Inoue, H. Sugiyama, et al., Reduced hippocampal LTP and spatial learning in mice lacking NMDA receptor epsilon 1 subunit Nature, 373 (1995), pp. 151-155) и (Salmi, Manal et al. “Impaired vocal communication, sleep-related discharges, and transient alteration of slow-wave sleep in developing mice lacking the GluN2A subunit of N-methyl-d-aspartate receptors.” Epilepsia vol. 60,7 (2019): 1424-1437. doi:10.1111/epi.16060) с нокаутом гена mGRIN2A, в результате чего формируется NMDA-рецептор без субъединицы NR2A.

Краткое описание изобретения

В данном изобретении реализована мутация, приводящая не к нокауту гена, а к сдвигу рамки считывания и преждевременной терминации трансляции на уровне 14-го экзона, приводящая к формированию неполноценного белка Glun2A. Существует вероятность, что мыши с мутантной формой белка Glun2A будут демонстрировать фенотип заболевания, отличающийся от мышей с полным нокаутом гена.

Для создания инсерции в геноме мыши мы использовали систему CRISPR/Cas9, состоящую из белка spCas9 и сгРНК, ПАМ-сайт которой расположен в 3-х нуклеотидах от инсерции.

Задачей заявляемого изобретения является создание мышиной модели синдрома афазии-эпилепсии путем внесения в геном мыши инсерции 3974insT в гене grin2a.

Задача решается тем, что с использованием системы CRISPR/Cas9 получена новая линия генетически модифицированных мышей, содержащих в геноме инсерцию 3974insT в гене grin2a, для чего:

1. Была получена плазмидная конструкция px330+GRIN2Asg SEQ ID NO: 1, содержащая сгРНК SEQ ID NO: 2 против соответствующего участка гена grin2a, под контролем U6 промотора и ОРС гена spCas9 под контролем CAG промотора.

2. Был разработан способ получения конструкции px330+GRIN2Asg, характеризующийся следующими стадиями:

а) Биоинформатический анализ последовательности гена grin2a и подбор сгРНК в непосредственной близости от места целевой мутации

б) Клонирование соответствующей последовательности сгРНК в вектор px330.

3. Способ получения линии мышей, трансгенных по hGRIN2A, характеризующийся следующими стадиями:

а) микроинъекция конструкции px330+GRIN2Asg из п. 1 в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки мыши гибрида F1(CBA×C57BL/6);

б) выявление жизнеспособных зигот;

в) пересадка выживших зигот из стадии (б) псевдобеременным самкам-реципиентам, имеющим копулятивную пробку после ссаживания с вазэктомированными самцами;

г) получение новорожденных мышей на 19 день после пересадки зигот из стадии (в);

д) проведение анализа наличия мутации через 8-14 дней после рождения мышей (г), путем амплификации целевого участка гена grin2a с праймерами SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 с последующим секвенированием фрагмента;

е) отбор мышей, несущих целевую мутацию;

ж) проведение скрещивания мышей из стадии (е) с мышами дикого типа для получения самок-гетерозигот или мутантных самцов, несущих целевую мутацию.

з) проведение скрещивания мышей из стадии (ж) для получения итоговой линии мышей, несущих инсерцию 3974insT в гене grin2a.

Технический результат изобретения: разработан способ получения линии трансгенных мышей c инсерцией 3974insT в гене grin2a и выведена соответствующая линия мышей.

Изобретение иллюстрируется фигурами 1 и 2 и перечнем использованных последовательностей.

Осуществление изобретения

Способ осуществляется следующим образом:

1. Получение генетических конструкций. Для создания выбранной нами инсерции мы подобрали с помощью онлайн инструмента http://crispor.tefor.net/ сгРНК, ПАМ-сайт которой находится на расстоянии 3-х нуклеотидов от места разрыва (Фиг.2). Выбранная сгРНК имела последовательность TACTGGAGGGCAACTTATTAC-GGG. Выбранную сгРНК мы заклонировали в плазмидный вектор px330, предназначенный для одновременной экспрессии белка spCas9 и сгРНК. Последовательность сгРНК была синтезирована с использованием двух олигонуклеотидов SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.

