ШТАММ ВИРУСА ГРИППА СВИНЕЙ A/SWINE/SIBERIA/1SW/2016 H1N1-СУБТИПА ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ДИАГНОСТИКЕ ВИРУСА ГРИППА МЕТОДАМИ РТГА И ПЦР И ИССЛЕДОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВАКЦИН И ПРОТИВОВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ IN VITRO И IN VIVO Российский патент 2017 года по МПК C12N7/00 G01N33/569 

Изобретение относится к штаммам вируса гриппа свиней H1N1-субтипа и может быть использовано в медицине, ветеринарии и микробиологии. Указанный штамм предназначен для приготовления антигенсодержащего препарата и сыворотки крови для серодиагностики гриппа свиней H1-субтипа в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), как компонента панели поликлональных сывороток к различным субтипам вируса гриппа A (H1-H18) для типирования вновь выделяемых из природы вариантов вируса гриппа в РТГА, а также выявления антител к вирусу гриппа H1-субтипа в сыворотках крови людей и домашних свиней для оценки популяционного иммунитета к вирусу гриппа данного субтипа в РТГА и реакции микронейтрализации в чувствительной культуре клеток. Штамм может быть использован для оценки иммуногенных и профилактических свойств вакцин против гриппа свиней. Штамм может быть применен в качестве референс-штамма H1 при проведении диагностических работ методом ПЦР. Штамм также может быть использован для оценки эффективности лечебных и профилактических препаратов против гриппа в ходе разработки средств и методов лечения и профилактики гриппа, разработки средств и методов индикации вируса гриппа.

Вирусы гриппа A (Orthomyxoviridae, Influenzavirus А) имеют широкий круг хозяев среди млекопитающих и птиц, но их основным резервуаром в природе являются дикие птицы околоводного комплекса (Львов Д.К. Межпопуляционные взаимодействия в системе вирусы гриппа А - животные - человек / Д.К. Львов // Вопросы вирусологии. - 2005. - №4. - С. 4-11) [1]. Вирусы гриппа А подразделяются на субтипы на основании антигенных свойств их поверхностных гликопротеинов - гемагглютинина и нейраминидазы. На сегодняшний день известно 18 субтипов гемагглютинина (Н) и 11 субтипов нейраминидазы (N). К настоящему моменту циркуляция вирусов гриппа А со всеми известными подтипами гемагглютинина и нейраминидазы, кроме H17N10 и H18N11, зарегистрирована только среди птиц. В процессе эволюции нередко возникают высокопатогенные для человека и животных варианты вируса гриппа. Яркий пример - возникновение нового азиатского варианта вируса H5N1-субтипа, впервые зарегистрированного у домашних птиц в 1996 (Львов Д.К. Межпопуляционные взаимодействия в системе вирусы гриппа А - животные - человек / Д.К. Львов // Вопросы вирусологии. - 2005. - №4. - С. 4-11), (Tong S, Li Y, Rivailler P, Conrardy C, Castillo DA, Chen LM, Recuenco S, Ellison JA, Davis CT, York IA, Turmelle AS, Moran D, Rogers S, Shi M, Tao Y, Weil MR, Tang K, Rowe LA, Sammons S, Xu X, Frace M, Lindblade KA, Cox NJ, Anderson LJ, Rupprecht CE, Donis RO. A distinct lineage of influenza A virus from bats. Proc Natl Acad Sci USA. 2012 Mar 13; 109(11):4269-74) [1, 2].

Грипп свиней - острое респираторное заболевание свиней, вызываемое вирусом гриппа типа А. Вирусы гриппа A (Orthomyxoviridae, Influenzavirus А) выделены от широкого круга хозяев, включая птиц, собак, тюленей, лошадей, свиней и человека (Webster RG, Bean WJ, Gorman ОТ, Chambers TM, Kawaoka Y. Evolution and ecology of influenza A viruses // Microbiol Rev. - 1992. - №56. - P. 152-179) [3]. Хотя вирусы гриппа достаточно редко преодолевают межвидовой барьер, однако сегменты генома могут преодолеть этот барьер с помощью процесса генетической реассортации, или генетического шифта. Поскольку в организме свиней могут реплицироваться как вирусы гриппа птиц, так и вирусы гриппа человека, считается, что свиньи играют важную роль в межвидовой трансмиссии вируса, выступая как «смешивающий сосуд» для реассортации вирусов от разных хозяев (Kida et al. Potential for transmission of avian influenza viruses to pigs // J Gen Virol. - 1994. - №75. - P. 2183-8) [4]. Это может привести к появлению новых вирусов гриппа, способных преодолевать межвидовой барьер и поражать человека.

