СПОСОБ БИОВОССТАНОВЛЕНИЯ ДЛЯ УСКОРЕННОГО БИОЛОГИЧЕСКОГО РАЗЛОЖЕНИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ НЕФТИ В ПОЛЯРНЫХ РЕГИОНАХ, ПОКРЫТЫХ МОРСКИМ ЛЬДОМ, И СМЕСЬ БАКТЕРИЙ И ФЕРМЕНТОВ В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ СПОСОБА Российский патент 2011 года по МПК C02F3/34 C12N1/26 

Изобретение относится к способу биовосстановления для ускоренного биологического разложения углеводородов нефти в полярных регионах, покрытых морским льдом, путем биоприращения экзогенных бактерий, разлагающих углеводороды, и добавления питательных веществ, а также к смеси бактерий и получаемых из них ферментов для разложения углеводородов в качестве средства для осуществления способа.

Увеличивающееся истощение выгодных в данный момент месторождений нефти (углеводородов нефти) ведет в настоящее время к обращению к экстремально расположенным местам нефтеразведки. При этом дополнительно в сферу интересов вступают арктический океан с его окраинными морями, области арктического шельфа и арктические приполярные области, где предполагается около 25% находящихся на земле нефтяных и газовых месторождений. В некоторых местах нефть уже добывают в незначительных количествах.

Центральный арктический океан весь год частично покрыт толстым морским льдом и в арктических окраинных морях или областях шельфа и прибрежных областях обнаруживают дрейфующий лед или сплошное покрытие морским льдом по меньшей мере в холодное время года. Добывающие платформы, которые установлены непосредственно в указанных областях, подвергаются особому напряжению из-за дрейфа льда. Дополнительную проблему представляет усталость материала из-за очень низких температур. Это имеет значение, например, для подводных нефтепроводов, которые ведут до рабочих мест судна в области шельфа. Транспортировка нефти судами через лед таит в себе повышенную опасность, так что риск загрязнения нефтью или аварии судна в указанной области явно выше, чем в умеренных или тропических широтах. Наряду с единичными нефтяными загрязнениями, в частности благодаря несчастным случаям и авариям, в полярных ледовых регионах существует также большая опасность непрерывных нефтяных загрязнений, например, благодаря добыче нефти на добывающих платформах или транспортировке нефти при загрузке или утечке в треснувших трубопроводах.

До сих пор мероприятия по устранению нефти в свободной воде в полярных ледовых регионах проводились только в ограниченных (масштабах), так как распределение нефти во льду значительно отличается от (распределения) в воде. Подобно воде ведет себя только ледяная каша. При разработке способа устранения нефти в регионах, покрытых морским льдом, проблемы создают различные соотношения (типов) льда. Не существует однородного ледяного покрытия и поэтому общего способа, который может быть применен на льду. Свойства льда варьируются от ледяных пластинок, ледяной каши через ледяные блинчики, ледяные глыбы до сплошного ледяного покрытия. Мероприятия по устранению нефти зависят не только от консистенции льда, величины льдин и толщины льдин, а также и от динамики ледяного поля, погоды и волнения воды между льдинами. Нефтяной ковер может располагаться подо льдом, замазывать льдины, вмерзать в лед или гомогенно смешиваться с ледяной кашей. Вообще считают, что как только нефть касается льда, разделение нефти и льда становится очень трудным. Проще еще, если нефть концентрируется между ледяными глыбами в воде, хотя и тогда могут быть использованы не все способы, обычные в воде, поскольку большинство устройств не могут маневрировать в области скопления льдов (например, барьеры для нефти).

Уровень техники

До сих пор не было известно небольших или больших аварий в областях, покрытых морским льдом. Но поскольку риск нефтяных загрязнений увеличивается и сила самоочищения указанной экосистемы вследствие господствующих очень низких температур, как известно, явно меньше, чем в других местах, всегда более срочна разработка мероприятий и способов очистки нефтяных загрязнений в областях, покрытых морским льдом. В сообщении EU-проекта ARCOP, публикация I от июля 2004 (ARCOP D4.2.1.1 (a), часть 4 "Oil spill respons-present alternatives for ice covered water", стр.29-88) исчерпывающе изложено современное состояние техники защиты от нефти в областях, покрытых льдом. Представлены возможные способы (смотри ниже), а также их недостатки и преимущества. Некоторые предложенные способы и устройства до сих пор испытаны (изучены) в малых масштабах, но для серьезного применения они еще не подходят.

- Механические способы, которые все основаны на одном способе "принцип мойки", составляют большую часть упомянутых способов устранения нефти. Указанные способы служат однако только для очистки мелких ледяных глыб. Остатки нефти остаются во льду. Все механические принципы наносят сильный вред биологии окружающей среды, большей частью совершенно ее разрушают. Регенерация протекает крайне медленно.

- Выжигание нефти во льду, так называемое "сжигание in situ", представляет собой способ, который может быть использован только при незначительном и при очень высоком ледяном покрытии. Доля нефти во льду должна составлять 25%, чтобы нефть удалялась выжиганием. Устранение нефти происходит быстро и эффективно. Недостатком способа является образующееся тепло, которое полностью уничтожает экосистему, так что после него не остается перспективы природного биологического расщепления остаточных загрязнений. Кроме того, излучения и остатки от сгорания при последующем удалении от места сжигания могут оказывать токсическое действие.

- Химические способы могут быть использованы во льду только при условии отсутствия эффективного перемешивания. Это бывает только тогда, когда в турбулентной воде находится мало льдин. Кроме того, многие химические диспергаторы токсичны и поэтому большей частью запрещены в Германии. Кроме того, нефть в действительности не удаляется, а только возникает проблема, как лучше распределить диспергированную нефть.

