СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ПОРАЖЕНИЯ ПЕЧЕНИ ПРИ ФОРМИРОВАНИИ СИНДРОМА СОЧЕТАННЫХ ДИСТРОФИЧЕСКИ-ДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ПРИ ЛОКАЛЬНОМ ХРОНИЧЕСКОМ ВОСПАЛИТЕЛЬНОМ ПРОЦЕССЕ И СРЕДСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2012 года по МПК A61K31/4045 A61P1/16 A61P29/00 

Изобретения относятся к области медицины и могут быть использованы в качестве основного лечебно-профилактического мероприятия и средства, направленных на предупреждение поражения печени при формировании синдрома сочетанных дистрофически-дегенеративных изменений мезенхимальных производных при локальном хроническом воспалительном процессе.

Современные условия техногенной цивилизации способствуют широкому распространению воспалительных заболеваний. Многие исследователи связывают высокую частоту хронических заболеваний различных органов и систем с воздействием неблагоприятных экологических факторов, несвоевременным и неадекватным лечением острых инфекционно-воспалительных процессов, развивающихся на фоне несовершенного иммунного ответа на этиологический фактор.

Длительное существование фокальной (локальной) персистирующей инфекции вызывает определенное изменение функционирования основных гомеостатических систем и, как следствие, структурную перестройку органов и тканей организма. Описан синдром сочетанных дистрофически-дегенеративных изменений мезенхимальных производных при локальном хроническом воспалительном процессе (синдром СДДИМП при ЛХВП) (Команденко Н.И., Жураковский И.П., Рыжов А.И. Синдром сочетанных дистрофически-дегенеративных изменений в производных мезенхимы при воздействии фокальной персистирующей инфекции. Свидетельство об интеллектуальной собственности, зарегистрированное ВНТИЦ 07.08.2002 г., №72200200029), основным составляющим которого является реакция соединительной ткани (Команденко Н.И., Рыжов А.И., Жураковский И.П. Остеохондроз позвоночника: Монография. - Новосибирск: Сибмедиздат НГМУ, 2006. - 246 с.). Как показывает клиническая практика, при наличии очагов хронической инфекции часто диагностируется полиорганная патология, связанная с усиленным фиброгенезом на фоне неспецифических реактивных воспалительных процессов. При этом данные изменения зачастую затрагивают печень, проявляясь неспецифическим реактивным гепатитом и фиброзом.

Если для лечения заболеваний, вызываемых этиологическими факторами, воздействующими непосредственно на печень (вирусные, алкогольные гепатиты, паразитарные заболевания печени и др.), разработано немало средств, то средств для лечения и предупреждения поражения печени при синдроме СДДИМП при ЛХВП в настоящее время нет, и в этом случае применяют только симптоматические средства.

Поскольку мы не нашли в уровне техники сведений о средствах для профилактики и лечения патологии печени, обусловленной СДДИМП при ЛХВП, рассмотрим известные работы и средства, направленные на лечение заболеваний, вызываемых этиологическими факторами, воздействующими непосредственно на печень.

В некоторых работах (при заболеваниях, вызываемых этиологическими факторами, воздействующими непосредственно на печень) показано, что фиброз печени может иметь обратное развитие. Так, был продемонстрирован его регресс после хирургической декомпрессии билиарной обструкции у пациентов с хроническим панкреатитом, вызвавшем стеноз общего желчного протока (Hammel P, Couvelard A, O'Toole D, et al. Regression of liver fibrosis after biliary drainage in patients with chronic pancreatitis and stenosis of the common bile duct. N Engl J Med. 2001 Feb 8; 344(6):418-23).

При хроническом гепатите C долговременная терапия интерфероном-альфа даже при отсутствии вирусологического ответа способствует уменьшению фибротических явлений (Dufour JF, DeLellis R, Kaplan MM. Regression of hepatic fibrosis in hepatitis С with long-term interferon treatment. Dig Dis Sci. 1998 Dec; 43(12):2573-6; Poynard T, McHutchison J, Manns M, et al. Impact of pegylated interferon alfa-2b and ribavirin on liver fibrosis in patients with chronic hepatitis C. Gastroenterology. 2002 May; 122(5):1303-13). Аналогичные данные отмечаются при применении рибавирина (Poynard Т, McHutchison J, Manns M, et al. Impact of pegylated interferon alfa-2b and ribavirin on liver fibrosis in patients with chronic hepatitis C. Gastroenterology. 2002 May; 122(5):1303-13).

Последние годы ознаменовались определенными успехами в расшифровке механизмов, приводящих к формированию фиброза. Это определило современные направления разработки терапевтического лечения рассматриваемой патологии. Так, было предложено ингибировать факторы, влияющие на ангиогенез: на сосудистый эндотелиальный фактор роста было предложено воздействовать рапамицином (rapamycin); на тромбоцитарный фактор роста - воздействовать препаратом гливек (Gleevec), что позволило уменьшить портальную гипертензию и выраженность соединительнотканных разрастаний в портальной системе (Fernandez M, Mejias M, Garcia-Pras E, et al. Reversal of portal hypertension and hyperdynamic splanchnic circulation by combined vascular endothelial growth factor and platelet-derived growth factor blockade in rats. Hepatology. 2007; 46:1208-1217).

