ШТАММ ВИРУСА ГРИППА A/HERRING GULL/MONGOLIA/454/08/ H13N8-СУБТИПА, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ АНТИГЕНСОДЕРЖАЩЕГО СУБСТРАТА И СЫВОРОТКИ ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЦЕЛЕЙ Российский патент 2012 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и микробиологии, а именно штамм вируса гриппа H13N8-субтипа для приготовления антигенсодержащего субстрата и сыворотки для серодиагностики гриппа Н13-субтипа в РТГА, как компонента панели поликлональных сывороток к различным субтипам вируса гриппа A (H1-H16) для типирования вновь выделяемых из природы вариантов вируса гриппа в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), а также выявления антител к вирусу гриппа Н13-субтипа в сыворотках крови диких животных для оценки популяционного иммунитета к вирусу гриппа данного субтипа в РТГА.

Вирус гриппа Н13-субтипа в основном распространен у представителей семейства чайковых (Laridae). Данный субтип обычно образует отдельные филогенетические линии, выявляемые в различных географических регионах. Так, совсем недавно в ходе изучения штаммов H13N9-субтипа, выделенных от келповых чаек (Larus dominicanus) в Аргентине, была обнаружена отдельная, независимая филогенетическая линия вирусов гриппа чаек Южной Америки (Avian influenza virus isolated in wild waterfowl in Argentina: evidence of a potentially unique phylogenetic lineage in South America / A.J.Pereda [et al.] // Virology. - 2008. - №378 (2). - P 363-370).

Часть вирусов, изолированных от чаек, обладает потенциальной способностью инфицировать уток. Между тем, подтипы, распространенные среди уток, редко встречаются либо вообще отсутствуют среди чаек (Is the gene pool of influenza viruses in shorebirds and gulls different from that in wild ducks? / Y.Kawaoka, T.M.Chambers, W.L.Sladen, R.G.Webster // Virology. - 1988. - №163. - P.247-250). Вирусы гриппа H13N2 и H13N9 были изолированы от китов - обыкновенной гринды (Globicephala melaena) (Characterization of two influenza A viruses from a pilot whale. / V.S.Hinshaw [et al.] // J. Virol. - 1986. - №58 (2). - P.655-666). Оказалось, что гемагглютинин H13 вируса гриппа китов аналогичен гемагглютинину ВГА чаек; это подтверждает гипотезу, что вирусы гриппа птиц могут проникать в популяции морских животных, но, вероятно, их циркуляция не поддерживается постоянно (Antigenic and molecular characterization of subtype H13 hemagglutinin of influenza virus. / T.M.Chambers [et al.] // Virology. - 1989. - №172 (1). - P.180-188).

Из источников научно-технической информации известно ряд документированных фактов выделения вирусов гриппа А от Laridae.

В период 1980-1984 г.г. вирусы гриппа H13N3 и H13N6 были выделены в Западной Японии от чернохвостой чайки (Larus crassirostris) - самой многочисленной из чаек, населяющих берега Японского и Желтого морей и тихоокеанское побережье Японских островов (Isolation of influenza A viruses from migratory waterfowl in San-in District, western Japan in the winter of 1983-1984 / K. Otsuki [et al.] // Res Vet Sci. - 1987. - №43 (2). - P.177-179).

В СССР были изолированы штаммы со следующими антигенными формулами: H13N2, H13N3 и H13N6. В США в это же время были описаны циркуляции штаммов H13N2, H13N6, H13N8 и H13N9 (Antigenic and genetic characterization of a novel hemagglutinin subtype of influenza A viruses from gulls / V.S.Hinshaw [et al.] // J. Virol. - 1982. - №42. - P.865-872). В этот период было показано, что одновременно с циркуляцией нескольких субтипов вируса гриппа А среди чайковых в СССР большинство штаммов имели антигенную формулу H13N2, а в США - H13N6 (Антигенная вариабельность вирусов гриппа птиц А/Н13, изолированных в СССР. / С.С.Ямникова [и др.] // Вопросы вирусологии. - 1989. - №5. - С.568-575). Это может быть обусловлено наличием контактов птиц семейства Laridae с другими видами птиц.

