СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РЕПАРАТИВНОГО ОСТЕОГЕНЕЗА Российский патент 2011 года по МПК A61K38/06 A61K38/08 A61P19/00 

Изобретение относится к медицине (травматологии, хирургии) и ветеринарии. Способ может быть использован для стимуляции сращения переломов костей.

Наиболее близким является способ стимуляции консолидации переломов с помощью пептидного препарата «Даларгин» (В.А.Дегтярь, М.О.Каминская, А.И.Мохов. Восстановительное лечение детей с замедленной консолидацией переломов костей. // НДI травматологiï та ортопедиiï Донецького нацiонального медичного унiверситету iм. M.Горького. Том 9, №1, 2008. (Патент Украины 67601 А)).

Даларгин - высокоселективный агонист опиоидных µ- и δ-рецепторов, имеющий формулу Тир-Д-Ала-Гли-Фен-Лей-Арг, отличающийся от нативного энкефалина наличием Д-аланина и аргинина. В настоящее время известны репаративные эффекты этого опиоидного пептида в отношении ряда тканей (Effects of dalargin on reparative processes in skin and muscle wounds of irradiated animals Radiobiologiia. 1992 Nov-Dec; 32(6):873-80. Shekhter AB, Solov'eva AI, Spevak SE, Titov MI. Biull Eksp Biol Med. 1988 Oct; 106(10):487-90. Effects of opioid peptide dalargin on reparative processes in wound healing.)

Недостатком предложенного способа является техническая сложность его исполнения и относительно невысокая эффективность. Требуется, отступив на 1 см от области перелома, проколоть перпендикулярно к оси кости инъекционной иглой мягкие ткани и надкостницу до чувства упора в кость, затем необходимо изменить угол наклона до 45° и продвинуться в направлении к перелому и только после этого с помощью шприца вводят даларгин. Таким образом, процедура введения препарата достаточно сложна и требует определенных навыков и умений. Кроме того, при таком способе повышается риск инфицирования области перелома, введение препарата сопряжено с болевым синдромом и, как отмечают сами авторы, в ряде случаев установлен неудовлетворительный результат (В.А.Дегтярь, М.О.Каминская, А.И.Мохов. Восстановительное лечение детей с замедленной консолидацией переломов костей // НДI травматологiï та ортопедiï Донецького нацiонального медичного унiверситету iм. М.Горького. Том 9, №1, 2008.).

Задача изобретения - улучшение репаративной способности костной ткани с целью сокращения сроков консолидации переломов костей.

Задача изобретения достигается путем парентерального (внутрибрюшинного) введения даларгина в комбинации с пептидом Gly-His-Lys (имеющего формулу H₂N-Gly-L-His-L-Lys-COOH) для стимуляции репаративного остеогенеза.

Пептидные субстанции, растворенные в физиологическом растворе (NaCl), вводят один раз в сутки, одновременно, но в разных шприцах, парентерально (внутрибрюшинно) сразу после возникновения перелома в эквимолярных разовых дозах (Gly-His-Lys - 0,5 мкг/кг массы тела и даларгин - 1,2 мкг/кг соответственно) в течение 10 дней с интервалом в 24 часа между инъекциями. При этом рентгенологические и гистологические исследования, проведенные на экспериментальных животных (крысы Вистар), свидетельствуют о стимуляции репаративного остеогенеза.

Изобретение поясняется следующими фигурами

На Фиг.1 представлены фотографии рентгенограмм бедренных костей лабораторных крыс через 10 суток после моделирования перелома: 1. Введение физиологического раствора (контроль). 2 - Введение пептида Gly-His-Lys (линия перелома менее выражена по сравнению с контролем). 3. Введение даларгина (линия перелома менее выражена по сравнению с контролем). 4. Введение комбинации пептидов Gly-His-Lys + даларгин (линия перелома практически не прослеживается).

На Фиг.2 представлены фотографии гистологических срезов наружной костной мозоли лабораторных крыс, получавших физиологический раствор (контроль) через 10 суток после перелома бедренной кости (фото).

Слева - крупное скопление хрящевых клеток, кнаружи от которого - слой остеогенных клеток (микрофото, окраска гематоксилин + эозин (Г+Э), x200); справа - новообразованные костные трабекулы, непосредственно связанные с костным отломком (микрофото, Г+Э, x140).

Фиг.3. Гистология наружной костной мозоли у животных, получавших пептид GHL через 10 суток после перелома бедренной кости (фото).

Слева - новообразование костных трабекул, кнаружи - слой из остеогенных клеток (микрофото, Г+Э, х200); справа - новообразованные костные трабекулы, формирование губчатой кости (микрофото, Г+Э, х200).

Фиг.4. Гистологическая картина наружной костной мозоли у животных, получавших комбинацию пептидов Gly-His-Lys+даларгин через 10 суток после перелома бедренной кости (фото).

Слева - над костными отломками в тесной связи с их тканью слой новообразованных остеобластами костных трабекул, кнаружи - слой остеогенных клеток, покрытый фиброзным слоем надкостницы (микрофото, Г+Э, х140); справа - в тесной связи с тканью костного отломка новообразованная костная ткань с надкостницей и с явлениями перестройки в компактную кость (микрофото, Г+Э, х200).

Способ осуществляется следующим образом.

Пептид Gly-His-Lys, имеющий формулу H₂N-Gly-L-His-L-Lys-COOH, может быть куплен у поставщиков реактивов и препаратов для биомедицинских исследований (Sigma, ICN, Merk и др.) или синтезирован в любой лаборатории синтеза пептидов. Нами был использован препарат, синтезированный в НИИ химии Санкт-Петербургского государственного университета. Даларгин (Микроген НПО ФГУП, Россия), имеющий формулу Тир-Д-Ала-Гли-Фен-Лей-Арг, является общедоступным фармацевтическим средством, а также может быть синтезирован в лабораториях синтеза пептидов.