Разрезание вектора производили с использованием рестриктазы BbsI-HF (New England Biolabs), затем дефосфорилировали вектор с помощью фермента FastAP (Thermofisher Scientific), и очищали в агарозном геле и последующим выделением с помощью набора Monarch DNA Gel Extraction Kit. Олигонуклеотиды для последовательности сгРНК были заказаны с таким расчетом, чтобы их некомплиментарные концы образовали липкие концы для клонирования в вектор px330. Олигонуклеотиды фосфорилировали с использованием фермента PNK kinase (Thermofisher Scientific), отжигали друг с другом и лигировали с приготовленным ранее вектором и использованием фермента T4 DNA ligase (Thermofisher Scientific). Лигазную смесь трансформировали в компетентные клетки штамма XL1blue (Евроген). Скрининг колоний осуществляли с использованием ПЦР-наборов компании Изоген и праймеров к U6 промотору (SEQ ID NO: 5) и обратного праймера для синтеза сгРНК (SEQ ID NO: 4). По две колонии, содержащие сгРНК, наращивали в ночной культуре и выделяли с помощью набора Monarch Plasmid Miniprep Kit. Анализ полученных плазмид проводили методом секвенирования по Сэнгеру. Сиквенс полученных плазмид осуществляли с использованием праймера SEQ ID NO: 5 в компании Евроген. Анализ сиквенсов проводили с использованием программного обеспечения SnapGene.

Проверенную конструкцию разводили до концентрации используемой при микроинъекциях - 1нг/мкл.

2. Получение яйцеклеток мышей. Яйцеклетки для микроинъекции получали методом индукции суперовуляции. Для этого неполовозрелым самкам гибридам F1(CBA×C57BL/6) весом 12-13 г внутрибрюшинно вводили 8 ед. гонадотропина сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК) и через 48 час - 8 ед. хорионического гонадотропина человека (ХгЧ). После такой обработки самок ссаживали с самцами-производителями F1(CBA×C57BL/6). Факт спаривания констатировали на следующее утро по наличию копулятивной пробки.

Схема индукции суперовуляции: 12:00 - ГСЖК, через 48 часов - ХгЧ. В 17:00 этого же дня - подсадка к самцам-производителям. Отбор доноров производили на следующий день в 9:00. Световой режим в виварии был установлен с 7:00 до 19:00.

Отобранных самок-доноров умерщвляли, извлекали яйцеводы, затем вымывали яйцеклетки в среде HEPES-KSOM с добавлением гиалуронидазы. Процедуру проводили под бинокуляром (Zeiss Stemi DV4) с увеличением в 32 раза. Для вымывания яйцеклеток использовали стеклянные капилляры с внутренним диаметром примерно 100 мкм, изготовленные на пуллере Narishige PC-10 (Япония) и микрокузнице Narishige MF-900 (Япония).

3. Микроинъекции. Полученные зиготы культивировали в течение двух часов при t=37°C и 5% СО2 в капле среды KSOM под минеральным маслом (Sigma, США), затем помещали в микроинъекционную камеру. Микроинъекции проводили в среде HEPES-KSOM под микроскопом Zeiss Axiovert 200М при увеличении в 400-600 раз, используя микроманипуляторы Narishige. Для изготовления игл для микроинъекций использовали пуллер Sutter instrument Со Р-97 (США), для изготовления удерживающей пипетки использовали пуллер Narishige PC-10 и микрокузницу Narishige MF-900.

После окончания микроинъекций выжившие зиготы переносили в каплю среды KSOM под минеральное масло (Sigma) и культивировали в течение 1 часа для выявления жизнеспособных эмбрионов.

4. Получение самок-реципиентов. Самок-реципиентов яйцеклеток получали следующим образом: половозрелых самок F1(CBA×C57BL/6) весом не менее 24 г ссаживали с вазэктомированными самцами той же линии. Через 18 часов псевдобеременных реципиентов отбирали по наличию копулятивных пробок. Выжившие после микроинъекции зиготы трансплантировали в яйцеводы псевдобеременной самки. Одной псевдобеременной самке пересаживали 6-10 эмбрионов. Операцию проводили под наркозом (смесь золетила и рометара, вводился внутрибрюшинно).