- Биологические способы теоретически применимы во льду, однако практически до сих пор не принимались во внимание, так как специалисты считали невозможным эффективное биологическое разложение нефти из-за низких нефизиологических температур во льду. Хотя могло быть установлено незначительное завершение разложения углеводородов во льду, однако при этом речь шла только о разложении короткоцепных алканов (см. публикацию II B.Gerdes и др. Influence of crude oil on changes of bacterial communities in Arctic sea-ice FEMS Microbiology Ecology 53 (2005), стр.129-139). Засевание вместе с разложением нефти во льду равным образом представляет собой проблему, так как условия температуры и солености не только является экстремальными, но также и сильно варьируются.

Вообще биологические способы, также называемые способами биовосстановления, представляют собой весьма благоприятные для окружающей среды способы, которые на современном уровне техники ежедневно используют в теплых местах, в частности, для санации почвы. При этом разлагающие нефть культуры микробов природного происхождения путем внесения питательных веществ, которые служат для ликвидации дефицита азота и фосфата, способствуют их развитию и ускоряют природный процесс разложения. До сих пор указанную технологию успешно применяли не только в почвах, но также и в прибрежных водах, даже в холодных водах, например, при аварии Exxon-Valdez в арктических водах побережья Аляски. Наряду с подачей питательных веществ проводили эксперименты также с добавлением бактерий, разлагающих нефть. Правда, указанный способ засевания до сих пор применяли только в закрытых устройствах или резервуарах (способы ex situ, например, для санации выемки почвы) и его не испытывали в природе. Если применяли посторонние, то есть не живущие в загрязненном месте типы бактерий, они большей частью не могли бы иметь успех по сравнению со специфически приспособленной местной флорой (см. публикацию III Zhu и др. Literature review on the use of commercial bioremediation agents for cleanup of oil-contaminated estuarine environments" Bericht EPA/600/R-04/075, июль 2004). Причем, как правило, использовали только отдельные типы бактерий, разлагающих углеводороды, например, из рода Pseudomonas (DE 3811856 C2), Bacillus (DE 19652580 A1) или Acetobacter (DE 4443266 A1). В лучшем случае это приводило к кратковременному ускорению разложения. Примерно через 2 недели высеянные организмы зарастали местной флорой.

В японских рефератах JP 2004181314 A и JP 200607542 A описано применение смесей природных бактерий для санации почвы. В отличие от морского льда почвы относительно гомогенны и имеют стабильный характер, в которых организмы не так сильно подвергаются физико-химическим перепадам, как в морском льду, кроме того, внесенные бактерии не могут так легко вымываться. Далее из патента ЕР 0859747 В1 известен способ аэробного биологического разложения трудно растворимых в воде веществ, в котором используют культуру термофильных микроорганизмов IHI-91 (DSM 10561). Указанный штамм имеет большое сходство с родом Bacillus. К области защиты европейского патента относятся также сами микроорганизмы IHI-91 и получаемая из них композиция ферментов для целей биологического разложения. В уже названном выше патенте DE 19652580 A1 приведена еще "бактериальная смесь" для регенерации почв и вод, загрязненных нефтью и/или нефтепродуктами. Наряду с родом бактерий Bacillus используют также неспецифическую, образующуюся при гидролизе микробиомассы (отходов) смесь "Biosurfactant BS-4", для которой неясно, содержатся ли в ней другие типы бактерий. Но на основании полного химического гидролиза приходят к тому, что речь большей частью идет о смеси веществ при участии одного единственного рода бактерий. Наконец, из патента DE 19954643 A1 известно получение и применение средства, связывающего нефть, для удаления масел и жиров всех видов с водных и твердых поверхностей. Микроорганизмы иммобилизовывали их в виде гранулята на белке, образующем волокна. При этом речь может идти о Pseudomonas putida, Pseudomonas spec., Acinetobacter calcoaaceticus, Nocardia spec., Corynebacterium spec., Candida lipolytica, Candida tropicalis, Rhodopseusomonas palistris или Rhodococcus spec. Была ли смесь бактерий иммобилизована, не было уточнено. Кроме того, не было дано специальных указаний для выбора названных микроорганизмов. Все названные примеры проведения не охватывают иммобилизации микроорганизмов.

Однако все вышеназванные публикации объединяет то, что они описывают биологическое разложение нефти бактериями различных родов и видов только при нормальных или даже повышенных (термофильные бактерии) температурах окружающей среды, но не при низких температурах (по определению адаптированные к холоду организмы бактерий, минимум температуры роста которых лежит при 0°С или ниже, причем различают группы адаптированных к холоду бактерий на так называемые "психрофильные организмы" с максимумом температуры роста ниже 20°С и "психротолерантные организмы" с максимумом температуры роста выше 20°). Из патента DE 102005028295 A1 известно только применение психрофильных протеаз из рода Shewanella для удаления биопленок с твердых поверхностей. Но указанные применения не подходят для низких температур или температур ниже температуры замерзания. Более того, исходят из того, что путем использования психрофильных протеаз удаление загрязнений и биопленок должно производиться при температурах до 37°С, в интервале от 15 до 20°С (см. абзацы c [006] до [008]). Удаление биопленок в условиях морского льда не очевидно.

Морской лед с его экстремально низкими температурами и сильно меняющимся содержанием солей скорее является неблагоприятным для жизни местом, которое специалисту кажется не приспособленным для способа биовосстановления. До сих пор единственный эксперимент биовосстановления в морском льду был опубликован Delille и др. (Публикация IV: "Seasonal Variation of Bacteria in Sea Ice Contaminated by Diesel Fuel and Dispersed Crude Oil", Microb. Ecol. (1997) 33, стр.97-105). Антарктический морской лед был загрязнен арабской сырой нефтью или дизельным топливом и часть испытуемого поля удобряли органическим комплексом питательных веществ INIPOL EAP 22. В удобренных, а также конечно в неудобренных загрязненных нефтью испытуемых полях наблюдали приращение микроорганизмов по сравнению с контролем. Остается недоказанным, происходит ли при этом разложение нефти, как сильно и какие компоненты исчезают. Организмы, находившиеся после внесения нефти и питательных веществ, не были выделены и охарактеризованы. Конечно, прибавление микроорганизмов указывает на то, что нефть на части скопления морского льда по крайней мере не действует токсично.