Берутся навески соответствующих пептидов и растворяются в физиологическом растворе хлорида натрия (NaCl). Затем пептиды вводятся один раз в сутки, одновременно, но в разных шприцах, лабораторным животным, сразу после перелома, в эквимолярных разовых дозах (Gly-His-Lys - 0,5 мкг/кг массы тела и даларгин - 1,2 мкг/кг соответственно) парентерально (внутрибрюшинно) в 0,1 мл физиологического раствора (NaCl) в течение 10 дней с интервалом 24 часа между инъекциями.

В результате проведенных рентгенологических и гистологических исследований было выявлено, что по отдельности пептиды Gly-His-Lys и даларгин стимулировали репаративный остеогенез. При комбинированном введении препаратов (Gly-His-Lys+даларгин) наблюдалось существенное усиление репаративного эффекта по сравнению с использованием препаратов по отдельности.

Пример конкретного использования.

Крысы Вистар были разделены на группы по 8-10 крыс в каждой. Животным, наркотизированным хлоралгидратом, моделировали закрытый перелом бедренной кости задней правой лапки с последующей интрамедуллярной фиксацией ее спицей. В течение 10 дней со дня перелома животным один раз в сутки внутрибрюшинно вводили комбинацию пептидов (Gly-His-Lys+даларгин) в эквимолярных разовых дозах 0,5 мкг и 1,2 мкг на 1 кг массы тела соответственно в 0,1 мл физиологического раствора (NaCl) с интервалом 24 часа между инъекциями. Крысам контрольной группы вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме в течение того же периода времени. Животных выводили из эксперимента через 10 суток после перелома. Лапы крыс фиксировали в 10% нейтральном формалине на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2. Затем изготовляли парафиновые срезы, окрашивали гематоксилином и эозином (Г+Э), после чего изучали морфологическую картину наружной костной мозоли.

Гистологически костная мозоль над местом перелома у животных, получавших физиологический раствор (контроль), представлена массивной зоной пролиферирующих остеогенных клеток, в толще которой в неваскуляризированных местах обнаруживаются крупные скопления клеток хрящевой ткани (Фиг.2, слева). В дистально расположенных от места перелома отделах костная мозоль образована васкуляризированной тканью из остеогенных клеток, в глубине которой в непосредственной близости с сохранившей жизнеспособность тканью костных отломков обнаруживаются новообразованные остеобластами костные трабекулы (Фиг.2, справа).

У животных, получавших пептид Gly-His-Lys, в области перелома в краях костных отломков наблюдается активная резорбция остеокластами погибшей костной ткани. Над костными отломками располагается широкий слой, представленный множеством мелких сосудистых полостей и интенсивно пролиферирующими остеогенными клетками (имеются многочисленные митозы клеток), среди остеогенных клеток встречаются мелкие очаговые скопления хондроцитов. В костной мозоли, расположенной дистальнее от места перелома, наблюдается интенсивное новообразование костных трабекул, имеющих непосредственную связь с сохранившей жизнеспосособность тканью костных отломков, с формированием губчатой костной ткани (Фиг.3.).

В группе животных, получавших даларгин, видимых морфологических различий с крысами, которым вводили пептид Gly-His-Lys, не было выявлено. Наблюдались репаративные изменения, сопоставимые с теми, которые отмечались у животных, получавших пептид Gly-His-Lys.

У животных, получавших комбинацию пептидов Gly-His-Lys+даларгин, при морфологическом исследовании наружная костная мозоль в области места перелома представлена двумя слоями: над костными отломками в тесной связи с их тканью слой новообразованных остеобластами костных трабекул, кнаружи - покрытый фиброзным слоем надкостницы слой остеогенных клеток с мелкими очаговыми скоплениями хондроцитов (Фиг.4. слева). В дистальных от линии перелома отделах костной мозоли обнаруживается в тесной связи с тканью костного отломка новообразованная костная ткань с надкостницей и с явлениями перестройки в компактную кость (Фиг.4. справа).

Учитывая вышеперечисленное, можно заключить, что пептиды Gly-His-Lys и даларгин по отдельности, а также их комбинация (Gly-His-Lys+даларгин) стимулировали репаративный остеогенез при переломе бедренной кости. Более выраженные репаративные изменения наблюдались в группе комбинированного введения пептидов (Gly-His-Lys+даларгин).

Таким образом, при переломах костей благодаря синергичному действию пептидов Gly-His-Lys и даларгина происходит существенное усиление репаративного эффекта, что может быть использовано для стимуляции репаративного остеогенеза.

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и хирургии, и может быть использовано для стимуляции сращения переломов костей. Способ включает введение даларгина, отличающийся тем, что используют комбинацию пептидов Gly-His-Lys и даларгина парентерально в эквимолярных разовых дозах 0,5 и 1,2 мкг/кг массы соответственно один раз в сутки, в течение десяти дней. Использование изобретения позволяет улучшить репаративную способность костной ткани и сократить сроки консолидации переломов костей. 4 ил.

Способ стимуляции репаративного остеогенеза, включающий введение даларгина, отличающийся тем, что используют комбинацию пептидов Gly-His-Lys и даларгина парентерально в эквимолярных разовых дозах 0,5 и 1,2 мкг/кг массы соответственно один раз в сутки, в течение десяти дней.