5. Операция вазэктомирования. Операцию вазэктомирования проводили заранее под наркозом (смесь золетила и рометара, вводился внутрибрюшинно). Через надрез в коже и брюшной стенке вытягивали из брюшной полости семенник, придатки семенника и семявыносящий проток, после чего раскаленным пинцетом разрушали семявыносящий проток. Органы возвращали в брюшную полость, и повторяли всю процедуру на другом семявыносящем протоке. На завершающем этапе на брюшную стенку и на кожу накладывали швы с последующей антисептической обработкой операционного поля.

6. Получение новорожденных мышей. На 19 день после пересадки микроинъецированных эмбрионов реципиента умерщвляли путем цервикальной дислокации и проводили кесарево сечение, после чего выживших детенышей помещали к заранее подготовленной кормилице. Через 8-14 дней после рождения у мышат брали образец ткани, выделяли ДНК и анализировали наличие трансгена методом ПЦР.

7. Анализ наличия трансгена в геноме мышей производили методом секвенирования ПЦР-фрагмента. ДНК для ПЦР выделяли из тканей по стандартному протоколу:

1) Добавить в эппендорф с образцом ткани 200 mkl лизирующего буфера (pH 12.0);

2) Инкубировать при температуре 95°, 2 часа (50°, 12-18 часов);

3) Очистить ДНК из полученного лизата фенол-хлороформом;

4) Измерить концентрацию очищенной ДНК на спектрофотометре.

Амплификацию фрагментов ДНК проводили с помощью набора Мастер-микс DreamTaq™ Hot Start PCR в присутствии 10 мкМ праймеров grin2a-seq (for+rev):

1. Master Mix= 10 мкл

2. Праймеры (смесь, 10 мкМ)= 1 мкл

3. ДНК= 1 мкл

4. Деионизированная вода = 8 мкл

Проведение ПЦР:

1. Денатурация 95°С - 3’

2. 95°С - 30 ’’

3. 57°С - 30’’

4. 72°С - 30’’

5. Go to step 3 38X

6. Синтез 72° - 5’

7. Infinite Hold 4°

Протокол секвенирования:

1. После прохождения реакции ПЦР проведён электрофорез в 1% агарозном геле, объем лунок 20 мкл, использован буфер TAE (x1). В первую и последнюю лунку геля добавлены по 15 мкл ДНК-маркера 1 kb;

2. После электрофореза стерильным скальпелем вырезана полоса нужного размера и помещена в заранее подготовленный и пронумерованный чистый эппендорф (1,5 мкл);

3. Выделен продукт ПЦР из 1% геля с помощью набора QiaGen по инструкции производителя. На последнем этапе проведена элюция в 20-30 мкл элюирующего буфера или деионизированной воды (mQ);

4. Измерить концентрацию полученного продукта на спектрофотометре. Для секвенирования подходит очищенная ДНК с концентрацией больше 20 нг/мкл (мкг/мл);

5. Полученный продукт секвенировали в компании Евроген. С использованием праймера grin2a-seq.

Полученные сиквенсы можно подразделить на три категории: сиквенсы дикого типа, последовательность в которых соответствует дикому типу, двоящиеся сиквенсы, соответствующие мозаичным животным F0 или гетерозиготным самкам следующих поколений, и сиквенсы, на которых присутствует только мутантный вариант ДНК, соответствующие трансгенным самцам и гомозиготным трансгенным самкам.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Институт биологии гена Российской академии

наук (Institute of Gene Biology Russian Academy

of Sciences)

<120> Способ получения линии гуманизированных мышей,

содержащих инсерцию 3974insT в гене mGrin2a (mice

glutamate [NMDA] receptor subunit epsilon-1),

приводящую к преждевременному прекращению трансляции

белка grin2a

<160> 7

<210> 1

<211> 4396

<212> ДНК

<213> artificial sequence

<220>

<223> Последовательность мышиного гена GRIN2A с мутацией

3974insT

<400> 1

atg ggc aga ctg ggc tac tgg acc ttg ctg gta ttg ccg gcc ctt ctg gtc tgg cac ggt 60

ccg gcg cag aac gcg gcg gcg gag aag ggt act cca gcg ctg aac att gcg gtg ctg ctg 120