Как уже упомянуто, применению способа биовосстановления в морском льду противостоят господствующие в нем неблагоприятные для жизни условия, то есть очень низкая температура с частично очень высокой соленостью, а также сильной изменчивостью температурных условий и солености в зависимости от профиля льдин и времени года. Рост микробов и активность для адаптированных к холоду бактерий в интервале температур от примерно -5 до -3°С, которая господствует под областью льда (на границе вода/лед), незначительны и в области поверхности льда (разность температур от примерно +1°С летом до ниже -20°С зимой) ограничены только коротким летним сезоном. Морской лед засевают специфическими узкоприспособленными к месту сообществами микроорганизмов. Так как полярный морской лед до сих пор едва ли сталкивался с нефтью, появление и быстрое развитие природной флоры, разлагающей углеводороды в случае нефтяного загрязнения, до сих пор для специалиста мало вероятно. С одной стороны, указанные факты говорят против применения способа биовосстановления во льду, но, с другой стороны, биологические способы по сравнению с физико-химическими способами дают в морском льду много преимуществ. Они могли бы применяться как бы при любой ледовой обстановке и любом виде загрязнения нефтью, то есть находится ли нефть на льду, подо льдом или в свободной воде. Дополнительно не надо было бы заботиться об однажды внесенных питательных веществах и организмах и, наконец, в трудно доступных областях не было бы необходимости оставаться в окрестностях для проведения мероприятий по борьбе, а можно было бы после обработки предоставлять систему самой себе.

В уровне техники не предложено конкретного способа биовосстановления для разложения нефти в областях морского льда (см. публикацию I, стр.88, часть 5.6). Однако в публикации V B.Gerdes и др. (WP4 Environmental Protection, Biological degradation of crude oil in Arctic sea ice, ARCOP Workshop 8, 19-20 окт. 2005, Санкт-Петербург) указано на возможность способа биовосстановления для ускорения аэробного процесса разложения путем биоприращения экзогенных микробов и/или прибавления питательных веществ и/или кислорода в полярные ледовые регионы. В качестве лимитирующих факторов для разложения были названы питательные вещества, доступность кислорода, температура, микроэлементы, такие как железо, соленость и значение pH, растворимость и размер нефтяных капель. Однако указывается, что в период арктической зимы при температурах -3°С не происходит заметного разложения нефти ни при удобрении питательными веществами, ни при инокуляции, причем при 0°С в пробах растаявшей воды, удобренной неорганическими веществами, обнаруживают заметное изменение разнообразия бактерий.

В названной публикации V, которая является ближайшим аналогом в технике по отношению к настоящему изобретению, также заключают, что проведение способа биовосстановления для ускоренного биологического разложения углеводородов нефти в полярных ледовых регионах возможно путем биоприращения бактерий, разлагающих углеводороды, добавлением питательных веществ при температурах выше точки замерзания. Ниже точки замерзания биоразложение кажется остановленным. Однако дальнейшие указания по поводу способа биовосстановления и о подходящих смесях бактерий в качестве средства для проведения способа не сделаны.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ

Поэтому задача предлагаемого изобретения усматривается в том, чтобы ранее описанные согласно видам способы биовосстановления усовершенствовать таким образом, чтобы биологическое разложение углеводородов происходящего загрязнения, в частности, в виде нефтяных загрязнений небольших масштабов в условиях полярных ледовых регионов, в частности, ниже точки замерзания, и в различных местах (региональных и локальных) происходило надежно, по возможности быстро и в достаточной степени. При этом усовершенствованный способ биовосстановления должен быть простым и дешевым при его осуществлении и (должен предусматривать) возможность минимальных людских затрат в экстремальных ледовых регионах. Одновременно должно быть предложено предпочтительное средство для проведения способа биовосстановления, применением которого можно особенно повысить эффективность способа биовосстановления. Предложенное решение указанной задачи следует извлечь из способа и сопутствующих средств, описанных в формуле изобретения. Выгодные усовершенствования указаны в соответствующих подпунктах и в дальнейшем прояснены в соответствии с изобретением.

В предложенном способе биовосстановления использовали предложенную смесь из нескольких адаптированных к холоду аутохтонных штаммов бактерий. Причем каждый использованный штамм бактерий обнаруживал другую область температур и солености, другой спектр разложения, другую активность разложения, а также другую способность эмульгирования нефти. Благодаря указанной комбинации различных типов штаммов бактерий возникает дополнительная смесь бактерий крайне широкого спектра действия, которая может осуществлять биологическое разложение широкой палитры углеводородов нефти при различных условиях морского льда и различных видах загрязнений. При этом использованные адаптированные к холоду штаммы бактерий варьируют по их областям температуры и солености, чтобы способ биовосстановления был эффективен при всех температурах, наступающих в природных условиях. Но все штаммы бактерий в смеси объединяет то, что они также еще проявляют активность (разложение или образование эмульгаторов) при -3°. Разложение нефти при столь низкой температуре поразительно для специалиста и на современном уровне техники еще никогда не было документировано. По этой причине до сих пор применение способа биовосстановления в полярных регионах с морским льдом считалось неэффективным.

Смесь бактерий, использованная при предложенном способе биовосстановления, имеет не только более широкий спектр разложения, чем отдельные организмы, но также реагирует лучше при колебаниях в экосистеме, что важно при весьма изменчивых условиях во льду. Благодаря широкому спектру действия смеси бактерий могут обеспечивать удаление нефтяных (остаточных) загрязнений более малого масштаба как в морском льду, так и в плавильной литниковой чаше и в ограниченной воде путем биоприращения по сравнению с использованием отдельного инокулята. Причем использовали смесь бактерий в высоких концентрациях, чтобы компенсировать медленную регенерацию и воспроизведение во льду.