Однако большинство современных исследований по фиброзу печени сфокусировано на роли клеток Ито. Воздействие на них ретинола или ферментов, регулирующих его обмен, может нивелировать процесс активации звездчатых клеток печени. Так, в эксперименте, ингибирование диацилглицерол ацилтрансферазы (фермента, регулирующего обмен ретинола) привело к уменьшению фиброза печени (Yamaguchi K, Yang L, McCall S, et al. Diacylglycerol acyltranferase 1 antisense oligonucleotides reduce hepatic fibrosis in mice with nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 2008; 47:625-635).

Учитывая, что TGF-β поддерживает клетки Ито в состоянии активации и стимулирует продукцию соединительной ткани, был показан антифибротический эффект траниласта (tranilast), который тормозил действие этого цитокина при неалкогольном жировом гепатозе (Uno М, Kurita S, Misu H, et al. Tranilast, an antifibrogenic agent, ameliorates a dietary rat model of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 2008; 48:109-118). Аналогичным действием обладает метилендиоксибензен (methylenedioxybenzene) (Oh SW, Kim DH, На JR, Kim DY. Anti-fibrotic effects of a methylenedioxybenzene compound, CW209292 on dimethylnitrosamine-induced hepatic fibrosis in rats. Biol Pharm Bull. 2009 Aug; 32(8):1364-70).

Армепавин (armepavine) обладает многогранным воздействием на активированные клетки Ито, в том числе на генном уровне, что обуславливает его антифибротический эффект (Weng TC, Shen CC, Chiu YT, et al. Inhibitory effects of armepavine against hepatic fibrosis in rats. J Biomed Sci. 2009 Sep 2; 16:78).

В экспериментах подтверждено, что фактором, способствующим обратному развитию фиброза, может быть индукция апоптоза звездчатых клеток печени глиотоксином (gliotoxin) (Wright MC, Issa R, Smart DE, et al. Gliotoxin stimulates the apoptosis of human and rat hepatic stellate cells and enhances the resolution of liver fibrosis in rats. Gastroenterology. 2001; 121:685-698) или его производным - синаптофизином (synaptophysin) (Douglass A, Wallace K, Parr R, et al. Antibody-targeted myofibroblast apoptosis reduces fibrosis during sustained liver injury. J Hepatol. 2008; 49:88-98).

Олмесартан (olmesartan), обладая антиоксидантными свойствами и способностью тормозить активацию клеток Ито, также препятствует развитию фиброза (Kurita S, Takamura T, Ota T, et al. Olmesartan ameliorates a dietary rat model of nonalcoholic steatohepatitis through its pleiotropic effects. Eur J Pharmacol. 2008; 588:316-324).

Определенные успехи в изучении возможной коррекции фиброза печени с помощью растительных препаратов представлены в работах, использующих традиционные китайские или тибетские рецепты (Wang YP, Cheng ML, Zhang BF, et al. Effects of blueberry on hepatic fibrosis and transcription factor Nrf2 in rats. World J Gastroenterol. 2010 Jun 7; 16(21):2657-63; Yang Q, Xie RJ, Geng XX, Luo XH, Han B, Cheng ML. Effect of Danshao Huaxian capsule on expression of matrix metalloproteinase-1 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in fibrotic liver of rats. World J Gastroenterol. 2005; 11:4953-4956; Tasci I, Mas MR, Vural SA, et al. Pegylated interferon-alpha plus taurine in treatment of rat liver fibrosis. World J Gastroenterol. 2007; 13:3237-3244; Geng XX, Yang Q, Xie RJ,. et al. Effects of Dan-Shao-Hua-Xian on the expression of collagen type I and III in rats with hepatic fibrosis. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2004; 3:558-563; Geng XX, Yang Q, Xie RJ, et al. In vivo effects of Chinese herbal recipe, Danshaohuaxian, on apoptosis and proliferation of hepatic stellate cells in hepatic fibrotic rats. World J Gastroenterol. 2005; 11:561-566; Yang FR, Fang BW, Lou JS. Effects of Haobie Yangyin Ruanjian decoction on hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats. World J Gastroenterol. 2010 Mar 28; 16(12):1458-64; Kim HK, Yang TH, Cho HY Antifibrotic effects of green tea on in vitro and in vivo models of liver fibrosis. World J Gastroenterol. 2009 Nov 7; 15(41):5200-5; Peng XD, Dai LL, Huang CQ, et al. Correlation between anti-fibrotic effect of baicalin and serum cytokines in rat hepatic fibrosis. World J Gastroenterol. 2009 Oct 7; 15(37):4720-5; Ginsburg I, Koren E, Horani A, et al. Amelioration of hepatic fibrosis via Padma Hepaten is associated with altered natural killer Т lymphocytes. Clin Exp Immunol. 2009 Jul; 157(1):155-64).

