СПОСОБ ЛАБОРАТОРНОЙ ОЦЕНКИ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ПОВЫШЕННОЙ ПЛОТНОСТИ МОЛОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ ЖЕНЩИН ПОСТМЕНОПАУЗАЛЬНОГО ВОЗРАСТА Российский патент 2012 года по МПК A61B10/00 G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, эндокринологии и лучевой диагностике.

Структура молочных желез заметно меняется в течение жизни, включая периоды полового созревания, активной репродукции и менопаузы (Miller W.R., 1996; Семиглазов В.Ф. и соавт., 2006). Основные компоненты структуры молочных желез представлены железистой (или, иначе, эпителиальной), фиброзно-стромальной и жировой тканью. Оценка соотношения этих компонентов, как и содержания каждого из них в отдельности в молочной железе, характеризуется несомненной практической и научной ценностью для физиологии и, в особенности, патологии человеческого организма (Boyd N.F. et al., 1998, 2008). Применительно к этому особую важность представляет тот факт, что перечисленные составляющие структуры молочных желез (в зависимости от их доли/превалирования над другими компонентами) в конечном итоге определяют величину такого значимого медико-биологического показателя, как маммографическая плотность молочных желез (МПМЖ).

Медицинская значимость МПМЖ обусловлена, прежде всего, связью этого параметра с риском развития рака молочной железы, степень которого (ОР) у женщин с повышенной плотностью может доходить до 4-6 и существенно превосходит в этом отношении такие известные факторы риска данного заболевания, как ранний приход менархе, позднее наступление менопаузы и даже наличие кровных родственниц с тем же опухолевым процессом (Martin L., Boyd N.F., 2008; Boyd N.F. et al., 1995, 2010). Примечательной особенностью ситуации в данном случае является то обстоятельство, что целый ряд антропоконституциональных стигмат, наличие которых повышает риск возникновения маммарных карцином (избыток массы тела/жира в теле в менопаузе, увеличение соотношения окружности талии к окружности бедер и собственно размер молочных желез / Calle Е. et al., 2003; Берштейн, 2004; Trichopoulos D. et al., 2005/), пo отношению к МПМЖ характеризуются не позитивной, а инверсной/обратной связью (Santen R. et al., 2007; Martin L., Boyd N.F., 2008). Другая особенность состоит в том, что хотя наибольших значений степень риска рака молочной железы достигает в четвертом (верхнем) квартиле величины МПМЖ, связь между последним параметром и опасностью возникновения опухолей молочной железы возрастает линейно, увеличиваясь постепенно при переходе от первого ко второму, а затем к третьему и четвертому квартилю (Green A.K. et al., 2010).

В контексте настоящего изложения представленная выше информация указывает, во-первых, на необходимость объяснения различий (несовпадения) некоторых факторов риска повышенной МПМЖ и возникновения РМЖ, во-вторых, на то, что онкологическую настороженность следует проявлять не только при самых высоких значениях МПМЖ, и, наконец, на то, что (несмотря на доступность маммографического исследования) существует потребность в поиске лабораторных параметров, ассоциированных с повышенной маммографической плотностью, что важно не только для ее своевременного выявления, но и, в значительной степени, для понимания причин данного явления. В этом отношении существенно, что такие факторы риска РМЖ, как уровень эстрогенов и андрогенов в крови, с величиной МПМЖ корреляционной зависимостью, по сути, не связаны (Tamimi R.M. et al., 2005; Verheus M. et al., 2007; McCormack A. et al., 2009), генетические факторы находятся на стадии установления (Stone J. et al., 2007; Li J. et al., 2010), а связь МПМЖ с тощаковой и реактивной инсулинемией в противоположность содержанию в крови инсулиноподобного фактора роста-1 (Boyd N.F. et al., 2002) практически не исследовалась. Существенно, что современные представления о том, из чего складывается и чем определяется повышение МПМЖ, помимо указания на отмечавшуюся роль не только железистого, но и фиброзно-стромального компонента (Provenzano Р.О. et al., 2008) ткани молочной железы - что, по крайней мере, частично объясняет отсутствие заметной связи МПМЖ с эстрогенемией - базируются на признании значимости как митогенных, так и мутагенных (генотоксических) факторов (Martin L., Boyd N.F., 2008; Boyd N.F. et al., 2010).