ggt cac agc cac gac gtg aca gaa cgc gaa ctt cga aat ctg tgg ggc ccg gag cag gca 180

acc ggc ttg ccc ctg gat gtg aac gtg gtg gcg tta ttg atg aac cgc act gac cct aag 240

agc ctc atc acg cat gtg tgc gac ctc atg tcc ggg gcg cgc atc cat ggc ttg gtg ttt 300

gga gat gat acg gac caa gag gct gtg gct cag atg ctg gat ttt atc tcc tca cag act 360

ttc atc ccc atc ttg ggc att cat ggg ggt gca tct atg atc atg gct gac aag gat ccg 420

aca tcc acg ttc ttc cag ttt gga gct tcc atc cag cag caa gcc acg gtc atg ctg aag 480

atc atg cag gac tat gac tgg cat gtc ttc tcc ttg gtc acc acc atc ttc cct ggc tac 540

aga gac ttc atc agc ttc atc aag aca aca gtg gac aac agc ttt gtg ggc tgg gat atg 600

cag aac gtg atc aca ctg gac acc tct ttt gag gac gcc aag aca cag gtc cag ctg aag 660

aag atc cac tcc tct gtc atc ctg ctc tac tgc tcc aag gat gag gct gtc ctc atc ctg 720

agc gag gct cgc tct ctt ggc ctc acc ggc tac gat ttc ttc tgg att gtc ccc agt ttg 780

gtc tcc ggg aac aca gag ctc atc ccc aaa gag ttt cca tcg ggt ctc att tca gtc tct 840

tac gac gac tgg gac tac agt ctg gag gca aga gtg aga gac ggt ctt ggg atc tta acc 900

act gcc gca tct tcc atg ttg gag aaa ttc tcc tac att ccc gag gcc aag gcc agc tgc 960

tac ggg cag aca gag aag ccg gag acc ccg cta cac act ctg cac caa ttt atg gtc aat 1020

gtg act tgg gat ggc aag gac ttg tcc ttc act gag gaa ggc tat cag gtg cac ccc agg 1080

ctt gtg gtg atc gtg ctg aat aag gac cgg gaa tgg gaa aag gtg ggc aag tgg gag aat 1140

cag act ctg agc ctg cgg cat gct gtg tgg cca agg tat aag tcc ttt tct gac tgt gag 1200

cca gat gac aac cac ctc agc att gtc acc ttg gag gaa gcc ccc ttc gtc atc gta gaa 1260

gac ata gac cca ctg act gag acc tgc gtc agg aac acg gta ccc tgt cgg aag ttt gtc 1320

aag atc aac aat tca acc aac gaa ggg atg aat gtg aag aag tgc tgc aag ggg ttc tgc 1380

atc gac atc ctt aag aaa ctg tcc aga act gta aag ttc acc tat gac ctc tac ctg gtg 1440

acc aat ggg aag cat ggg aaa aag gtt aac aat gtg tgg aat gga atg ata ggc gaa gtg 1500

gtc tat caa cga gca gtt atg gcc gtg ggc tcc ctc acc atc aat gag gag cgt tca gaa 1560

gtg gtg gac ttc tcc gtg ccc ttt gtg gag aca gga atc agt gtc atg gtc tcc agg agt 1620

aat ggc act gtt tcc cct tct gct ttc ctt gaa ccc ttc agc gcc tct gtc tgg gtg atg 1680

atg ttc gtg atg ctg ctc att gtc tct gcc att gct gtc ttc gtt ttt gaa tac ttc agt 1740

cct gtt gga tac aac aga aac tta gcc aaa ggg aaa gct ccc cat ggg cct tct ttt acc 1800

att gga aaa gct ata tgg ctc ctc tgg ggc ctg gtc ttc aac aat tct gtg ccc gtc cag 1860

aat cct aaa ggc aca acc agc aag ata atg gta tca gtg tgg gcc ttc ttt gcc gtc atc 1920

ttc ctt gca agt tac aca gcc aac ctg gct gcc ttc atg atc cag gag gag ttt gtg gac 1980

caa gtg act ggc ctc agt gac aag aag ttc cag aga cct cat gac tat tct ccg cct ttc 2040

cga ttt ggg aca gta ccc aat gga agt aca gaa agg aat att cgt aac aac tac ccc tat 2100