Однако такие из описанных выше лекарственных средств, как гливек, траниласт, рапамицин, ольмесартан медоксомил являются достаточно токсичными. Гливек (Glivec) является противоопухолевым препаратом. Его применение может сопровождаться изменениями со стороны системы кроветворения, нервной и сердечно-сосудистой систем, органов зрения; отмечаются нарушения метаболизма и питания, психические нарушения. Траниласт обладает мембраностабилизирующим, бронходилатирующим, противоаллергическим действием. При его применении в ряде случаев отмечаются побочные действия со стороны центральной нервной системы, органов желудочно-кишечного тракта и кроветворения, мочевыделительной системы. Ольмесартан медоксомил показан при эссенциальной артериальной гипертонии. При его применении могут отмечаться побочные действия на сердечно-сосудистую, дыхательную, пищеварительную, центральную нервную системы, органы кроветворения. Рапамицин является макролидом и иммуносупрессором, он применяется при профилактике отторжения трансплантата (у взрослых больных с низким и умеренным иммунологическим риском). К его побочным действиям относятся развитие лимфоцеле, нарушение заживления ран, развитие грибковых, вирусных и бактериальных инфекций, гепатотоксичность.

Другие вышеописанные средства (метилендиоксибензен (methylenedioxybenzene), армепавин (armepavine), глиотоксин (gliotoxin), синаптофизин (synaptophysin)) не являются лекарственными средствами.

И, наконец, как выше уже было подчеркнуто, рассмотренные средства предназначены для лечения тех заболеваний печени, которые вызываются этиологическими факторами, воздействующими непосредственно на печень (в исследованиях на людях это был вирус гепатита или воздействие желчи на печень в результате стеноза общего желчного протока; в экспериментах на животных использовались модели острого повреждения печени с помощью четыреххлористого углерода, диметилнитрозамина или лигирования общего желчного протока). Развитие патологии печени, в частности, фиброза в этом случае идет иным путем, чем при СДДИМП при ЛХВП.

Остановимся на этом подробнее.

В описанных исследованиях наблюдались грубые деструктивные изменения клеток печени с образованием некрозов и выраженной воспалительной реакцией. Основную роль в продукции соединительной ткани в этом случае играют клетки Ито (жирозапасающие клетки, звездчатые клетки печени), расположенные в перисинусоидальном пространстве. При гепатитах различной этиологии в результате повреждения гепатоцитов из них выделяются биологически активные вещества, включающие перекиси и протеазы. Эти вещества активируют макрофаги печени, а также клетки эндотелия синусоидов. Активированные клетки, в свою очередь, начинают секретировать биологически активные вещества, вызывающие активацию клеток Ито. К разряду подобных веществ относятся провоспалительные цитокины - интерлейкин-1 (IL-1), фактор некроза опухоли альфа (TNFα), перекиси, оксид азота, эндотелин, но главная роль в активации липоцитов принадлежит тромбоцитактивирующему фактору (PDGF), активатору плазминогена, трансформирующему фактору роста бета 1 (TGFβ1). Под их воздействием клетки Ито выходят из состояния покоя, становятся активированными и трансформируются в миофибробластоподобный фенотип, приобретая способность к продукции компонентов экстрацеллюлярного матрикса, в том числе коллагена и протеогликанов.

Развитие фиброза в описанных исследованиях идет следующим путем: разрушение гепатоцитов → некроз, воспаление, сопровождающиеся активацией макрофагов печени, клеток эндотелия синусоидов → активация клеток Ито → продукция компонентов экстрацеллюлярного матрикса, в том числе коллагена и протеогликанов.