Исходя из сказанного и принимая во внимание: 1) представление об эндокринно-генотоксических переключениях, под которыми понимается изменение под воздействием эндогенных или экзогенных стимулов соотношения ДНК-повреждающих и гормональных эффектов ряда пробластомогенных гормонов и метаболитов (в частности, факторов жировой ткани, эстрогенов и глюкозы) преимущественно в генотоксическую сторону, благодаря чему могут формироваться условия для повышения онкологического риска и возникновения новообразований с более агрессивным течением (Берштейн Л.М. и др., 2008); 2) способность глюкозы не только стимулировать секрецию инсулина (гормональный эффект), но и усиливать продукцию обладающих прогенотоксическим действием активных форм кислорода, АФК (Dandona P. et al., 1996; Берштейн Л.М. и др., 2006; Васильев Д.А. и др., 2008); 3) значимость гликолиза как одного из механизмов вовлечения глюкозы в создание предпосылок к возникновению новообразований и фермента глиоксалазы I как модификатора уровня побочного продукта гликолиза - метилглиоксаля, обладающего ДНК-повреждающим действием (Staniszewska M.M., Nagaraj R.H., 2006; Kalapos M.P., 2008; Резцова В.В. и др., 2008; Antognelli С. et al., 2009), и, наконец, 4) связь содержания некоторых типов циркулирующих в кровотоке стволовых клеток с состоянием углеводного обмена (Fadini G.P. et al., 2006; Руда М.М. и др., 2010) и онкологическими заболеваниями, в том числе раком молочной железы (Furstenberger G. et al., 2006; Richter-Ehrenstein С. et al., 2007), была предпринята попытка отобрать на этом основании лабораторные параметры, по отдельности или в совокупности указывающие на предрасположенность находящихся в менопаузе женщин к повышенной плотности молочных желез.

В качестве возможного прототипа данного изобретения следует рассматривать работы, в которых у обследуемых женщин репродуктивного возраста была выявлена позитивная связь между таким оцениваемым в лабораторных условиях показателем, как содержание в крови инсулиноподобного фактора роста-1 (ИПФР-1), и маммографической плотностью молочных желез (Byrne С. et al., 2000; Guo Y.P. et al., 2001; Walker К. et al., 2009). Недостатком подобного подхода, однако, является тот факт, что концентрация ИПФР-1 в крови с возрастом снижается. Хотя в то же время уменьшается и величина МПМЖ, связь между двумя этими параметрами исчезает (McCormack A. et al., 2009), что не позволяет использовать такой способ выявления группы женщин, характеризующихся предрасположенностью к повышенной маммографической плотности молочных желез, в период менопаузы.

С целью реализации намеченной выше задачи мы, после предварительной работы и в результате перебора значительного числа показателей лабораторного характера, сконцентрировали свое внимание на пяти параметрах, ассоциированных, так или иначе, с углеводным обменом и содержанием в крови одной из фракций стволовых клеток - CD90, обладающей, по некоторым данным, помимо прочих функций, свойствами белка-супрессора опухолевого роста (Abeysinghe H.R. et al., 2003). Кроме CD90, в перечень упомянутых параметров были включены соотношение уровня инсулина в крови к 120 мин перорального глюкозотолерантного теста /ПГТ/ по отношению к инсулинемии натощак (т.н. реактивная инсулинемия), интенсивность генерации активных форм кислорода в мононуклеарах к 120 мин ПГТ по отношению к реактивной инсулинемии, активность глиоксалазы в мононуклеарах натощак и отношение активности глиоксалазы в том же субстрате к 120 мин ПГТ к ее активности натощак. Техническим результатом предлагаемого способа является оптимизация подхода к описанию группы женщин постменопаузального возраста с наклонностью к повышенной маммографической плотности молочных желез на основе оценки предлагаемых лабораторных параметров, что достигается присвоением последним определенного балла в зависимости от их количественного значения.

Всего было обследовано 39 находящихся в постменопаузе женщин (средний возраст 56,3±0,3 года), которые подвергались маммографическому обследованию в ходе диспансеризации и ПГТ за несколько дней до маммографии. У 28 женщин из этой группы не было нарушений углеводного обмена, а у 11 они выявились в ходе исследования с вариацией от нарушений толерантности к углеводам до явного сахарного диабета.