atg cac cag tac atg acc aaa ttc aac cag agg ggc gta gag gat gcc ttg gtc agc ttg 2160

aaa act ggg aag ttg gac gct ttc atc tat gac gca gct gtc ttg aac tac aag gcc ggg 2220

agg gat gaa ggc tgt aaa ctg gtg acc att ggg agc ggg tac atc ttt gcc acc aca ggc 2280

tat gga att gct ctg cag aag ggc tca ccc tgg aag agg cag att gac ctc gct ctg ctc 2340

cag ttt gtt ggt gac ggt gag atg gaa gag ctg gag aca ctg tgg ctt acg ggc atc tgc 2400

cac aac gag aag aat gag gtg atg agc agc cag ctg gac atc gac aac atg gca gga gtt 2460

ttc tac atg ctg gct gca gct atg gcc ctc agc ctc atc acc ttc atc tgg gag cac ctc 2520

ttc tac tgg aag ctg cgc ttc tgc ttc aca ggc gtg tgt tct gac cgg ccc ggg ctg ctc 2580

ttc tcc atc agc agg ggc atc tac agt tgc atc cat gga gtg cac att gaa gaa aag aag 2640

aag tct cca gac ttc aat ctg act ggg tca cag agc aac atg cta aag ctt ctc cgc tca 2700

gct aaa aac atc tcc aac atg tcc aac atg aac tcc tcg cga atg gac tca ccc aaa aga 2760

gct gct gac ttc atc caa aga ggc tca ctt att gtg gac atg gtt tca gac aag gga aat 2820

ttg ata tac tca gat aac agg tcc ttt caa ggg aag gac agt ata ttt gga gaa aac atg 2880

aat gaa ctg caa aca ttt gtg gcc aac agg cac aag gat agt ctc agt aac tat gtg ttt 2940

cag gga cag cat cct ctc act ctc aat gag tcc aac ccc aac aca gtg gag gtg gct gtc 3000

agc act gaa tcc aaa ggg aac tcc cga ccc cgg cag ctt tgg aag aaa tcc atg gag tct 3060

cta cgc cag gat tct cta aac cag aac cca gtc tcc cag agg gat gag aag act gca gag 3120

aat agg acc cac tcc cta aag agt cct agg tat ctt cca gaa gag gta gcc cat tct gac 3180

att tct gaa acc tca agc cgg gcc aca tgc cac agg gag cca gat aat aat aag aac cac 3240

aag acc aag gat aac ttc aaa agg tca atg gcc tct aaa tac ccc aag gac tgt agt gag 3300

gtt gaa cgt acc tac gtg aaa acc aaa gca agt tct ccc agg gat aag atc tac acc atc 3360

gat ggt gag aag gag ccc agc ttc cac tta gat cct cca cag ttc att gaa aac ata gtc 3420

ttg cct gag aat gtg gac ttc cca gat acc tac caa gat cac aat gag aat ttc cgc aag 3480

ggg gac tcc aca ctg ccc atg aac agg aac cca cta cac aat gaa gat ggg ctt ccc aac 3540

aat gac cag tat aaa ctc tat gcc aag cac ttt acc ttg aaa gac aag ggt tcc cca cat 3600

agt gag ggc agt gat cga tat cgg cag aac tcc acg cat tgc aga agc tgc ctc tca aac 3654

ctg ccc acc tac tca ggc cac ttt acc atg aga tct cct ttc aag tgt gat gcc tgt ctg 3714

cgg atg ggg aac ctc tat gac att gat gaa gac cag atg ctt cag gag aca ggc aac cca 3774

gct act cgt gag gag gcc tac cag cag gac tgg tca cag aac aac gcc ctc cag ttc cag 3834

aag aac aag cta aag att aat cga cag cac tcc tat gat aac att ctc gac aaa ccc agg 3894

gag ata gac ctt agc agg ccc tct cgt agc ata agc ctc aag gac agg gaa agg cta ctg 3954

gag ggc aac tta ata cgg gag cct gtt cag tgt ccc ctc aag caa act ctt ggg gaa caa 4014

aag ctc cct ttt ccc cca agg tct gga gga cag caa gag gag caa atc tct ctt gcc aga 4074