При развитии синдрома СДДИМП при ЛХВП, находящемся вне печени, наблюдается совершенно иная ситуация и развитие фиброза идет иным путем. В организме формируется очаг хронической инфекции в отдаленном органе (в данном случае, в большеберцовой кости), что исключает непосредственное воздействие на печень. Это приводит не к прямому поражению печени, а к системным изменениям мезенхимальных производных в организме, в том числе и к изменениям морфофункциональной организации соединительной ткани, находящейся в печени. В данном случае имеет место не острое воздействие на печень, приводящее к массовой гибели клеточных элементов и, как следствие, к запуску воспалительного процесса в печени, а хроническое, сопровождающееся умеренными дистрофическими изменениями гепатоцитов. Как будет показано ниже нашими исследованиями, при развитии синдрома СДДИМП при ЛХВП мы не наблюдали классических этапов развития фиброза печени: повреждения гепатоцитов, выделения ими биологически активных веществ, активации этими веществами макрофагов печени и эндотелия сосудов, выделения провоспалительных цитокинов, активации ими клеток Ито с трансформацией их в миофибробласты, способные секретировать коллаген и протеогликаны. При развитии синдрома СДДИМП при ЛХВП происходит изменение мезенхимальных производных в организме, приводящее, в том числе, к активации фибробластов и повышенной рекрутизации тканевых базофилов, которые способствуют пролиферации фибробластов и синтезу коллагена (Berton A, Levi-Schaffer F, Emonard H, Garbuzenko E, Gillery P, Maquart FX. Activation of fibroblasts in collagen lattices by mast cell extract: a model of fibrosis // Clin Exp Allerg. - 2000. - 30. - p.485-492; Garbuzenko E, Berkman N, Puxeddu I, Kramer M, Nagler A, Levi-Schaffer F. Mast cells induce activation of human lung fibroblasts in vitro // Exp Lung Res. - 2004. - 30. - p.705-721; Garbuzenko E, Nagler A, Pickholtz D, Gillery P, Reich R, Maquart FX, Levi-Schaffer F. Human mast cells stimulate fibroblast proliferation, collagen synthesis and lattice contraction: a direct role for mast cells in skin fibrosis // Clin Exp Allergy. - 2002. - 32. - p.237-246).

Развитие фиброза в печени при синдроме СДДИМП при ЛХВП идет следующим путем: повышенный выход плазматических клеток и базофилов в области триад → активация фибробластов и их пролиферация → продукция компонентов экстрацеллюлярного матрикса, в том числе коллагена и протеогликанов → нарушение организации соединительной ткани в печени.

Таким образом, развитие фиброза в печени при заболеваниях, когда этиологический фактор воздействует непосредственно на печень и при синдроме СДДИМП при ЛХВП, идет различными путями, поэтому известные современные средства, рассмотренные выше, будут малоэффективными при синдроме СДДИМП при ЛХВП.

Это обуславливает значимость разработки лечебно-профилактических мероприятий и средств, препятствующих разрастанию соединительной ткани в печени при синдроме СДДИМП при ЛХВП вне печени.

Из уровня техники известны исследования на животных, где на моделях острого повреждения печени показано, что гормон эпифиза - мелатонин - оказывает цитопротективный эффект за счет своей антиоксидантной способности, что в свою очередь ведет к меньшей выраженности фиброза печени (Tahan V, Ozaras R, Canbakan B, et al. Melatonin reduces dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis in rats. J Pineal Res. 2004; 37:78-84; Cruz A, Padillo FJ, Torres E, et al. Melatonin prevents experimental liver cirrhosis induced by thioacetamide in rats. J Pineal Res. 2005; 39:143-150; Hong RT, Xu JM, Mei Q Melatonin ameliorates experimental hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats. World J Gastroenterol. 2009 Mar 28; 15(12):1452-8; Tahan G, Akin H, Aydogan F, Ramadan SS, Yapicier O, Tarcin O, Uzun H, Tahan V, Zengin K. Melatonin ameliorates liver fibrosis induced by bile-duct ligation in rats. Can J Surg. 2010 Oct; 53(5):313-8).

Авторами данных работ были выявлены следующие эффекты мелатонина: уменьшение гибели гепатоцитов, уменьшение активации клеток Ито, меньшая выраженность фиброза печени.

Как уже было показано выше, при использовании моделей острого повреждения печени не наблюдается активация фибробластов рыхлой волокнистой неоформленной соединительной ткани портальных трактов и окружения центральных вен печени (наблюдаемая при синдроме СДДИМП при ЛХВП), поскольку для их активации необходим определенный период времени, связанный с рекрутизацией тканевых базофилов и активацией их плазматическими клетками, что в данных моделях отсутствует, но присутствует при синдроме СДДИМП при ЛХВП.

Поэтому авторами известных работ не было выявлено влияние мелатонина на активированные фибробласты и тучные клетки и на те механизмы развития фиброза, которые имеют место в случае синдрома СДДИМП при ЛХВП.

Раскрытие изобретений

Предлагается средство для предупреждения (профилактики) поражения печени при формировании синдрома сочетанных дистрофически-дегенеративных изменений мезенхимальных производных при локальном хроническом воспалительном процессе, находящемся вне печени (СДДИМП при ЛХВП, находящемся вне печени), представляющее собой гормон пинеальной железы - мелатонин.

Предлагаемый способ предупреждения (профилактики) поражения печени при формировании синдрома сочетанных дистрофически-дегенеративных изменений мезенхимальных производных при локальном хроническом воспалительном процессе (находящемся вне печени) (СДДИМП при ЛХВП) характеризуется тем, что в затемненном помещении перед сном в организм вводят мелатонин в эффективной дозе, например, в дозе 0,7-1,5 мг/кг веса, эффективным курсом, например, в течение 5-10 дней.