Вирус гриппа свиней впервые был выделен в Северной Америке Shope в 1930 г. (Shope RE. Swine influenza III. Filtration experiments and etiology // J Exp Med. - 1931. - №54. - P. 373-385) [5]. В настоящее время в мире в популяции свиней циркулируют три основных субтипа вируса гриппа A: H1N1, H3N2 и H1N2, включая классический свиной вирус H1N1, европейский вирус H1N1 птичьего происхождения, H3N2 человеческого происхождения, реассортантный вирус H3N2 и различные генотипы вируса H1N2 (Brown IH. The epidemiology and evolution of influenza viruses in pigs // Vet Microbiol. - 2000. - Vol.74. - P. 29-46; Marozin S, Gregory V, Cameron K, Bennett M, Valette M, Aymard M, Foni E, Barigazzi G, Lin Y, Hay A. Antigenic and genetic diversity among swine influenza A H1N1 and H1N2 viruses in Europe // J Gen Virol. - 2002. - Vol. 83. - P. 735-745; Qi X, Lu CP. Genetic characterization of novel reassortant H1N2 influenza A viruses isolated from pigs in southeastern China // Arch Virol. - 2006. - Vol.151. - P. 2289-2299) [6-8]. До 1998 г. в США от свиней выделялся преимущественно классический свиной вирус H1N1, а в 1998 г. в нескольких штатах был выделен вирус гриппа свиней H3N2. Эти вирусы произошли путем реассортации между вирусами гриппа человека, птиц и классическим вирусом гриппа свиней, подверглись быстрой эволюции и, в основном, вызывали более тяжелое заболевание, чем классический вирус H1N1. Кроме того, реассортация между вирусом H3N2 и вирусом гриппа свиней H1N1 привела к появлению реассортантного вируса H1N2 (Karasin AI. Genetic characterization of H1N2 influenza A viruses isolated from pigs throughout the United States / A.I. Karasin et al. // J. Clin. Microbiol. - 2002. - №38. - P. 2453-2456) [9]. Помимо этого, вирус гриппа птиц H4N6, циркулировавший среди уток, был выделен от свиней в Канаде. Появление этих новых вирусов в дополнение к циркулирующим дрейфовым вариантам вируса гриппа свиней H1N1 может привести к опасным последствиям для ветеринарии и здравоохранения. В Европе вирус гриппа свиней A(H3N2) циркулирует с 1984 г., появившись путем реассортации между вирусом гриппа свиней H3N2 человеческого происхождения и вирусом гриппа свиней H1N1 птичьего происхождения (Castrucci M.R. Genetic reassortant between avian and human influenza a viruses in Italian pigs / M.R. Castrucci et al. // Virology. - 1993. - №193. - P. 503-6) [10].

Существует тесное историческое взаимодействие между вирусами гриппа человека и свиней. Интересно, что вирусы гриппа человека часто проникали в популяцию свиней. За исключением пандемии Азиатского гриппа H2N2 в 1950-х годах, все пандемические вирусы гриппа человека поражали популяцию свиней. Они адаптировались к организму нового хозяина и продолжали циркулировать в популяции свиней независимо от вирусов гриппа человека, эволюционируя в антигенно и филогенетически различные линии вируса гриппа свиней (Martha I. Continual reintroduction of human pandemic H1N1 influenza A viruses into swine in the United States, 2009 to 2014 /I. Martha et al. // Journal of Virology. - 2015. - №89. - P. 6218-26) [11]. Помимо проникновения вирусов гриппа от людей, вирусы гриппа свиней происходили также от птичьих вирусов-предшественников: вирус гриппа субтипа H1N1 птичьего происхождения вызывал эндемичную инфекцию у свиней в Европе в конце 1970-х гг. Эта линия (H1N1av) доминировала в популяции свиней в Европе до недавнего времени (Brown IH. History and epidemiology of swine influenza in Europe / IH. Brown // Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 2013. - №370. - P. 133-146) [12]. Реассортация этого вируса с человеческими штаммами привела к появлению вирусов H1N2 и H3N2 у свиней в Европе. Серологические исследования у свиней в европейских странах показали коциркуляцию этих трех энзоотичных субтипов в различных соотношениях (Van Reeth К. Seroprevalence of H1N1, H3N2 and H1N2 influenza viruses in pigs in seven European countries in 2002-2003 / Van Reeth K. et al. // Influenza Other Respi. Viruses. - 2008. - №2. - P. 99-105) [13].