В международной базе Genbank по состоянию на 10 июня 2010 известна информация о двух штаммах вируса гриппа Н13N8-субтипа: A/black-headed gull/Norway/10_1459/2006 и A/black-headed gull/Netherlands/1/00. В базе данных есть также информация о следующих штаммах вируса Н13-субтипа:

A/herring gull/Germany/WV1136KRK/03(H13)

A/Larus ridibundus/Germany/R2064/2006(H13)

A/yellow-legged gull/Ukraine/912306/2005(H13)

A/Herring Gull/Norway/10_2191/2007(H13)

Все они были выделены на территории Европы в течение последних 10 лет. В России есть информация о выделении ряда штаммов Н13 субтипа до 2002 г. (Экология и эволюция вирусов гриппа в России (1979-2002 гг.) / Д.К.Львов [и др.] // Вопросы вирусологии. - 2004. - №3. - С.17-24.) в основном в Европейской части (A/Gull/Astrakhan/1421/84, A/Gull/Astrakhan/44/88, A/Gull/Astrakhan/1808/98), за исключением двух штаммов Н13N6-субтипа, выделенных в Сибири в 1998 г.: A/duck/Siberia/272/1998 и A/duck/Siberia/272PF/1998 (Kida, H. and Sakoda, Y. Characterization of mutant of H13 influenza A viruses on plaque. Published Only in Database (2006) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB284990.1). Информация о более поздних выделениях вируса гриппа Н13-субтипа на азиатской территории отсутствует. Поэтому предлагаемый к патентованию штамм является единственным известным штаммом вируса гриппа Н13-субтипа, выделенным за последние 12 лет на азиатской территории России. Очевидна необходимость использования его при разработке современной диагностической системы вируса гриппа различных субтипов в РТГА.

Все упомянутые источники содержат информацию о некоторых свойствах штаммов вируса гриппа Н13-субтипа. Однако в этих работах не были опубликованы данные об использовании указанных штаммов при разработке диагностических препаратов, в том числе с использованием метода РТГА.

Вместе с тем, описанные штаммы по причине быстрой изменчивости вируса гриппа А могут значительно отличаться антигенно от современных вариантов вируса гриппа Н13-субтипа. В этой связи необходимо постоянно отслеживать антигенные изменения (в частности поверхностного гликопротеина гемагглютинина НА) для своевременной замены штамма-продуцента для серодиагностики вируса гриппа А.

При этом для корректной и достоверной диагностики необходимо использовать современные варианты вируса гриппа Н13-субтипа, как компоненты диагностических тест-систем. Так, нами (авторами заявки) показано, что типирующая сыворотка полученная на штамм A/gull/Maryland/704/77 (Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН) не дала положительного результата в РТГА с антигеном предлагаемого к патентованию штамма A/Herring gull/Mongolia/454/08, выделенного в Азии в 2008 г.

Соответственно, штамм A/gull/Maryland/704/77, используемый при производстве типирующей сыворотки к H13-субтипу гемагглютинина, антигенно отличен от некоторых современных антигенных вариантов, циркулярующих в Азии, и не пригоден для определения их принадлежности к Н13-субтипу. Поэтому дополнительно необходим новый современный вариант для серотипирования вновь выделяемых штаммов.

Таким образом, наиболее близким аналогом (прототипом) явдяется выделенный в США штамм вируса гриппа A H13N8-субтипа (Antigenic and genetic characterization of a novel hemagglutinin subtype of influenza A viruses from gulls / V.S.Hinshaw [et al.] // J. Virol. - 1982. - №42. - P.865-872).

Однако данный штамм по причине быстрой изменчивости вируса гриппа А значительно отличается антигенно от современных вариантов вируса гриппа Н13-субтипа. Кроме того, в данном источнике информации не были опубликованы данные об использовании указанного штамма при разработке диагностических препаратов, в том числе с использованием метода РТГА. На момент подачи настоящей заявки на изобретение коммерческого антигена и сыворотки для диагностики вируса гриппа Н13-субтипа в РТГА неизвестно.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение такого штамма вируса гриппа птиц H13N8-субтипа, который обладал бы более высоким антигенным сродством к современным вариантам вируса гриппа Н13, циркулирующим на территории Евразии, и был пригоден для получения поликлональной сыворотки для определения принадлежности вируса гриппа к Н13 субтипу.

Указанный технический результат достигается созданием штамма вируса гриппа птиц A/Herring gull/Mongolia/454/08/ H13N8-субтипа, используемый при получении антигенсодержащего субстрата и сыворотки для диагностических целей, депонированный в Коллекции микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером V-436.

Характеристика штамма. Штамм принят на патентное депонирование под номером V-436 в Коллекцию микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (р.п. Кольцово, Новосибирская область).