Обычно смесь бактерий можно получить комбинированием штаммов бактерий, которые концентрируют в мезокосмических экспериментах в период времени от 12 до 36 месяцев и затем выделяют. Мезокосмос составляли со льдом возможного места разложения, искусственно загрязняли сырой нефтью, снабжали питательными веществами и инкубировали при -3°С таким образом, чтобы соотношение лед-вода оставалось постоянным. Причем не требовалось, чтобы для каждого случая применения способа биовосстановления после ранее проведенного способа выделяли специальный штамм бактерий. Более того, в примерных мезокосмических экспериментах получали и сохраняли множество подходящих штаммов бактерий. Для актуального случая применения для способов биовосстановления затем можно было в соответствии с условиями введения, прежде всего способа введения, комбинировать отдельные подходящие штаммы бактерий в смесь бактерий. Таким образом, оказывается возможным ускоренное взаимодействие нефтяных загрязнений путем применения способа биовосстановления согласно изобретению. Штаммы бактерий, полученные указанным образом, дополняются в их физиологических свойствах и в состоянии в смеси разлагать нефть в типичных для морского льда сильно меняющихся условиях температуры и солености. Путем прибавления других штаммов бактерий, разлагающих нефть, и/или внесением ферментов из указанных адаптированных к холоду микроорганизмов, разлагающих углеводороды, можно сделать способ биовосстановления согласно изобретению еще эффективнее, более гибким и более широко применимым.

Путем предпочтительного способа получения смеси бактерий обеспечивали использование в основном аутохтонных, что означает природного происхождения, штаммов бактерий. Причем способ биовосстановления по изобретению наряду с устранением более малых нефтяных загрязнений, в частности, остаточных загрязнений после проведения механических мероприятий по борьбе с нефтью или "выжигания in situ", вследствие которых происходит разрушение природной флоры морского льда, служит для компенсации этого разрушения засеванием смесью бактерий, разлагающих нефть. Применением аутохтонных бактерий морского льда достигают восстановления природной микрофлоры после успешной механической и/или физической обработки морского льда. При этом способ биовосстановления согласно изобретению в наибольшей степени благоприятен для окружающей среды. Он удаляет нефтяные загрязнения и одновременно регенерирует природную микрофлору. Кроме того, в нем используют носители, благоприятные для окружающей среды.

Способ биовосстановления согласно изобретению штаммами бактерий, отданных на хранение в DSMZ - Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, 38124 Брауншвейг, Германия - особенно предпочтителен в случае загрязнений в арктическом морском льду и в случае нефти, богатой алифатическими соединениями. Речь идет о новых по отношению к известным штаммам бактерий, таксономически разграниченных штаммах бактерий с явно другой физиологией. Нахождение указанных специфических микроорганизмов в морском льду до нынешнего времени не предполагалось. Но способ не ограничен указанной смесью бактерий, а может быть расширен добавлением других выгодных для названного способа штаммов бактерий, которые более специализированы для разложения ароматических углеводородов (полиароматических углеводородов) или тяжелых нефтей. Также при загрязнениях в антарктической области, где в соответствии с системой антарктической совместимости применимы только аутохтонные антарктические бактерии, в соответствии со способом могут быть использованы выгодные аутохтонные штаммы бактерий. Путем применения адаптированных к холоду ферментных композиций из изолированных штаммов бактерий употребление способа биовосстановления согласно изобретению еще шире, так как физико-химические условия более не оказывают столь сильного влияния, как в случае интактных микроорганизмов. При использовании адаптированных к холоду ферментных композиций способ может применяться во всех холодных пресноводных внутренних областях, таких как морские, пелагические, такие как бентонитные, то есть во всех антарктических местах распространения, а также в арктических глубоководных отложениях, где активны, в частности, специфические бактерии, адаптированные к высокому гидростатическому давлению, и даже на вечной мерзлоте.

Благодаря специфической композиции инокулята способ биовосстановления согласно изобретению может быть использован индивидуально в специфических условиях. Причем способ может быть применен один раз и инокулят может быть внесен один раз после несчастного случая. Затем он действует без необходимости личного присутствия in situ, даже если, например, засеянные льдины были загружены объемно. Но возможно также осуществление последующего регулирования дополнительным засеванием такими же или другими микроорганизмами (например, для расщепления полиалифатических углеводородов) или внесением дополнительных питательных веществ. Последующее засевание зависит от качества и количества расщепляемых углеводородов, а также от условий окружающей среды и должно употребляться различно от случая к случаю.

Дополнительные выгодные дальнейшие усовершенствования способа биовосстановления согласно изобретению следует брать из специальных частей описания. Специально в этом месте должны быть названы иммобилизация инокулятов на специальных носителях и способ внесения инокулятов в случае применения. Комплексная смесь бактерий была иммобилизована на носителе, благоприятном для окружающей среды, который предпочтительно снабжали неорганическими питательными веществами, или он сам служил питательным веществом. Соответственно загрязнению и соотношению льда применяли плавающий или не плавающий, гидрофильный или гидрофобный носитель, а также носитель, связывающий нефть. Его можно наносить прямо на морской лед, на прилегающую воду или также под морской лед. Внесение инокулята на поверхность льда можно осуществлять с корабля, из распылителя или с самолета. Равным образом возможно также внесение под лед путем впуска или закачивания в столб воды подо льдом. Таким образом достигается неограниченное проведение способа биовосстановления согласно изобретению, как при механических (только при малых льдинках) и физических способах (только при плотном ледяном покрытии или почти открытой воде). При использовании вертолета удается также внесение инокулятов при тяжелой ледовой обстановке, например, при плотном ледяном покрытии и при обратном образовании льда.

ПРИМЕР ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Далее подробнее объяснены формы осуществления предложенного способа биовосстановления для ускоренного биологического разложения углеводородов нефти в полярных ледовых регионах и предложенные смеси бактерий в качестве средства проведения способа.