Вирусы гриппа свиней наносят значительный экономический ущерб в сфере животноводства, вызывают заболевания у человека (Neumann G. and Kawaoka Y. Transmission of Influenza A Viruses / Neumann G. and Kawaoka Y. // Virology. - 2015. doi:10.1016/j.virol.2015.03.009) [14], а иногда могут способствовать возникновению пандемии гриппа (Smith GJD. Dating the emergence of pandemic influenza A viruses / GJD. Smith et al. // Proc Natl Acad Sci USA. - 2009. - Vol. 106. - P. 11709-11712) [15]. Так, новый вирус гриппа A(H1N1) свиного происхождения, вызвал последнюю пандемию гриппа у людей в 2009 г. (Garten RJ. Antigenic and genetic characteristics of swine-origin 2009 A H1N1 influenza viruses circulating in humans / RJ. Garten et al. // Science. - 2009. - Vol. 325. - P. 197-201; Smith GJ. Origins and evolutionary genomics of the 2009 swine-origin H1N1 influenza A epidemic / GJ. Smith et al. // Nature. - 2009. - Vol. 459. - P. 1122-1125) [16, 17]. После появления в 2009 г. пандемический штамм H1N1 проник обратно в популяцию свиней во многих странах (Vijaykrishna D. Reassortment of pandemic H1N1/2009 influenza A virus in swine / D. Vijaykrishna et al. // Science. - 2010. - Vol. 328. - P. 1529; Watson S.J. Molecular Epidemiology and Evolution of Influenza Viruses Circulating within European Swine between 2009 and 2013 / S.J. Watson et al. // Journal of Virology. - 2015. - №89(19). - P. 9920-31) [18, 19]. Он также подвергся реассортации с такими эндемичными вирусами гриппа свиней, как H1N1av, H1N2 и H3N2 (Simon G. European Surveillance Network for Influenza in Pigs: Surveillance Programs, Diagnostic Tools and Swine Influenza Virus Subtypes Identified in 14 European Countries from 2010 to 2013 / G. Simon et al. // Plos one. - 2014. - DOI:10.1371/jour-nal.pone.0115815) [20]. В Германии вирус гриппа H1N1pdm впервые был обнаружен в популяции свиней и декабре 2009 г. Реассортантный вирус, содержащий 7 сегментов пандемического вируса H1N1 и нейраминидазу H1N1av (H1pdmN1), был зарегистрирован в мае 2010 г. Начиная с 2011 г., была показана циркуляция реассортантного вируса H1pdmN2 в нескольких поголовьях свиней в Германии более 1 года. Гемагглютинин этих вирусов имел уникальные мутации, отличающие их от другого НА H1N1pdm09 происхождения (Harder Т.С. Expanded cocirculation of stable subtypes, emerging lineages, and new sporadic reassortants of porcine influenza viruses in swine populations in Northwest Germany / T.C. Harder et al. // J Virol. - 2013. - №87. - P. 10460-10476) [21]. Вероятно, антигенный дрейф вирусов в популяции свиней происходит значительно медленнее, чем в человеческой популяции (Vijaykrishna D. Long-term evolution and transmission dynamics of swine influenza A virus / D. Vijaykrishna et al. // Nature. - 2011. - №473. - P. 519-522) [22].

Как правило, вирусы гриппа свиней не инфицируют человека. Однако отмечены спорадические случаи инфекции человека, вызванные вирусом гриппа свиней. Так, случаи инфицирования людей вирусами H1N1v, H3N2v и H1N2v были описаны в США. Большинство случаев заражения вариантными вирусами было описано у детей и было связано с прямым или непрямым контактом со свиньями. Наблюдалась ограниченная трансмиссия вируса от человека к человеку при тесных контактах, однако устойчивой трансмиссии выявлено не было. Вариантный вирус гриппа A H3N2 ("H3N2v"), содержащий М ген пандемического вируса 2009 года, впервые был выявлен у человека в июле 2011 г. Всего в 2011 г. было зарегистрировано 12 случаев инфекции H3N2v в США (штаты Индиана, Айова, Майн, Пенсильвания и Западная Виргиния). В 2012 г. было зарегистрировано 309 случаев инфекции H3N2v в 12 штатах, а в 2013 г. было выявлено 19 случаев в 5 штатах (Jhung MA. Outbreak of variant influenza A(H3N2) virus in the United States / MA. Jhung et al. // Clin Infect. Dis. - 2013. - №57(12). - P. 1703-1712) [23].