Штамм был выделен от серебристой чайки (Larus argentatus) на территории Западной части Монголии в 2008 г. Принадлежность к H13N8-субтипу определена методом PCR Подтвержден в реакции PCR с типирующими праймерами на гемагглютинин (H1-H16) и нейраминидазу (N1-N9) (Manual on animal influenza diagnosis and surveillance. World Health Organization (WHO). - 2002. - 105 P.; Bao-Feng Qiu et al. A reverse transcription-PCR for subtyping of the neuraminidase of avian influenza viruses. // Journal of Virological Methods. - 2009. - 155. - P.193-198). Принадлежность гемагглютинина штамма к Н13-субтипу подтверждена определением и сравнительным анализом нуклеотидной последовательности фрагмента гена гемагглютинина (620 и.о.). Обладает 99% идентичностью нуклеотидной последовательности фрагмента гена НА со штаммами A/black headed gull/Mongolia/1766/2006(H13N6), A/black-headed gull/Sweden/1/99(H13N6), А/gull/Astrakhan/1846/1998(H13N6).

При культивировании в системе развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) данного штамма инфекционный титр достигал 5,5 lg ЕID50/мл. Максимальная продукция гемагглютинина в аллантоисной жидкости РКЭ составляла 1280 ГАЕ/мл. Данные свойства позволяют эффективно использовать предлагаемый штамм для получения антигена штамма A/Herring gull/Mongolia/454/08.

В эксперименте штамм имеет одинаковые титры в реакции гемагглютинации с эритроцитами следующих видов животных: курица, гусь, лошадь, хорек, а также с эритроцитами человека.

Он не обладает патогенностью для мышей при интраназальном и внутрибрюшинном заражении. В эксперименте не было отмечено летальной инфекции. Не наблюдалось также клинических признаков инфекции и выработки антител по истечении 21 суток после инфицирования. Таким образом, мыши не восприимчивы к данному штамму, в отличие от штаммов ряда других субтипов вируса гриппа. Следовательно, он более безопасен для человека, что важно при использовании данного штамма при производстве антигенсодержащего препарата и типирующей поликлональной сыворотки.

Для длительного хранения штамм необходимо лиофилизировать с использованием в качестве защитной среды раствора желатина и сахарозы (САЖ). Лиофилизация с добавлением САЖ в соотношении 1:4 позволяет сохранить стабильную инфекционную активность вируса в течение не менее 2 лет при температуре хранения - 70°С.

Пример 1. Приготовление антигенсодержащего диагностического субстрата на основе штамма вируса гриппа A/Herring gull/Mongolia/454/08/ Н13N8-субтипа.

Для приготовления антигенсодержащего субстрата вируссодержащую аллантоисную жидкость инактивируют 0,05% β-пропиолактоном при температуре 37°С в течение 2 ч. Далее необходимо подтвердить инактивацию вируса заражением чувствительной системы-3 пассажа (РКЭ).

Полученный антигенсодержащий субстрат хранится при температуре +4-+7С, без снижения гемагглютинирующего титра в течение 12 месяцев.

Таким образом, полученный антигенсодержащий препарат вируса гриппа Н13-субтипа далее может быть использован при проведении реакции торможения гемагглютинации (РТГА) для детектирования антител к гемагглютинину вируса гриппа Н13-субтипа в сыворотке крови. Применение предлагаемого штамма в качестве антигена для проведения РТГА описано в примере 2 (табл.1).

Пример 2. Проведение РТГА с использованием антигенсодержащего субстрата и получение поликлональной сыворотки на штамм A/Herring gull/Mongolia/454/08 вируса гриппа H13N8-субтипа.

Трем 8-недельным курицам породы Род-Айленд (кросс Изобраун) была внутривенно (в подкрыльцовую вену) введена вируссодержащая жидкость, содержащая 640 ГАЕ/мл. Жидкость представляла собой раствор вируссодержащей аллантоисной жидкости в физиологическом растворе (1:1). Объем вируссодержащего раствора составил 2,5 мл на каждое животное. До заражения были у каждого животного была отобрана кровь (1 мл) для контрольной постановки РТГА сыворотки с антигеном штамма A/Herring gull/Mongolia/454/08. РТГА дала отрицательный результат. По истечении 21 суток после инфицирования была тотально отобрана кровь и получена сыворотка крови в объеме 5-10 мл от каждого животного.

Титр сыворотки в РТГА с антигеном предлагаемого штамма составил 1/320-1/640 (табл.1). Диагностическим является значение титра сыворотки в РТГА≥1/40 (WHO, 2009). Таким образом, при заражении кур получена сыворотка, которая может использоваться для определения принадлежности к Н13-субтипу вариантов вируса гриппа, антигенно близких штамму A/Herring gull/Mongolia/454/08.