При этом в Таблице 1 показан выбор подходящих штаммов бактерий для предпочтительной смеси бактерий, причем первые шесть штаммов бактерий могут быть соединены в образующую основу смесь бактерий, которая прибавлением пяти далее названных штаммов бактерий может быть приспособлена к специальному случаю применения и таким образом может быть дополнительно улучшена ее разлагающая активность.

В Таблице 2 показано разложение алифатических компонентов сырой нефти (0,2%) в прослойке воды (gap water) и в арктическом морском льду мезокосмической структуры предпочтительной смесью бактерий.

Чтобы обеспечить возможность применения способа биовосстановления согласно изобретению, отрабатывали несколько последовательно проводимых стадий способа, лежащих в основе подготовленных и изложенных типов. При этом лежащие в основе и подготавливаемые стадии способа могли выпадать, если для специального случая применения уже имелись подходящие изолированные штаммы бактерий или инокуляты.

- Обогащение и выделение специальных штаммов бактерий, которые эмульгируют нефть в стабильных условиях морского льда, то есть при температурах -3°С, и за сравнительно короткое время разлагают ее компоненты.

- Комбинирование различных типов штаммов бактерий, выделенных из морского льда, таким образом, чтобы получить дополненную смесь бактерий, которая осуществляет возможно наилучшее ускоренное разложение возможно более широкой палитры компонентов сырой нефти в различных условиях морского льда.

- Изготовление достаточно активной биомассы из выбранных штаммов бактерий.

- Получение инокулята иммобилизацией активной биомассы вместе с подходящими питательными веществами на носителе.

- Внесение инокулята для контактирования с подлежащими разложению углеводородами нефти.

Для выделения подходящих штаммов бактерий добывали, например, в случае различных ледяных кернов многолетнего морского льда между сентябрем и октябрем (лето), а также между апрелем и маем (зима) в области северо-востока Шпицбергена (от 79 до 81° N и от 5 до 12° Ost). Аналогично испытывали антарктический морской лед из моря Беллинсгаузена (66-71°CS и 275-290°W) в (период) от апреля до мая (осень). В отечественной лаборатории стерильный стеклянный сосуд в стерильных условиях наполняли примерно 5 литрами мелко раздробленного льда вместе с 10 литрами стерильной полярной воды. На плавающем льду распределяли свежую или хранящуюся сырую нефть (0,1%). Различные мезопространства содержали различные питательные вещества:

- Inipol MS3000

- рыбная мука

- неорганические питательные вещества, состоящие из: Na₂PO₄ 0,065 гл^-1, NaNO₃ 0,75 гл^-1, следы FePO₄.

Эксперименты инкубировали в течение 36 месяцев при -3°С. Параллельные эксперименты с растаявшим льдом выдерживали при +4°С. Через полгода первый раз отбирали пробный материал, последовательно разбавляли и 100 мкл отдельных стадий разбавления наносили штрихами на минимальный агар-агар. На пластинке из агар-агара заранее было распределено 20 мкл сырой нефти. Пластинки инкубировали при +4°С, пока колонии не становились видимыми. Их кололи и повторяли нанесение штрихами до образования чистых культур. Различные штаммы таксономически группировали с помощью ARDRA (Amplified rDNA Restriction Analysis) и определяли последовательности генов 16S рРНК в каждой группе. После этого исследовали типы по их физиологическим характеристикам, и таким как поведение в зависимости от температуры и потенциал разложения углеводородов. Неожиданно удалось открыть новые адаптированные к холоду типы бактерий, которые разлагают углеводороды при -3°С. Сходство последовательности гена 16S рРНК штамма с примененными последующими типичными штаммами показано в Таблице 1.

Предпочтительно могли быть использованы шесть различных типов бактерий, которые отличаются от ранее известных микроорганизмов. Прибавление указанных штаммов бактерий осуществляли предпочтительно в одинаковых долях. Смотря по случаю применения преимущественно развивались штаммы бактерий, работающие наилучшим образом. После этого поразительным образом путем сопоставления различных типов бактерий с различными температурными допусками и допусками солености, а также различными потенциалами разложения получали, наконец, смесь бактерий, которая в совокупности в состоянии развиваться в различных ледовых условиях, эмульгировать нефть и разлагать ее в приемлемое время.

Указанные в Таблице 1 штаммы бактерий хранятся в DSMZ. Их можно хранить или консервировать в качестве растущих культур штаммов в трубочках в 10 мл минимальной среды (KNO₃ 0,75 г, NH₄Cl 0,75 г, экстракт дрожжей 0,1 мг (Difco), следы FePO₄ в 1 л 50% арктической морской воды) плюс 20 мкл сырой нефти в течение примерно полугода при 1°С (например, MAST Cryobank System, -80°C или сушка вымораживанием). Для применения или засевания разведения (культур) следовало использовать штаммы из консервированного материала или применять культуры штаммов. Если использовали консервированный материал, его сначала следовало рекультивировать в (смеси) морская вода-питательная среда (5 г Bacto Pepton (Difco), 1 г экстракта дрожжей (Difco) и следы FePO₄ в 1 л 50% арктической морской воды или морской питательной среды 2216 (Difco)) при 4°С, в случае штаммов бактерий GH-10 (DSM 18952) и GH-11 (DSM 18953) должна была быть использована 10-кратно разбавленная (смесь) морская вода-питательная среда и добавлено 0,1% стерильной сырой нефти. Как только происходил достаточный рост (в зависимости от штамма он продолжался от примерно 2 дней до 1 недели), указанными культурами засевали больший объем (от 500 мл до примерно 10 л) минимальной среды (KNO₃ 0,75 г, NH₄Cl 0,75 г, экстракт дрожжей 0,1 мг (Difco), следы FePO₄ в 1 литре 50% арктической морской воды) плюс 0,2% (об./об.) нефти. Штаммы выделяли отдельно при встряхивании (100 об/мин) при 4°С до густоты клеток по меньшей мере 1×10⁹ клеток на мл (примерно 1 неделя). Прибавлением сырой нефти штаммы настраивали на разложение углеводородов.