Вместе с тем, процесс реассортации вирусов гриппа в организме свиней может привести к появлению новых вариантов вируса гриппа, способных передаваться от человека человеку. Это подчеркивает серьезность проблемы диагностики и контроля вируса гриппа свиней для человечества.

В странах Европы существуют лицензированные коммерческие гриппозные вакцины, содержащие штаммы вируса гриппа свиней A/H1N1, A/H3N2 и A/H1N2, применяемые с целью профилактики гриппа в популяции свиней. В состав вакцин входят следующие штаммы: A/sw/Netherlands/25/80 (H1N1); A/Port Chalmers/1/73 (H3N2); A/sw/Olost/84 (H1N1); A/Port Chalmers/1/73 (H3N2); A/sw/Belgium/230/92 (H1N1); A/sw/Belgium/220/92 (H3N2); A/sw/Haselunne/2617/03 (H1N1); A/sw/Bakum/1769/03 (H3N2); A/sw/Bakum/1832/00 (H1N2) (Scientific opinion on the possible risks posed by the influenza A (H3N2v) virus for animal health and its potential spread and implications for animal and human healthl // EFSA Journal. - 2013. №11(10). - P. 3383) [24]. Однако, вследствие быстрой изменчивости вируса гриппа, вакцинация может оказаться неэффективной. Вместе с тем, используемые вакцинные штаммы выделены более 10 лет назад и могут быть антигенно отличными от циркулирующих в настоящее время в природе вариантов.

Кроме того, необходима эффективная диагностика гриппа свиней с целью надзора и контроля заболевания, что требует комбинирования различных методов с использованием адекватных контролей (референс-штаммов), таких как анализ клинических симптомов (в том числе и гистологический анализ), выделение и наработка вирусного материала, серологический анализ, молекулярно-биологические методы на основе ПЦР.

При проведении диагностических исследований на грипп свиней широко используют серологические реакции: реакцию торможения гемагглютинации (РТГА), реакцию нейтрализации, иммуноферментный анализ для выявления антител.

С появлением новых подтипов вируса гриппа свиней, а также из-за существования значительной антигенной неоднородности внутри подтипов вируса гриппа в разных географических районах мира, диагностировать данное заболевание становится значительно труднее. Поэтому классические методы диагностики, такие как РТГА или РН необходимо совершенствовать, разрабатывая наборы к новым актуальным штаммам вируса гриппа свиней. Учитывая тот факт, что на территории РФ вакцинация против гриппа свиней не входит в перечень обязательной специфической профилактики заболевания, данные методы диагностики являются первостепенными при проведении скрининговых или мониторинговых исследований гриппа свиней.

Таким образом, очевидна необходимость создания современного референс-штамма вируса гриппа свиней H1N1-субтипа для использования в диагностике вируса гриппа методами РТГА и ПЦР и исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo.

Предлагаемый в качестве изобретения штамм является штаммом вируса гриппа H1N1-субтипа, выделенным от домашней свиньи. Данный штамм способен реплицироваться в респираторном тракте млекопитающих, вызывая патологические процессы. В связи с этим целесообразно использовать этот современный штамм для разработки методов диагностики и исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo.

Ближайшим аналогом предлагаемого штамма является штамм, используемый в «Наборе для диагностики гриппа свиней», А/Свинья/Айова/15/30, в котором в качестве диагностических сывороток используют сыворотку, полученную путем иммунизации петухов данным штаммом вируса гриппа внутримышечно (Патент RU 93012074; Суздальцева М.А., Исаченко В.А.; от 30.03.1993) [25].

Вместе с тем, описанный штамм выделен в 30-х годах 20-го века и, по причине быстрой изменчивости вируса гриппа А, может значительно отличаться антигенно и генетически от современных вариантов вируса гриппа свиней H1-субтипа. При этом для корректной и достоверной диагностики необходимо использовать современные варианты вируса гриппа H1-субтипа, как компоненты диагностических тест-систем.

Предлагаемый штамм отличается от ближайшего аналога тем, что в нем отсутствуют указанные недостатки и он пригоден для использования в заявляемой области.