Технические результаты изобретения-средства и изобретения-способа:

1) профилактика поражения печени при формировании синдрома СДДИМП при ЛХВП: уменьшение микроциркуляторных нарушений; предотвращение дистрофических изменений паренхиматозных клеток, разрастания соединительной ткани, изменения строения стенок сосудов печеночных вен; предотвращение увеличения количества тучных клеток в окружении сосудов портальных трактов;

2) поскольку мелатонин является синтетическим аналогом гормона шишковидной железы (эпифиза), его токсичность низка, а побочные эффекты - минимальны.

Перечень фигур иллюстративного материала

Фиг.1. Участок печени крысы через 2 месяца после воспроизведения очага хронической инфекции со значительным расширением синусоидных капилляров, в просвете которых выявлялись множественные эритроцитарные агрегаты. Окр. гематоксилином и эозином. Ув.×400.

Фиг.2. Участок печени крысы через 2 месяца после воспроизведения очага хронической инфекции с дистрофически измененными гепатоцитами, имеющими повышенное сродство к эозину. На фигуре они выглядят более темными, хроматин плохо различается, ядрышки не выявляются. Окр. гематоксилином и эозином. Ув.×400.

Фиг.3. Участок печени крысы через 2 месяца после воспроизведения очага хронической инфекции с проведенным курсом введения мелатонина. Отмечается нормализация микроциркуляторного русла печени, приводящая к уменьшению дистрофических изменений гепатоцитов. Окр. гематоксилином и эозином. Ув.×400.

Фиг.4. Участок печени крысы через 3 месяца после воспроизведения очага хронической инфекции. Коллагеновые волокна соединительной ткани, окружающей центральные вены, становились более грубыми, проявляли высокое сродство к пикрофуксину. В части случаев пучки волокон образовали радиальную корону вокруг сосуда, расходясь на значительное расстояние. Образовавшиеся волокна соединительной ткани видны вокруг сосуда в виде муфты, оттеснившей гепатоциты (сравните с фиг.6, где разрастание соединительной ткани предотвращено). Окр. пикрофуксином по Ван Гизону. Ув.×400.

Фиг.5. Участок печени крысы через 3 месяца после воспроизведения очага хронической инфекции с проведенным курсом введения мелатонина. Центральные вены и синусоидные капилляры свободны от форменных элементов. Окр. гематоксилином и эозином. Ув.×400.

Фиг.6. Участок печени крысы через 3 месяца после воспроизведения очага хронической инфекции с проведенным курсом введения мелатонина. Центральные вены имели обычное строение, разрастания соединительной ткани не наблюдалось. Окр. пикрофуксином по Ван Гизону. Ув.×400.

Сведения, подтверждающие реализацию назначения

Исследования были проведены на 30 крысах-самцах Вистар. Все животные были разделены на 5 групп по 6 животных в каждой группе. В первой группе были интактные животные. У остальных животных с помощью Золотистого стафилококка был воспроизведен хронический остеомиелит большеберцовой кости. Эти животные были разделены на следующие 4 группы:

2-я группа - животные с хроническим воспалением через 2 месяца от момента воспроизведения у них хронического остеомиелита;

3-я группа - животные с хроническим воспалением через 2 месяца от момента воспроизведения у них хронического остеомиелита, которым за 7 дней до забора материала внутрибрюшинно вводили мелатонин в дозе 1 мг/кг веса в течение 7 дней в вечернее время (с 19.00 до 19.30) с последующим затемнением помещения на ночной период (с 20.00 до 8.00) (т.е. мелатонин вводили животным в течение восьмой недели от момента воспроизведения у них хронического остеомиелита);

4-я группа - животные с хроническим воспалением через 3 месяца от момента воспроизведения у них хронического остеомиелита;

5-я группа - животные с хроническим воспалением через 3 месяца от момента воспроизведения у них хронического остеомиелита и через 1 месяц после окончания введения крысам внутрибрюшинно мелатонина в дозировке 1 мг/кг веса в течение 7 дней в вечернее время (с 19.00 до 19.30) с последующим затемнением помещения на ночной период (с 20.00 до 8.00) (т.е. мелатонин вводили животным в течение восьмой недели от момента воспроизведения у них хронического остеомиелита).

В экспериментах использовали дозу мелатонина 1 мг/кг веса животного, но может быть использована и другая эффективная доза, например, 0,7-1,5 мг/кг веса.

Мелатонин вводят эффективным курсом, например, 5-10 дней. Курс лечения целесообразно периодически повторять.

Печень фиксировали в 12% формалине и жидкости Теллесницкого. Из залитых в парафин объектов делали серийные срезы толщиной 7 мкм.