При способе биовосстановления согласно изобретению использованные микроорганизмы и/или полученные из них ферментные композиции иммобилизовывали с помощью носителей и наносили в место загрязнения. Для оптимального разложения углеводородов необходимо снабжение микроорганизмов источниками азота и фосфата. Чтобы питательные вещества и микроорганизмы вместе попадали на место загрязнения и оставались там, должны быть введены подходящие носители, благоприятные для окружающей среды. При выборе носителей принимали во внимание различные сценарии загрязнения морского льда. Вводили как гидрофобные, так и гидрофильные материалы, которые являются плавучими или не плавучими. Рекомендуется, чтобы смесь бактерий наносилась иммобилизованной не только на одном, а также по меньшей мере на двух различных носителях, чтобы можно было обеспечить различные места применения. Предпочтительно можно использовать следующие носители:

Носитель 1:

Носитель 1 на основе материалов, описанных, в частности, в US-PS 5954868, состоял из ядра питательных веществ, например, NH₄H₂PO₄ и FeSO₄ в отношении аммоний/фосфат/железо 90:8:2 и был обернут олеофильными компонентами, такими как насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты (например, масляная кислота, стеариновая кислота и/или пальмитиновая кислота). Носитель 1 является олеофильным и плавучим, органические компоненты скомбинированы с неорганическими и после применения не оставляют никаких остатков.

Носитель 2:

Носитель 2 на основе "Bio-Sep-Technologie" (университет Tulsa, OK 74104, США) представлял собой шарики 3-4 мм в диаметре, которые были получены из 25% арамидного полимера (Nomex) и 75% активированного угля (РАС) и имели пористость 75%. Средний диаметр пор составлял 1,9 мкм. Шарики окружены мембраной, подобной мембране для ультрафильтрации. Питательные вещества высасывались из шарика, организмы поселялись внутрь шарика. Шарики применяли для санирования грунтовой воды, Носитель 2 является олеофильным и плавучим, в нем могут быть использованы как органические, так и неорганические питательные вещества. Его недостатком является то, что арамид представляет собой пластмассу и после введения может оставаться в экосистеме.

Носитель 3:

Носитель 3 на основе немецкой выложенной заявки DE 19954643 A1 базируется на средстве, связывающем масло, из белков, образующих волокна. Материал загружали питательными веществами, он абсорбирует масло и является плавучим и поэтому предпочтительно применим, если имеется свободная вода или нефть находится подо льдом.

Носитель 4:

Носитель 4 основан на рыбной муке, которая смешана с эфиром полиоксиэтиленовой жирной кислоты 80 (полисорбатом 80) (моноолеат полиоксиэтиленсорбита, торговое название также Tween^® 80), который применим в качестве неионного поверхностно-активного вещества в косметике, лекарственных средствах, кормах и, в частности в качестве эмульгатора в продуктах питания. Полисорбат действует эульгирующе, так что нефтяные загрязнения оседают на носителе. Носитель 4 особенно подходит для загрязнений на поверхности морского льда, а также внутри морского льда.

Носитель 5:

Носитель 5 основан на опилках (диаметр частиц 0,3-1 мм), которые пропитаны питательными веществами (NH₄H₂PO₄ 0,065 гл^-1, NaNO₃ 0,75 гл^-1 и следы FeCl₃). Опилки гидрофильны и поэтому не плавают в воде и поэтому указанный носитель 5 особенно подходит для небольших загрязнений на поверхности льда, а также внутри морского льда, так как опилки могут проникать в более глубокие слои льда.

Для иммобилизации клеток отдельные опыты большого объема (в минимальной среде с нефтью) соединяли с различными штаммами бактерий в стерильном сосуде и перемешивали. После этого смесь снова распределяли в таком большом сосуде, какой должен быть использован в случае различных носителей. На 1 литр смеси прибавляли 20 г стерильного носителя и композицию качали в течение 3 дней при 4°С (90 об/мин), чтобы клетки получили возможность прикрепиться к носителю. После этого согласно способу внесения носитель может быть отделен от питательного раствора. Так материал может быть распределен на льду. Он может быть разбрызган, напылен, налит или также закачен под лед, смотря по тому, какой имеется в распоряжении и о каком случае речь идет в способе применения. При разбрызгивании не рекомендуется отделять носитель от питательного раствора, а распылять их вместе. Отдельные способы введения должны подбираться в зависимости от материала носителя. В совокупности для защиты адаптированных к холоду микроорганизмов рекомендуется, чтобы инокулят никогда не хранился или использовался выше температуры холодильника (+7°С). Вышеуказанной температуры микроорганизмы могли повреждаться и, например, их разлагающая активность могла значительно уменьшаться.

Для случая нефтяной аварии на большой площади наносили большие количества биомассы, чтобы сначала достичь масштабирования выращивания. Чтобы при остром случае нефтяной аварии можно было бы быстро реагировать, клеточную массу готовили для введения сушкой вымораживанием или охлаждали с антифризом. При этом следует принимать во внимание, что способ консервирования вреден для части клеток. Законсервированные клетки поэтому реактивировали перед внесением в короткой трехдневной инкубационной фазе в минимальной среде сырой нефтью.

Хотя в других местах распространения засевание разлагающими нефть микроорганизмами до сих пор оставалось в большой степени безуспешным и враждебные для жизни области морского льда, собственно говоря, являются неподходящим местом для биовосстановления и биоприращения, при применении способа биовосстановления согласно изобретению в загрязненных нефтью мезокосмических структурах морского льда и в прослойке воды (типичный жидкий слой в антарктическом летнем льду) показано - как описано в последующих примерах - четкое разложение также длинноцепных алифатических компонентов нефти. Результаты далее проведенных показательных примеров представлены в Таблице 2.