cca tac ctc tga taa tcc ttt cct cca cac gta cgg gga tga cca acg ctt agt tat tgg 4134

gag atg tcc ctc gga ccc tta caa aca ctc att gcc atc aca ggc agt aaa tga cag cta 4194

tct tcg gtc atc ctt gag gtc aac agc atc ata ttg ctc cag gga cag tcg ggg cca cag 4254

tga tgt gta tat ttc aga gca tgt tat gcc tta tgc tgc aaa taa gaa taa cat gta ctc 4314

tac ccc cag ggt ttt aaa ttc ctg cag caa tag acg tgt gta caa gaa aat gcc tag tat 4374

tga atc tga tgt cta a 4396

<210> 2

<211> 24

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<220>

<223> сгРНК против mGrin2a

<400> 2

tactggaggg caacttatta cggg 24

<210> 3

<211> 26

<212> ДНК

<213> artificial sequence

<220>

<223> sgGRIN2A-f олигонуклеотид для синтеза

последовательности сгРНК

<400> 3

caccgtactg gagggcaact tattac 26

<210> 4

<211> 26

<212> ДНК

<213> artificial sequence

<220>

<223> sgGRIN2A-r олигонуклеотид для синтеза

последовательности сгРНК

<400> 4

aaacgtaata agttgccctc cagtac 26

<210> 5

<211> 23

<212> ДНК

<213> Home sapiens, artificial sequence

<220>

<223> U6-f праймер для проверки конструкции

<400> 5

gagggcctat ttcccatgat tcc 23

<210> 6

<211> 27

<212> ДНК

<213> artificial sequence

<220>

<223> GRIN2A-f олигонуклеотид для генотипирования

<400> 6

cactccagtg tctgctgttg atgtatg 27

<210> 7

<211> 27

<212> ДНК

<213> artificial sequence

<220>

<223> GRIN2A-r олигонуклеотид для генотипирования

<400> 7

acgtgtggag gaaaggatta tcagagg 27

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности плазмидной конструкции, полученной на основе вектора px330 и экспрессирующей сгРНК против фрагмента последовательности 14 экзона гена grin2a под контролем U6 промотора и ОРС гена spCas9 под контролем CAG промотора. Также раскрыта линия мышей, полученная путем трансформации мышей вышеуказанной конструкцией, а также способ ее получения. Изобретение эффективно для моделирования синдрома афазии-эпилепсии. 3 н.п. ф-лы.

1. Плазмидная конструкция px330+GRIN2Asg для получения трансгенных мышей, полученная на основе вектора px330 и экспрессирующая сгРНК с последовательностью SEQ ID NO: 2 против фрагмента последовательности 14 экзона гена grin2a под контролем U6 промотора и ОРС гена spCas9 под контролем CAG промотора.

2. Линия мышей для моделирования синдрома афазии-эпилепсии, полученная путем трансформации мышей CBA×C57BL/6 плазмидной конструкцией по п.1, содержащая в гене grin2a инсерцию 3974insT и несущая последовательность SEQ ID NO: 1.

3. Способ получения линии мышей по п.2, содержащих инсерцию 3974insT в гене grin2a, созданную с использованием плазмидной конструкции по п.1, характеризующийся следующими стадиями:

а) микроинъекция конструкции px330+GRIN2Asg из п.1 в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки мыши гибрида F1 CBA×C57BL/6;

б) выявление жизнеспособных зигот;

в) пересадка выживших зигот из стадии (б) псевдобеременным самкам-реципиентам, имеющим копулятивную пробку после ссаживания с вазэктомированными самцами;

г) получение новорожденных мышей на 19 день после пересадки зигот из стадии (в);

д) проведение анализа наличия мутации через 8-14 дней после рождения мышей (г), путем амплификации целевого участка гена grin2a с праймерами SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 с последующим секвенированием фрагмента;

е) отбор мышей, несущих целевую мутацию;

ж) проведение скрещивания мышей из стадии (е) с мышами дикого типа для получения самок-гетерозигот или мутантных самцов, несущих целевую мутацию.

з) проведение скрещивания мышей из стадии (ж) для получения итоговой линии мышей, несущих инсерцию 3974insT в гене grin2a.