Маммография выполнялась на аппаратах сходного типа, а оценка маммограмм производилась в латерально-медиальной проекции, поскольку эта проекция, наряду с косой, оптимальна для просмотра всех отделов железы. Все отобранные маммограммы с целью документации и стандартизации метода регистрировались с помощью цифрового фотоаппарата. Стромальные и эпителиальные ткани, как радиологически плотные, выглядят в маммографическом изображении темными, а жировая ткань - как более «проницаемая» - светлой; на негативном отображении на пленке картина, естественно, обратна описанной (Харченко В.П., Рожкова Н.И., 2004; Wolfe J.N. et al., 1978; Boyd N.F. et al., 1997). Суждение о плотности молочных желез основывалось на визуальной оценке маммограмм (на первом этапе и в целях сравнения - двумя независимыми экспертами) с учетом метода, предложенного N.F. Boyd et al., 1995, позволяющего выражать результаты в процентах и признаваемого, несмотря на появление компьютеризованных цифровых технологий, весьма надежным (Vachon C.M. et al., 2007). При использовании этого метода МПМЖ в обследованной группе (n=39) варьировала от 1 до 70% и была равна в среднем 19,9±3,1% при медиане 12%; у женщин без нарушений углеводного обмена (n=28) соответствующие значения находились на уровне 1-60% и 20,2±3,8% при медиане, равной 12,5%.

Все обследуемые после взятия крови из вены утром натощак подвергались ПГТ из расчета 40 г глюкозы/м² поверхности тела, после чего, как и в случае пробы, взятой натощак, брали кровь в пробирки, содержащие ЭДТА, в точке 120 мин. Определение относительного количества циркулирующих стволовых CD90+ клеток (параметр 1) осуществлялось в цельной крови методом проточной цитофлуориметрии с помощью моноклональных антител CD90-PE (Beckman-Coulter). В каждом образце исследовали 50000 событий в лимфоцитарном области, проводя анализ на приборе Cytomics FC 500 (Beckman-Coulter, США).

Мононуклеарную фракцию клеток крови выделяли в стандартных условиях в градиенте фиколла. В одной из порций мононуклеаров крови производили оценку образования активных форм кислорода (АФК). Мононуклеары (2×10⁵ клеток) вносили в кювету люминометра-VV (СПбГУ), содержащую люминол (2,5×l0⁵M). Образование АФК индуцировали частицами латекса с размером частиц 1,5 мкм, «Sigma» (7×10⁹ частиц/мл). Хемилюминесценцию (ХЛ) регистрировали на 15 минуте после добавления реагентов и рассчитывали коэффициент (К), характеризующий отношение ХЛ на 120 мин к ХЛ в точке 0 мин. В мононуклеарах, выделенных из проб, взятых в точках 0 мин (параметр 2) и 120 мин, определяли активность глиоксалазы спектрофотометрическим методом на основе образования лактоглютатиона при реакции глютатиона с метилглиоксалем (Rulli A. et al., 2006) и рассчитывали отношение этих активностей (Глиокс 120/0, параметр 3).

Инсулин крови определялся иммуноферментным методом наборами Monobind, Inc. (США) в пробах крови 0 и 120 мин, после чего рассчитывались коэффициенты Инс 120/0 (параметр 4) и К: [Инс 120/0] (параметр 5), что отражало соотношение прогенотоксического (образование АФК) и гормонального (реактивная инсулинемия) эффектов глюкозы (Берштейн Л.М. и др., 2006, 2008; Васильев Д.А. и др., 2008).

После получения индивидуальных результатов, помимо стандартной статистической обработки (вычисление медианы, средней, ошибки средней, среднего квадратического отклонения и т.д. с использованием программ «Statistica for Windows», версия 6.0 и SigmaPlot, табл.1), был проведен ранговый корреляционный анализ (табл.2; рис.1, где * обозначает р<0,05, а «Без НУО» - означает без нарушений углеводного обмена).