Показательный Пример 1

Стружки, загруженные минимальной средой и смесью бактерий морского льда, разлагающих нефть, вносили в прослойку воды, которая образовалась в антарктическом морском льду и которая была искусственно загрязнена сырой нефтью. Через полгода в результате применения способа биовосстановления согласно изобретению все алканы вплоть до малой доли сильно длинноцепных алифатических соединений полностью разложились. В сравнительных композициях с питательными веществами или без питательных веществ четко устанавливали от незначительного до полного отсутствия разложения.

Показательный Пример 2

В мезокосмическом эксперименте поверхность арктического морского льда (зимний эксперимент) или антарктического морского льда (лето) загрязняли нефтью из Баренцева моря с высокой долей алифатических соединений. Сверху нефтяного загрязнения распределяли разлагающие нефть бактерии, иммобилизованные на рыбной муке. При указанной композиции происходило разложение сырой нефти с использованием способа биовосстановления согласно изобретению, тогда как на необработанном загрязненном нефтью льду устанавливали отсутствие разложения.

Для преобразования способа биовосстановления согласно изобретению могут быть описаны следующие варианты:

Вариант 1

Он подходит к нефтяной аварии, при которой углеводороды в больших количествах попадают в область, покрытую морским льдом, большие количества нефти в ледовых условиях могут быть удалены с помощью физических или механических способов. Хотя после применения указанных способов устраняли большие количества нефти, во льду оставались остатки углеводородов и оставалась разрушенная экосистема, так что разложение углеводородов более не могло осуществляться ранее существовавшими во льду природными организмами. Путем внесения смеси организмов и питательных веществ согласно изобретению можно быстро запустить биологический процесс разложения, так что и остающиеся углеводороды могут быть полностью удалены в приемлемый промежуток времени. Внесение смеси бактерий с питательными веществами в качестве носителей можно производить орошением из распылителя или с вертолета на большие площади льда, а также на водные поверхности между льдинами. Гидрофобный носитель отлагается на имеющихся углеводородах, благодаря чему происходит непосредственный контакт с микроорганизмами и питательными веществами. Дополнительный процесс разложения нефти происходит без любого дополнительного действия, то есть льдина не нуждается в дополнительном контроле. Это особенно важно, так как льдины очень быстро дрейфуют и раскалываются, (сталкиваясь) друг с другом.

Вариант 2

Он подходит к загрязнению углеводородами в небольших объемах; при этом действуют подобным образом, как выше, но только не должна производиться предварительная очистка с помощью физических или механических способов.

Вариант 3

Он подходит к утечке, например, в нефтепроводе, который проходит по морскому дну в водах, покрытых льдом (так, как уже практикуют в областях арктического шельфа, которые зимой и осенью покрыты льдом), нефть поднимается вверх через столб воды и собирается подо льдом, где быстро внедряется в лед и путем дрейфа льдин может загрязнять большие пространства. Нефть весной через трещины и солевые каналы во льду поднимается на поверхность. Путем внесения носителя с бактериями и питательными веществами в рамках способа биовосстановления согласно изобретению гидрофобный носитель контактировал в столбе воды подо льдом с нефтью и внедрялся в лед, так что разложение углеводородов могло начаться уже в столбе воды. Вышеописанный носитель вместе с нефтью поднимался на поверхность льда. Преимущество указанного применения состоит в том, что смесь бактерий сначала вносили после аварии, а затем (она) работала in situ, даже если льдина дрейфовала в пространстве.

Таблица 1 Обозначение штамма DSMZ-номер хранения, дата сдачи на хранение Характеристика Сродство^*) Источник Rodococcus GH-1 Широкий спектр 98% R. yunna- Арктический DSM 18943 разложения nensis летний лед DSMZ 22.12.2006       Dietzia GH-2 Широкий спектр 99,5% D. maris Арктический DSM 18944 разложения, широкий спектр   зимний лед DSMZ 22.12.2006 температур и солености     Shewanella GH-4 Ограниченный спектр разложения 98% S. livingstonensis Арктический летний DSM 18946 короткоцепных алканов, но очень быстрый рост при очень холодных температурах   лед DSMZ 22.12.2006     Marinobacter GH-9 Хороший спектр 95% M. aquaeolei VT8 Антарктический летний DSM 18951 разложения, очень   лед DSMZ 22.12.2006 быстрый рост     Pseudomonas GH-10 Широкий спектр 94% Р. Арктический DSM 18952 разложения, особенно при pertucinogena летний лед DSMZ 22.12.2006 совместном действии     Oleispira GH-11 Широкий спектр разложения алканов 99,6% О. antarctica Арктический зимний лед DSM 18953 при очень низкой температуре, штамм     DSMZ 22/12/2006 чувствительный     Дополнительные штаммы Marinobacter GH-3 Очень широкий 96% М. aquaeolei Арктический DSM 18945 спектр разложения,   зимний лед DSMZ 22.12.2006 психротолерантный     Marinomonas GH-5 Разложение специфических углеводородов, быстрый рост при
минусовых температурах 98% М. protes Смешанный лед DSM 18947     DSMZ 22.12.2006     Pseudoalteromonas GH-6 Разложение специфических 99,6% Р. elyakovii Арктический летний DSM 18948 углеводородов, очень широкий   лед DSMZ 22.12.2006 спектр температур     Psychrobacter GH-7 Разложение специфических 98% Р.glacincola Арктический летний лед DSM 18949 углеводородов,     DSMZ 22.12.2006 очень широкий спектр солености     Jannaschia GH-8 Широкий спектр разложения, 94% J.rubra Антарктический летний DSM 18950 медленный рост   лед DSMZ 22.12.2006       ^*) Подобие последовательности гена 16S rРНК со следующими использованными типами штаммов или с хорошо описанными штаммами