Состояние паренхимы печени и соединительной ткани портальных трактов и окружения центральных вен оценивалось при обзорной микроскопии после окраски срезов гематоксилином и эозином Эрлиха. Коллагеновые волокна выявлялись пикрофуксином по Ван Гизону, сульфатированные гликозаминогликаны - альциановым синим при pH 1,0. С помощью программного обеспечения ImageJ 1.42g определялась площадь, занимаемая этими структурами в области триад, образованных вокругдольковыми, междольковыми сосудами, в стенках и окружении центральных вен. Популяция тучных клеток оценивалась на препаратах, окрашенных альциановым синим при pH 1,25 с последующей докраской ядер кармалюмом Майера.

При изучении срезов печени, окрашенных гематоксилином Эрлиха и эозином, а также пикрофуксином по Ван Гизону через 2 месяца после воспроизведения очага хронической инфекции (2-я группа), обращала на себя внимание хорошо выраженная дольчатость печени. Печеночные дольки имели полигональную форму, как правило, в них четко выявлялось балочное строение. Внутри печеночных долек отмечались участки как умеренного, так и значительного расширения синусоидных капилляров с соответствующими изменениями выстилающих их эндотелиоцитов. Последние часто в значительной степени были уплощены, их ядра прижаты к базальной мембране, гиперхромны. В просвете синусоидных капилляров часто выявлялись множественные эритроцитарные агрегаты (фиг.1). Центральные вены в большинстве долек были расширены, иногда значительно. В части из них отмечался стаз. В балках гепатоциты имели обычную форму, в них выявлялось одно или два ядра с обычной формой и нормальным строением. В ядрах отдельных клеточных элементов гранулы хроматина выявлялись нечетко, было нарушено его распределение. Встречались участки паренхимы с дистрофически измененными клеточными элементами. Цитоплазма таких гепатоцитов имела повышенное сродство к эозину, а ядра чаще были пикнотично изменены (фиг.2). Кроме того, выявлялись отдельные гепатоциты, ядра которых находились в состоянии рексиса или лизиса. В местах скопления дистрофически измененных гепатоцитов концентрировались лимфоидные элементы. В отдельных случаях при этом формировались временные лимфоидные образования. Изредка среди гепатоцитов встречались полиплоидные клетки с большим количеством хроматина в ядре, характер распределения его был равномерный.

На срезах 2-й группы, окрашенных альциановым синим, отмечалось достоверное по отношению к 1-й группе увеличение площади сульфатированных гликозаминогликанов основного вещества соединительной ткани в области триад, образованных междольковыми сосудами. Указанная площадь в группе 2 (1364,04 мкм²) по сравнению с аналогичной площадью у интактных животных (991,65 мкм²) была увеличена на 37,6% (таблица 1). Достоверных отличий между группами 1 и 2 в распределении хондроитинсульфатов в области триад, образованных более мелкими (вокругдольковыми) сосудами, не отмечалось. Увеличение же площади сульфатированных гликозаминогликанов в стенках и окружении центральных вен также было достоверно. Указанная площадь в группе 2 отличалась от соответствующей площади в группе 1 очень значительно (на 140,4%) (таблица 1). Было отмечено повышенное количество тканевых базофилов в портальных трактах.

На срезах 2-й группы, окрашенных пикрофуксином по Ван Гизону (таблица 2), отмечалось достоверное по отношению к 1-й группе увеличение площади коллагеновых волокон межклеточного вещества соединительной ткани в области триад, образованных как мелкими (вокругдольковыми) сосудами (увеличение составило 161,4%: 406,87 мкм² во 2-й группе против 155,64 мкм² в 1-й группе), так и более крупными (междольковыми) сосудами (указанная площадь во 2-й группе увеличилась на 98,8% по сравнению с группой интактных животных). Было выявлено также достоверное возрастание площади коллагеновых волокон в стенках и окружении центральных вен 2-й группы по сравнению с контролем (на 142,6%; таблица 2).

Описанные изменения свидетельствуют об имевших место во 2-й группе микроциркуляторных нарушениях, сопровождающих застойные явления в системе печеночных вен; развившейся на этом фоне тканевой гипоксии с умеренными дистрофическими изменениями паренхиматозных клеток; легкой воспалительной реакции, проявлявшейся в концентрации лимфоидных элементов в местах скопления дистрофически измененных гепатоцитов; разрастании соединительной ткани в области триад, в стенках и окружении центральных вен.

При изучении морфологической картины срезов печени в аналогичный срок у группы с проведенным курсом введения мелатонина (3 группа), отмечалось сохранение балочных структур и дольчатого строения органа. Венозные сосуды были умеренно расширенными. В балках гепатоциты имели обычную форму, в них выявлялось одно или два ядра с обычной формой и нормальным строением. Как исключение в ядрах отмечалось смещение гранул хроматина по направлению к ядерной оболочке, а еще реже образование конгломератов, которые выявлялись на одном из полюсов ядра. Цитоплазма подавляющего большинства гепатоцитов слабо воспринимала эозин, гранулярное ее строение при этом не всегда было четко выражено. Синусоидные клетки имели чаще всего обычное строение, однако в ряде случаев они были не только укрупнены, но и в их цитоплазме выявлялись в том или ином количестве приблизительно одинаковой величины и формы гранулы. Синусоиды имели обычное строение, диаметр их был уменьшен по сравнению с предыдущей группой, эритроцитарных агрегатов не встречалось (фиг.3).