Табл. 1. Значения отобранных лабораторных параметров (услов. ед., М±m) у обследованных женщин в зависимости от их вхождения в группы с величиной маммографической плотности молочных желез (МПМЖ) выше и ниже определенной границы. МПМЖ Параметр 1
CD90+ Параметр 2
Глиокс 0 Параметр 3
Глиокс 120/0 Параметр 4
Инс 120/0 Параметр 5
К:[Инс 120/0] ≥13,0% 0,307±0,054 105,5±13,5 1,10±0,14 4,37±0,95. 0,91±0,17 ≤10,0% 0,370±0,060 130,0±20,9 1,60±0,20 4,60±0,50 0,46±0,06 Р     0,07   0,05

Табл. 2. Коэффициенты ранговой корреляции (R) между величиной маммографической плотности молочных желез и значениями исследованных лабораторных параметров. Лаб. параметр Вся группа Женщины без нарушений углеводного обмена R p R р CD90+ -0,22 0,20 -0,16 0,50 Глиокс 0 0,32 0,04 0,41 0,03 Глиокс 120/0 -0,23 0,16 -0,10 0,61 Инс 120/0 -0,27 0,10 -0,46 0,01 К:[Инс 120/0] 0,21 0,22 0,34 0,09

На фиг.1 коэффициенты корреляции между величиной маммографической плотности молочных желез и значениями проанализированных лабораторных параметров (см. табл.2) представлены для наглядности в графическом изображении.

В совокупности полученные результаты позволили заключить, что повышение активности глиоксалазы в мононуклеарах (0 мин) и отношения К: [Инс 120/0] сочетается с повышением плотности молочных желез, в то время как увеличение доли циркулирующих в крови клеток CD90+, отношения глиоксалаза 120/0 и отношения Инс 120/0 - с тенденцией к ее снижению.

Кроме того, в 28 наблюдениях (18 из них были представлены постменопаузальными женщинами без нарушений углеводного обмена), где была возможность обработать без пропусков все пять отобранных параметров, оценка данных была основана и на балльном принципе. В этом случае предварительно находили значение медианы для параметров 1-5 и присваивали им 1 балл или, наоборот, 0 баллов в соответствии со сведениями, приведенными в табл.3.

Табл. 3. Медиана значений отобранных лабораторных параметров у обследованных женщин (n=28) и принцип балльной оценки данных. Параметр Группа Медиана (усл.ед.) Мин. (усл.ед.) Макс. (усл.ед.) 1 балл присваивается, если значение: К:[Инс 120/0] Все 0,5385 0,045 3,02 >0,5 Без НУО 0,514 0,143 1,629 >0,5 Глиокс 0 Все 86,0 45,0 383,0 >86,0 Без НУО 89,0 45,0 383,0 >89,0 Инсулин 120/0 Все 3,55 1,416 25,19 <3,5 Без НУО 3,63 1,416 12,08 <3,6 Глиокс 120/0 Все 1,210 0,13 4,50 <1,2 Без НУО 1,13 0,13 4,50 <1,1 CD90 Все 0,24 0,05 1,23 <0,24 Без НУО 0,23 0,09 1,23 <0,23 Примечание: Без НУО - без нарушений углеводного обмена

Использование этого принципа показало (табл.4) достоверное преобладание частоты случаев, где сумма баллов была ≥4, среди женщин с МПМЖ выше 13% или 10% по сравнению с женщинами с величиной плотности молочных желез, соответственно, менее этих значений (как отмечалось выше, медиана МПМЖ у всех обследованных женщин была равна 12%, а у женщин без нарушений углеводного обмена 12,5%).

Табл. 4. Частота выявления суммы баллов, присвоенных исследованным лабораторным параметрам, ≥4 у обследованных женщин в сопоставлении с величиной маммографической плотности молочных желез. Группа Подгруппа Число наблюдений Средний балл (M±m) Частота случаев суммы ≥4 баллов, % Плотность молочных желез ≥13,0% Все 14 2,86±0,44 50,0±13,4¹ Без НУО 9 3,22±0,52 55,5±16,7%² Плотность молочных желез <13,0% Все 14 2,21±0,32 7,1±6,8¹ Без НУО 9 2,55±0,41 11,1±10,3² Плотность молочных желез ≥10,0% Все 19 2,79±0,36 42,1±11,3%³ Без НУО 12 3,17±0,44 50,0±14,4%⁴ Плотность молочных желез <10,0% Все 9 2,00±0,33 0%³ Без НУО 6 2,17±0,40 0%⁴ Примечание: Без НУО - без нарушений углеводного обмена;
р при сравнении соответствующих параметров: ¹<0,04; ²0,05; ³<0,02; ⁴<0,02

Пример 1. М.Л.В., 56 лет, менопауза 11 лет. Маммографическая плотность молочных желез 55% (т.е. существенно превышает значения средней и медианы этого показателя для группы в целом, стр.4). Результаты обследования: CD90 - 0,12 (1 балл), Инс 120/0 - 2,14 (1 балл), К: [Инс 120/0] - 0,99 (1 балл). Глиокс 0 - 383 (1 балл), Глиокс 120/0 - 0,13 (1 балл). Сумма баллов 5, что указывает на высокую вероятность повышения величины маммографической плотности молочных желез по сравнению со средним значением и медианой, то есть выявлена предрасположенность к повышенной плотности молочных желез.