Задачей настоящего изобретения является получение оригинального штамма-продуцента вируса гриппа H1N1-субтипа, который обладает по сравнению с аналогами следующими преимуществами:

- антигенными характеристиками, позволяющими проводить реакцию торможения гемагглютинации для диагностики современных штаммов вируса гриппа;

- выделен от млекопитающих и способен размножаться на моделях in vivo и in vitro (культура клеток MDCK, мышиная экспериментальная модель); достигать высоких титров - не менее 6 lg TCID₅₀/ml.

Указанная задача решена выделением, детальной характеристикой и использованием оригинального паспортизованного штамма A/swine/Siberia/lsw/2016 H1N1-субтипа.

Технический результат достигается получением штамма вируса гриппа свиней A/swine/Siberia/1sw/2016 H1N1-субтипа, используемого для приготовления антигенсодержащего препарата и поликлональной сыворотки для диагностических целей, для применения его в качестве контрольного референс-образца при оценке специфичности тест-систем на основе полимеразной цепной реакции, а также для исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo, Штамм принят на депонирование под номером 2803 в Государственной коллекции вирусов на базе Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.

Предлагаемый штамм является единственным известным штаммом вируса гриппа H1-субтипа, выделенным от свиней за последние 5 лет на территории России, для которого определена нуклеотидная последовательность полного генома. Этот факт подчеркивает важность его использования для тестирования лекарственных препаратов на животной модели (мыши, хорьки). Очевидна необходимость использования его при разработке современной диагностической системы вируса гриппа различных субтипов в РТГА.

По причине быстрой изменчивости вируса гриппа А, его антигенных свойств, крайне необходимо постоянно отслеживать антигенные изменения (в частности, поверхностного гликопротеина гемагглютинина НА) для своевременной замены штамма-продуцента для серодиагностики вируса гриппа А.

Характеристика штамма

Штамм принят на депонирование в Государственной коллекции вирусов на базе Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под номером 2803.

Штамм был выделен из гомогената легочной ткани домашней свиньи на территории Западной Сибири. Идентификация штамма осуществлена на основе анализа первичной структуры сегментов генома (Manual on animal influenza diagnosis and surveillance. World Health Organization (WHO). - 2002. - 105P) [26].

Определены первичные последовательности полного генома исследуемого штамма (табл. 1). Показана целесообразность использования штамма A/swine/Siberia/lsw/2016 H1N1-субтипа для создания антиген содержащего препарата вируса гриппа свиней Н1-субтипа, который может быть использован в диагностике гриппа методами торможения гемагглютинации при проведении реакции торможения гемагглютинации для детектирования антител к гемагглютинину H1-субтипа.

При культивировании данного штамма в культуре клеток MDCK инфекционный титр составил 6,55 lg TCID₅₀/ml. Максимальная продукция гемагглютинина в культуральной жидкости составила 1280 ГАЕ/мл. Данные свойства позволяют эффективно использовать предлагаемый штамм для получения антигена штамма A/swine/Siberia/lsw/2016 (H1N1). В эксперименте указанный штамм имел одинаковые титры в реакции гемагглютинации с эритроцитами курицы и гуся.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Динамика изменения массы тела мышей линии BALB/c после интраназального инфицирования штаммом вируса гриппа A/swine/Siberia/lsw/2016 H1N1 (опыт) в сравнении с массой неинфицированных животных (контроль). По вертикали - масса тела мышей в граммах, по горизонтали - количество суток, прошедших после инфицирования мышей. Обозначения линий: - опыт, контроль.

Фиг. 2. Репликация штамма вируса гриппа A/swine/Siberia/lsw/2016 H1N1 в легких мышей. По вертикали - титр вируса, по горизонтали - количество суток, прошедших после инфицирования мышей штаммом вируса гриппа A/swine/Siberia/lsw/2016 H1N1.

Таблица 1. Данные о геноме штамма A/swine/Siberia/lsw/2016 (H1N1)

Таблица 2. Титры сывороток крови мышей в РТГА с антигеном штамма A/swine/Siberia/1sw/2016 H1N1.

Таблица 3. Инфекционные титры штамма вируса A/swine/Siberia/1sw/2016 H1N1 при пассировании через легкие мышей линии Balb/c

Осуществление изобретения

Изобретение иллюстрируется следующими примерами

Пример 1. Получение поликлональной постинфекционной сыворотки на штамм A/swine/Siberia/1sw/2016 вируса гриппа H1N1-субтипа.