Изобретение относится к биотехнологии. Способ биологического разложения углеводородов нефти в полярных регионах, покрытых морским льдом, включает контактирование подлежащих разложению углеводородов нефти с инокулятом. Причем инокулят содержит смесь адаптированных к холоду бактерий, состоящую из по меньшей мере следующих штаммов: Rhodococcus GH-1 (DSM 18943, DSMZ 22.12.2006), Dietzia GH-2 (DSM 18944, DSMZ 22.12.2006), Shewanella GH-4 (DSM 18946, DSMZ 22.12.2006), Marinobacter GH-9 (DSM 18951, DSMZ 22.12.2006), Pseudomonas GH-10 (DSM 18952, DSMZ 22.12.2006), Oleispira GH-11 (DSM 18953, DSMZ 22.12.2006), а также питательных веществ и по меньшей мере одного благоприятного для окружающей среды носителя, на котором иммобилизованы по меньшей мере указанные, предназначенные для использования штаммы бактерий. Изобретение позволяет повысить эффективность разложения углеводородов нефти в полярных регионах, покрытых морским льдом. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ биологического разложения углеводородов нефти в полярных регионах, покрытых морским льдом, путем биоприращения экзогенных бактерий, разлагающих углеводороды, и путем добавления питательных веществ, отличающийся тем, что осуществляют контактирование подлежащих разложению углеводородов нефти с инокулятом, состоящим из по меньшей мере следующих компонентов смеси адаптированных к холоду бактерий, состоящей из по меньшей мере следующих штаммов:
Rhodococcus GH-1 (DSM 18943, DSMZ 22.12.2006),
Dietzia GH-2 (DSM 18944, DSMZ 22.12.2006),
Shewanella GH-4 (DSM 18946, DSMZ 22.12.2006),
Marinobacter GH-9 (DSM 18951, DSMZ 22.12.2006),
Pseudomonas GH-10 (DSM 18952, DSMZ 22.12.2006),
Oleispira GH-11 (DSM 18953, DSMZ 22.12.2006),
причем предназначенные для использования штаммы бактерий также активны при температуре окружающей среды -3°С, обладают различными зонами температурной толерантности, обладают различными зонами толерантности к солености, имеют различный спектр разложения и обладают различным потенциалом эмульгирования нефти,
питательных веществ и
по меньшей мере одного благоприятного для окружающей среды носителя, на котором иммобилизованы по меньшей мере указанные предназначенные для использования штаммы бактерий.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что к смеси бактерий дополнительно добавляют по меньшей мере один штамм из следующих штаммов бактерий:
- Marinobacter GH-3 (DSM 18945, DSMZ 22.12.2006)
- Marinomonas GH-5 (DSM 18947, DSMZ 22.12.2006)
- Pseudoalteromonas GH-6 (DSM 18948, DSMZ 22.12.2006)
- Psychrobacter GH-7 (DSM 18949, DSMZ 22.12.2006)
- Jannaschia GH-8 (DSM 18950, DSMZ 22.12.2006).

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что контактирование инокулята с подлежащими разложению углеводородами нефти осуществляют многократно, причем в каждом случае используют композицию инокулята, отличающуюся в отношении используемых штаммов бактерий, используемых питательных веществ и используемого носителя.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в инокуляте штаммы бактерий для смеси бактерий используют в равной объемной доле.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что контактирование подлежащих разложению углеводородов нефти с инокулятом осуществляют при температуре окружающей среды ниже +7°С.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве питательных веществ используют органические или неорганические питательные вещества с высокой долей азота и фосфата.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют носитель, на котором дополнительно иммобилизованы питательные вещества.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что контактирование подлежащих разложению углеводородов нефти осуществляют с инокулятом, находящимся в виде твердых частиц, путем рассеивания на морской лед и/или водную поверхность.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что контактирование подлежащих разложению углеводородов нефти осуществляют с инокулятом, находящимся в жидком виде, путем
- заливания или разбрызгивания на морской лед и/или
- внесения или накачивания в столб воды под морским льдом.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют по меньшей мере два различных носителя.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что гидрофобные и/или гидрофильные носители используют в зависимости от появления подлежащих разложению углеводородов нефти на или в морском льду и/или на или в морской воде.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют носители в виде
- неорганических питательных веществ, окруженных оболочкой жирной кислоты,
- шариков из арамидного полимера и активированного угля с мембранной оболочкой,
- белков, образующих волокна,
- рыбной муки, окруженной полисорбатом 80, или
- опилок.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что используемые штаммы бактерий разводят при температуре ниже +7°С в минеральной среде с добавкой углеводородов нефти до плотности бактерий по меньшей мере 1·10⁹ бактерий на мл жидкости.

14. Смесь бактерий для проведения способа по п.1, представляющая собой композицию из по меньшей мере следующих штаммов:
- Rhodococcus GH-1 (DSM 18943, DSMZ 22.12.2006)
- Dietzia GH-2 (DSM 18944, DSMZ 22.12.2006)
- Shewanella GH-4 (DSM 18946, DSMZ 22.12.2006)
- Marinobacter GH-9 (DSM 18951, DSMZ 22.12.2006)
- Pseudomonas GH-10 (DSM 18952, DSMZ 22.12.2006)
- Oleispira GH-11 (DSM 18953, DSMZ 22.12.2006).

15. Смесь бактерий по п.14, отличающаяся тем, что дополнительно содержит по меньшей мере один из следующих штаммов:
- Marinobacter GH-3 (DSM 18945, DSMZ 22.12.2006)
- Marinomonas GH-5 (DSM 18947, DSMZ 22.12.2006)
- Pseudoalteromonas GH-6 (DSM 18948, DSMZ 22.12.2006)
- Psychrobacter GH-7 (DSM 18949, DSMZ 22.12.2006)
- Jannaschia GH-8 (DSM 18950, DSMZ 22.12.2006).