На срезах печени 3-й группы, окрашенных альциановым синим, площадь сульфатированных гликозаминогликанов в стенках и окружении центральных вен достоверно не отличалась от контроля. Указанная площадь в группе животных, которым вводился мелатонин (3-я группа), достоверно снизилась по отношению к группе животных без введения мелатонина (группа 2) и составила 50,7% от нее (табл.1). Количество тучных клеток в области портальных трактов соответствовало их количеству в контрольной группе.

На срезах 3-й группы, окрашенных пикрофуксином по Ван Гизону (табл.2), отмечается достоверное по отношению ко 2-й группе снижение площади коллагеновых волокон межклеточного вещества соединительной ткани в области триад, образованных как мелкими (вокругдольковыми), так и более крупными (междольковыми) сосудами. Указанная площадь в 3-й группе не отличается достоверно от 1-й группы, что указывает на эффективность воздействия мелатонина. На срезах 3-й группы также было выявлено достоверное по отношению ко 2-й группе снижение площади коллагеновых волокон в стенках и окружении центральных вен (табл.2).

Описанные изменения свидетельствовали об эффективности воздействия мелатонина: нормализации микроциркуляции на фоне улучшения кровообращения в системе печеночных вен; уменьшении тканевой гипоксии, сопровождающейся лишь незначительными дистрофическими изменениями гепатоцитов; отсутствии воспалительной реакции; отсутствии коллагенообразования в области триад при достоверно меньшем его синтезе в стенках и окружении центральных вен; снижении концентрации хондроитинсульфатов в стенках и окружении центральных вен; уменьшении количества тучных клеток по сравнению с предыдущей группой.

При оценке паренхиматозно-стромальных взаимоотношений в печени через 3 месяца после воспроизведения очага хронической инфекции (4 группа) отмечалась следующая динамика. В дольках гепатоциты, принимающие участие в образовании печеночных балок, имели полиморфное строение: они были несколько увеличены в размерах или, напротив, уменьшены. Подавляющее большинство гепатоцитов интенсивно воспринимало эозин и гранулярное строение цитоплазмы их не всегда было четко выражено. В ядрах гепатоцитов гранулы хроматина выявлялись нечетко, было несколько нарушено их распределение. В единичных клетках имело место нарушение кариолеммы. Отмечались явления кариорексиса и кариолизиса. Обращало на себя внимание неодинаковое строение ядер гепатоцитов в дольках, что касалось прежде всего содержания хроматина и характера распределения гранул в кариоплазме. Смещение гранул к кариолемме и снижение содержания гранул приводило к тому, что центральные части таких ядер оказывались светлыми (пустыми). В различных участках печени нередко выявлялись полиплоидные и двуядерные клетки. При изучении балочной системы обращало на себя внимание состояние стенки значительно расширенных синусоидных капилляров, в просвете которых часто выявлялись агрегаты эритроцитов. Эндотелиоциты и клетки Купфера, как правило, были укрупнены, их ядра несколько гиперхромны и пикнотизированы, цитоплазма часто содержала мелкие включения. Прослойки междольковой соединительной ткани вокруг триад выглядели увеличенными, разволокненными, пространства Малла были значительно расширены. Определенные изменения наблюдались и со стороны сосудов системы печеночных вен. Так, коллагеновые волокна соединительной ткани, окружающей центральные вены, становились более грубыми, проявляли высокое сродство к пикрофуксину. В части случаев пучки волокон образовали радиальную корону вокруг сосуда, расходясь на значительное расстояние (фиг.4).

На срезах 4-й группы, окрашенных альциановым синим (табл.1), отмечалось достоверное по отношению к 1-й группе увеличение площади сульфатированных гликозаминогликанов основного вещества соединительной ткани в области триад, образованных вокругдольковыми, междольковыми сосудами, а также в стенках и окружении центральных вен. Кроме того, отмечалось значительно возросшее количество тучных клеток в области триад.

На срезах 4-й группы, окрашенных пикрофуксином по Ван Гизону (табл.2), отмечалось достоверное по отношению к 1-й группе и сильно выраженное увеличение площади коллагеновых волокон межклеточного вещества соединительной ткани в области триад, образованных вокругдольковыми, междольковыми сосудами, а также в стенках и окружении центральных вен.

Описанные изменения свидетельствуют об имевших место выраженных микроциркуляторных нарушениях, сопровождающих застойные явления в системе печеночных вен; развившейся на этом фоне тканевой гипоксии с умеренными дистрофическими изменениями паренхиматозных клеток; легкой воспалительной реакции, проявлявшейся в концентрации лимфоидных элементов в местах скопления дистрофически измененных гепатоцитов; выраженном разрастании соединительной ткани в области триад и окружении центральных вен; повышенном количестве тучных клеток в области триад.