Десять 8-недельных мышей линии BALB/c интраназально инфицировали культуральной жидкостью, содержащей 1000 TCID50 штамма вируса A/swine/Siberia/1sw/2016. Объем вируссодержащей жидкости составил 50 мкл/животное. По истечении 21 суток после инфицирования у всех животных была тотально собрана кровь и получена сыворотка крови в объеме 0,3-0,5 мл от каждого животного.

Титр сыворотки в РТГА с антигеном предлагаемого штамма составил 1/320-1/640 (табл. 2). Диагностическим является значение титра сыворотки в РТГА ≥1/40. Таким образом, при интраназальном инфицировании мышей получена сыворотка, которая может использоваться для определения принадлежности к H1-субтипу вариантов вируса гриппа, антигенно близких штамму A/swine/Siberia/lsw/2016 H1N1. Для серодиагностики необходимо использовать поликлональную сыворотку в паре с антигеном данного штамма (см. пример 2).

Пример 2. Приготовление антигенсодержащего диагностического препарата на основе штамма вируса гриппа A/swine/Siberia/1sw/2016 H1N1-субтипа.

Для приготовления антигенсодержащего препарата вируссодержащую культуральную жидкость инактивировали 0,05% β-пропиолактоном при температуре 37°С в течение 2 ч. Инактивацию вируса подтверждали заражением культуры клеток MDCK в течение трех пассажей. Полученный антигенсодержащий субстрат хранили при температуре +4-+7°С в течение 12 месяцев без снижения гемагглютинирующего титра.

Таким образом, полученный антигенсодержащий препарат вируса гриппа Н1-субтипа далее может быть использован при проведении реакции торможения гемагглютинации для обнаружения антител к гемагглютинину вируса гриппа H1-субтипа в сыворотке крови. Применение предлагаемого штамма в качестве антигена для проведения РТГА описано в примере 1 (табл. 2).

Пример 3. Оценка патогенности штамма вируса гриппа A/swine/Siberia/lsw/2016 H1N1 для мышей линии BALB/c.

Для оценки патогенности штамма A/swine/Siberia/1sw/2016 H1N1 и его способности реплицироваться в легких мышей линии BALB/c инфицировали 20 животных интраназально культуральной жидкостью, содержащей 1000 TCID50 указанного штамма. Животным группы отрицательного контроля интраназально вводили 0,9% раствор хлорида натрия. Ежедневно проводили осмотр и взвешивание животных. Динамика изменения массы тела животных представлена на фиг. 1.

Как видно из представленных данных, штамм вируса гриппа A/swine/Siberia/1sw/2016 H1N1 при интраназальном инфицировании мышей линии BALB/c приводил к снижению массы тела инфицированных животных, начиная с 2-х суток после инфицирования. Максимальное снижение массы тела наблюдалось на 5-е сутки после инфицирования и составило 8,4% от первоначальной массы тела. Кроме того, у инфицированных животных наблюдались такие клинические симптомы заболевания, как снижение активности, снижение аппетита, одышка, взъерошенность шерсти. Вместе с тем, указанный штамм не вызывал гибели инфицированных животных.

На 1-е, 3-й, 5-е, 7-е и 10-е сутки после инфицирования умерщвляли по 3 животных и производили взятие легких для приготовления 10%-ных гомогенатов на 0,9%-ном растворе хлорида натрия. После этого определяли инфекционные титры вируса в легких мышей титрованием гомогенатов в культуре клеток MDCK (фиг. 2).

Показано, что штамм вируса гриппа A/swine/Siberia/1sw/2016 H1N1 реплицируется в легочной ткани инфицированных мышей линии BALB/c, однако на 7-е сутки репликация вируса наблюдалась только у одного животного из трех, а на 10-е сутки мы не обнаружили репликации вируса в легких инфицированных животных.

Пример 4. Адаптация штамма вируса гриппа A/swine/Siberia/1sw/2016 H1N1 и моделирование летальной гриппозной инфекции у мышей линии BALB/c.