Пример 2. Р.Н.В., 61 год, менопауза 13 лет. Маммографическая плотность молочных желез 11% (т.е. ниже среднего значения и медианы этого показателя для группы в целом, стр.4). Результаты обследования: CD90 - 0,18 (1 балл), Инс 120/0 - 3,67 (0 баллов). К: [Инс 120/0] - 0,34 (0 баллов), Глиокс 0 - 59 (0 баллов), Глиокс 120/0 - 2,46 (0 баллов). Сумма баллов 1, что указывает на высокую вероятность обнаружения величины маммографической плотности не выше ее среднего значения и медианы, то есть не выявлена предрасположенность к повышенной плотности молочных желез.

Таким образом, предлагаемый способ лабораторной оценки предрасположенности к повышенной маммографической плотности молочных желез женщин постменопаузального возраста (как фактора риска развития рака молочной железы) не только очерчивает комплекс полезных в этом отношении показателей, но и указывает на возможные механизмы самого повышения МПМЖ у постменопаузальных женщин, сопряженные с ослаблением эндокринного и усилением прогенотоксического эффекта глюкозы и снижением содержания в крови маркера стволовых клеток CD90+, обладающих, по некоторым данным, и функцией супрессоров опухолевого роста.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, эндокринологии и лучевой диагностике. Для оценки предрасположенности к повышенной плотности молочных желез женщин постменопаузального возраста в крови определяют пять параметров: реактивная инсулинемия, отношение генерации активных форм кислорода в мононуклеарах к реактивной инсулинемии, активность глиоксалазы в мононуклеарах натощак, отношение активности глиоксалазы на 120 мин перорального глюкозотолерантного теста к ее активности натощак и количество циркулирующих в кровотоке стволовых клеток CD90+. Каждый параметр оценивают в баллах. Если сумма баллов ≥4, делается вывод о предрасположенности к повышенной плотности молочных желез. Способ позволяет оптимизировать подход к описанию группы женщин постменопаузального возраста с наклонностью к повышенной маммографической плотности молочных желез на основе оценки лабораторных параметров, указывающих на возможные механизмы самого повышения маммографической плотности молочной железы, сопряженные с ослаблением эндокринного и усилением прогенотоксического эффекта глюкозы и снижением содержания в крови маркера стволовых слеток CD90+, обладающих, по некоторым данным, и функцией супрессоров опухолевого процесса. 1 ил., 4 табл.

Способ лабораторной оценки предрасположенности к повышенной плотности молочных желез женщин постменопаузального возраста, отличающийся тем, что оценку проводят по пяти параметрам: реактивная инсулинемия, отношение генерации активных форм кислорода в мононуклеарах к реактивной инсулинемии, активность глиоксалазы в мононуклеарах натощак, отношение активности глиоксалазы на 120 мин перорального глюкозотолерантного теста к ее активности натощак и количество циркулирующих в кровотоке стволовых клеток CD90+, присваивают каждому параметру в зависимости от его величины "0" или "1" балл, при этом среди женщин без нарушений углеводного обмена 1 балл присваивают при наличии: CD90+<0,23 усл.ед., реактивная инсулинемия <3,6 усл.ед., отношение генерации активных форм кислорода в мононуклеарах к реактивной инсулинемии >0,5 усл.ед., активность глиоксалазы в мононуклеарах натощак >89,0 усл.ед., отношение активности глиоксалазы на 120 мин перорального глюкозотолерантного теста к ее активности натощак <1,1 усл.ед., а среди всех остальных женщин 1 балл присваивают при наличии: CD90+ <0,24 усл.ед., реактивная инсулинемия <3,5 усл.ед., отношение генерации активных форм кислорода в мононуклеарах к реактивной инсулинемии >0,5 усл.ед., активность глиоксалазы в мононуклеарах натощак >86,0 усл.ед., отношение активности глиоксалазы на 120 мин перорального глюкозотолерантного теста к ее активности натощак <1,2 усл.ед., и при сумме баллов ≥4 делают вывод о предрасположенности к повышенной плотности молочных желез.