Таблица 1 Титры сывороток крови от куриц в РТГА с антигеном штамма A/Herring gull/Mongolia/454/08 № животного Титр сыворотки до инфицирования Титр сыворотки на 21 сутки после инфицирования 1 ≤1/10 1/320 2 ≤1/10 1/640 3 ≤1/10 1/640

Пример 3. Определение принадлежности вновь выделенного изолята вируса гриппа к Н13-субтипу с помощью поликлональной сыворотки A/Herring gull/Mongolia/454/08 (H13N8).

В результате мониторинговых работ из 89 проб от диких перелетных птиц Западной Сибири на развивающихся куриных эмбрионах было выделено 4 гемагглютинирующих агента. Согласно рекомендациям ВОЗ была проведена реакция торможения гемагглютинации с использованием панели поликлональных сывороток (WHO, 2002), а также сывороток любезно предоставленных д-ром Webster (Мэмфис, США).

Таблица 2. Титры типирующих сывороток в РТГА с исследуемыми гемагглютинирующими антигенами. Поликлональные сыворотки Титр сыворотки с антигеном №1 Титр сыворотки с антигеном №2 Титр сыворотки с антигеном №3 Титр сыворотки с антигеном №4 A/PR/8/34 (H1N1) ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 1/20 A/swine/IA/30(H1N1) ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 1/20 A/Wild duck/Shenton/992/00 (H1) ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 1/1280 A/Japan/305/57 (H2N2) ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 A/duck/1283/00 (H3) ≤1/10 1/1280 1/640 ≤1/10 A/equine/Miami/63 (H3N8) ≤1/10 1/20 1/20 ≤1/10 A/duck/Ukraine/63 (H3N8) ≤1/10 1/40 1/40 ≤1/10 A/duck/Czech/56 (H4N6) ≤1/10 ≤1/10 1/20 ≤1/10 A/duck/HK/264/92 (H4) ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 A/tern/So.Af./61 (H5N3) ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 A/goose/HK/167/99 (H5N1) ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 A/turkey/MA/65 (H6N2) ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 A/teal/HK/1312/97 (H6) ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 A/equine/Prague/56 (H7N7) ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 A/FPV/Rostock/34 (H7N1) ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 A/turkey/Ont./6118/68 (H8N4) ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 A/turkey/WI/66 (H9N2) ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 A/duck/HK/4880/97 (H9N2) ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 A/chicken/N/Germany/49 (H10N8) ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 A/duck/Memphis/546/74 (H11N9) ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 A/duck/England/56 (H11N6) ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 A/duck/Alberta/60/76 (H12N5) ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 A/gull/MD/707/77 (H13N6) 1/20 ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 A/Herring gull/Mongolia/454/08 (H13N8)* 1/640 ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 A/mallard/Ast./263/82 (H14N5) ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 A/shearwater/W.Aus./79 (H15N8) ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 ≤1/10 Примечание: * - сыворотка, полученная на предлагаемый штамм.

Результаты представлены в таблице 2. Антиген №1 проявляет высокое сродство к сыворотке, полученной на предлагаемый штамм A/Herring gull/Mongolia/454/08 Н13N8-субтипа. Другие три исследуемых антигена проявляют сродство к сывороткам, полученным на штаммы вируса гриппа Н3 и H1 субтипов.

По результатам реакции торможения гемагглютинации с диагностическими сыворотками, полученными на штаммы различных субтипов вируса гриппа, антиген №1 принадлежит вирусу гриппа Н13-субтипа.

Таким образом, получены антигенсодержащий субстрат и сыворотка к предлагаемому штамму A/Herring gull/Mongolia/454/08 H13N8, которая обладает значимым титром в РТГА. Она позволит выявлять вирус гриппа Н13-субтипа гемагглютинина наиболее близких в антигеном отношении вариантов, циркулирующих в Азии.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и микробиологии, а именно к штамму вируса гриппа H13N8 - субтипа. Штамм вируса гриппа птиц A/Herring gull/Mongolia/454/08/ Н13N8-субтипа депонирован в Коллекции микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером V-436 и используется при получении антигенсодержащего субстрата и сыворотки для диагностических целей. Представленный штамм можно использовать для серодиагностики гриппа H13-субтипа в РТГА как компонент панели поликлональных сывороток к различным субтипам вируса гриппа А (Н1-Н16) для типирования вновь выделяемых из природы вариантов вируса гриппа в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), а также для выявления антител к вирусу гриппа H13-субтипа в сыворотках крови диких животных для оценки популяционного иммунитета к вирусу гриппа данного субтипа в РТГА. 2 табл.

Штамм вируса гриппа птиц A/Herring gull/Mongolia/454/08/ H13N8-субтипа, используемый при получении антигенсодержащего субстрата и сыворотки для диагностических целей, депонированный в Коллекции микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером V-436.