Штамм A/swine/Siberia/1sw/2016 H1N1 адаптировали в серии последовательных пассажей через легкие мышей линии BALB/c. Для чего по три мыши заражали интраназально 50 мкл 0,9% раствора хлорида натрия, содержащего 10³ TCID₅₀ вируса A/swine/Siberia/1sw/2016 H1N1. Эта доза заражения выбрана, исходя из того, что в предварительных экспериментах было показано наличие выраженных симптомов заболевания на третьи-четвертые сутки после инфицирования мышей в этом диапазоне концентраций. На третьи сутки после инфицирования мышей умерщвляли и из их легких готовили 10%-ные гомогенаты на 0,9%-ном растворе хлорида натрия. После этого вновь проводили интраназальное заражение мышей 10%-ми гомогенатами легких в объеме 50 мкл. Параллельно инфекционные титры вируса в легких мышей определяли титрованием 10%-го гомогената на клетках MDCK (табл. 3).

Как следует из данных, представленных в таблице 3, инфекционный титр вируса A/swine/Siberia/1sw/2016 H1N1 увеличивался от пассажа к пассажу. После того как вирус прошел пять пассажей на мышах, был наработан его пул в культуре клеток MDCK. Инфекционный титр пула вируса был равен титру исходного вируса и составил 6,55±0,24 lg TCID50/мл. При этом 50%-ная летальная для мышей доза (MLD₅₀) составила 2,73±0,1 lgTCID₅₀/мл.

Поскольку доклинические испытания противогриппозных лекарственных препаратов проводят, главным образом, на мышах, патогенность полученного штамма была тщательно исследована в экспериментах на этих животных с использованием различных доз заражения.

Пул вируса A/swine/Siberia/1sw/2016 H1N1 использовали для интраназального заражения мышей линии BALB/c. Для этого готовили десятикратные разведения вируса на растворе Хенкса в диапазоне концентраций 10^-1-10^-5. Под легким эфирным наркозом заражали по 10 мышей подготовленными разведениями вируса в объеме 50 мкл/животное. В течение 21 суток вели наблюдение за мышами: ежедневно проводили учет павших животных. Дозу вируса, вызывающую 50%-ую гибель мышей, рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина (Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. - М.:, Медгиз, 1962. - 179 с.) [27]. Рассчитанное значение MLD₅₀ составило 2,73±0,1 lg TCID₅₀/мл.

Таким образом, при адаптации вируса A/swine/Siberia/1sw/2016 H1N1 к легким мышей, был получен летальный вариант вируса. При помощи модели гриппозной пневмонии мышей, созданной с использованием адаптированного штамма A/swine/Siberia/1sw/2016 H1N1, можно осуществлять оценку эффективности противогриппозных лекарственных препаратов in vivo.

Использованные источники информации

1. Львов Д.К. Межпопуляционные взаимодействия в системе вирусы гриппа А - животные - человек / Д.К. Львов // Вопросы вирусологии. - 2005. - №4. - С.4-11.

2. Tong, S. A distinct lineage of influenza A virus from bats / S. Tong et al. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2012. - №109(11). - P. 4269-74.

3. Webster, R.G. Evolution and ecology of influenza A viruses / R.G. Webster et al. // Microbiol Rev. - 1992. - №56. - P. 152-179.

4. Kida H. Potential for transmission of avian influenza viruses to pigs / H. Kida et al. // J Gen Virol. - 1994. - №75(9). - P. 2183-8.

5. Shope RE. Swine influenza III. Filtration experiments and etiology / RE. Shope // J Exp Med. - 1931. - №54. - P. 373-385.

6. Brown IH. The epidemiology and evolution of influenza viruses in pigs / IH. Brown // Vet Microbiol. - 2000. - Vol. 74. - P. 29-46.

7. Marozin S. Antigenic and genetic diversity among swine influenza A H1N1 and H1N2 viruses in Europe / S. Marozin et al. // J Gen Virol. - 2002. - Vol. 83. - P. 735-745.

8. Qi X. Genetic characterization of novel reassortant H1N2 influenza A viruses isolated from pigs in southeastern China / X. Qi, CP. Lu // Arch Virol. - 2006. - Vol.151. - P. 2289-2299.

9. Karasin AI. Genetic characterization of H1N2 influenza A viruses isolated from pigs throughout the United States / A.I. Karasin et al. // J. Clin. Microbiol. - 2002. - №38. - P. 2453-2456.

10. Castrucci M.R. Genetic reassortant between avian and human influenza a viruses in Italian pigs / M.R. Castrucci et al. // Virology. - 1993. - №193. - P. 503-6.

11. Martha I. Continual reintroduction of human pandemic H1N1 influenza A viruses into swine in the United States, 2009 to 2014 /I. Martha et al. // Journal of Virology. - 2015. - №89. - P. 6218-26.

12. Brown IH. History and epidemiology of swine influenza in Europe / IH. Brown // Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 2013. - №370. - P. 133-146.

13. Van Reeth K. Seroprevalence of H1N1, H3N2 and H1N2 influenza viruses in pigs in seven European countries in 2002-2003 / Van Reeth K. et al. // Influenza Other Respi. Viruses. - 2008. - №2. - P. 99-105.

14. Neumann G. and Kawaoka Y. Transmission of Influenza A Viruses / Neumann G. and Kawaoka Y. //Virology. - 2015. doi:10.1016/j.virol.2015.03.009.

15. Smith GJD. Dating the emergence of pandemic influenza A viruses / GJD. Smith et al. // Proc Natl Acad Sci USA. - 2009. - Vol. 106. - P. 11709-11712.

16. Garten RJ. Antigenic and genetic characteristics of swine-origin 2009 A H1N1 influenza viruses circulating in humans / RJ. Garten et al. // Science. - 2009. - Vol. 325. - P. 197- 201.

17. Smith GJ. Origins and evolutionary genomics of the 2009 swine-origin H1N1 influenza A epidemic / GJ. Smith et al. // Nature. - 2009. - Vol.459. - P. 1122-1125.

18. Vijaykrishna D. Reassortment of pandemic H1N1/2009 influenza A virus in swine / D. Vijaykrishna et al. // Science. - 2010. - Vol. 328. - P. 1529.

19. Watson S.J. Molecular Epidemiology and Evolution of Influenza Viruses Circulating within European Swine between 2009 and 2013 / S.J. Watson et al. // Journal of Virology. - 2015. - №89(19). - P. 9920-31.

20. Simon G. European Surveillance Network for Influenza in Pigs: Surveillance Programs, Diagnostic Tools and Swine Influenza Virus Subtypes Identified in 14 European Countries from 2010 to 2013 / G. Simon et al. // Plos one. - 2014. - DOI:10.1371/journal.pone.0115815.

21. Harder T.C. Expanded cocirculation of stable subtypes, emerging lineages, and new sporadic reassortants of porcine influenza viruses in swine populations in Northwest Germany / T.C. Harder et al. // J Virol. - 2013. - №87. - P. 10460-10476.

22. Vijaykrishna D. Long-term evolution and transmission dynamics of swine influenza A virus / D. Vijaykrishna et al. // Nature. - 2011. - №473. - P. 519-522.

23. Jhung MA. Outbreak of variant influenza A(H3N2) virus in the United States / MA. Jhung et al. // Clin Infect. Dis. - 2013. - №57(12). - P. 1703-1712.

24. Scientific opinion on the possible risks posed by the influenza A (H3N2v) virus for animal health and its potential spread and implications for animal and human health1 // EFSA Journal. - 2013. №11(10). - P. 3383.

25. Патент RU 93012074; Автор(ы): Суздальцева M.A., Исаченко В.А. НАБОР ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГРИППА СВИНЕЙ; от 30.03.1993 (МПК 6 А61К 39/145, C12N 7/00 Заявка: 93012074/13, 30.03.1993 Дата публикации заявки: 10.06.1996).

26. Manual on animal influenza diagnosis and surveillance. World Health Organization (WHO). - 2002. - 105P.

27. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях. / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. - М.: Медгиз, 1962. - 179 с.

Настоящее изобретение относится к вирусологии и медицине. Предложен штамм вируса гриппа свиней A/swine/Siberia/1sw/2016 H1N1-субтипа, выделенный из гомогената легочной ткани домашней свиньи на территории Западной Сибири и депонированный в Государственной коллекции вирусов на базе Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под номером 2803. Предложенный штамм может быть использован для приготовления антигенсодержащего субстрата и сыворотки для серодиагностики гриппа H1-субтипа в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), а также может быть применен в качестве контрольного референс-образца при оценке специфичности тест-систем методом ПЦР. С помощью предложенного штамма возможно проводить оценку эффективности противовирусных препаратов против гриппа in vitro и in vivo. 2 ил., 3 табл., 4 пр.

Штамм вируса гриппа свиней A/swine/Siberia/1sw/2016 H1N1-субтипа для приготовления антигенсодержащего субстрата и сыворотки для серодиагностики гриппа H1-субтипа в РТГА, для применения в качестве контрольного референс-образца при оценке специфичности тест-систем на основе полимеразной цепной реакции, а также для исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo, депонированный в Государственной коллекции вирусов на базе Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под номером 2803.