Через 1 месяц после проведенного курса введения мелатонина, в группе животных с воспроизведенным 3 месяца назад хроническим воспалительным процессом (группа 5), при изучении срезов печени, окрашенных гематоксилином Эрлиха и эозином, а также пикрофуксином по ван Гизону, на фоне общего сохранения структуры печени отмечались следующие изменения в структуре печеночных долек, печеночных балок и междольковой соединительной ткани. Прежде всего, наблюдалась нормализация диаметра центральных вен, которые чаще всего оказывались свободными от форменных элементов. Диаметр синусоидных капилляров, расположенных между печеночными балками, практически не отличался от контроля (интактных животных). Просветы синусоидных капилляров были свободны от форменных элементов (фиг.5). Гепатоциты имели обычную форму и величину, ядра занимали центральное положение. Часто встречались двуядерные клеточные элементы, ядра которых по форме и размерам оказывались почти одинаковыми. Цитоплазма клеток слабее, нежели в норме, воспринимала кислый краситель. Как исключение, встречались клетки с гипо- или гиперхромными ядрами. Иногда наблюдались скопления лимфо- и гранулоцитарных элементов вокруг гепатоцитов в отдельных дольках печени.

На срезах, окрашенных альциановым синим, площадь сульфатированных гликозаминогликанов в стенках и окружении центральных вен была достоверно ниже аналогичного показателя у животных, не получавших курс коррекции мелатонином, и составляла 67,8% от него (таблица 1). Количество тучных клеток практически не отличалось от их количества в группе интактных животных.

На срезах 5-й группы, окрашенных пикрофуксином по Ван Гизону (таблица 2), наблюдается достоверное по отношению к 4-й группе и очень существенное снижение площади коллагеновых волокон межклеточного вещества соединительной ткани в области триад, образованных мелкими (вокругдольковыми), более крупными (междольковыми) сосудами, а также в стенках и окружении центральных вен (фиг.6). Причем указанные площади в группе 5 настолько приближаются к контролю (группе 1), что различия между ними не являются достоверными.

Описанные изменения свидетельствовали о сохраняющейся нормализации микроциркуляции на фоне улучшения кровообращения в системе печеночных вен; отсутствии признаков тканевой гипоксии; наличии репаративной реакции в виде увеличения количества двуядерных гепатоцитов; отсутствии воспалительной реакции; отсутствии коллагенообразования в области триад при достоверно меньшем его синтезе в стенках и окружении центральных вен; отсутствии возрастания концентрации хондроитинсульфатов в области триад, образованных мелкими сосудами; достоверно меньшей их концентрацией в стенках и окружении центральных вен; уменьшении количества тучных клеток по сравнению с предыдущей группой.

Таким образом, приведенные данные показывают, что применение мелатонина предотвращает поражение печени в виде дисциркуляторных нарушений, тканевой гипоксии и дистрофии гепатоцитов, разрастания соединительной ткани, склерозирования сосудов печеночных вен при формировании синдрома сочетанных дистрофически-дегенеративных изменений мезенхимальных производных при локальном хроническом воспалительном процессе.

Таблица 1 Площадь сульфатированных гликозаминогликанов основного вещества соединительной ткани в области портальных трактов, в стенках и окружении центральных вен в мкм² (M±m)   1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа Площадь, занимаемая сульфатированными гликозаминогликанами в портальных трактах, образованных вокругдольковыми сосудами 225,92±14,97 209,48±15,07 178,00±19,51* 273,16±13,91* 245,26±16,44 Площадь, занимаемая сульфатированными гликозаминогликанами в портальных трактах, образованных междольковыми сосудами 991,65±85,44 1364,04±81,49* 1312,15±96,87* 1278,82±104,83* 1295,76±81,00* Площадь, занимаемая сульфатированными гликозаминогликанами в стенках и окружении центральных вен 87,00±5,44 209,18±15,58* 106,12±8,67# 235,53±18,88* 159,76±13,04*# * - достоверные отличия по сравнению с интактными животными, # - достоверные отличия между группами с введением и без введения мелатонина в аналогичные сроки после воспроизведения хронической инфекции.

Таблица 2 Площадь коллагеновых волокон межклеточного вещества соединительной ткани в области портальных трактов, в стенках и окружении центральных вен в мкм² (M±m)   1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа Площадь, занимаемая коллагеновыми волокнами в портальных трактах, образованных вокругдольковыми сосудами 155,64±17,54 406,87±32,96* 176,48±11,53# 1584,12±105,46* 176,00±18,04# Площадь, занимаемая коллагеновыми волокнами в портальных трактах, образованных междольковыми сосудами 910,97±98,03 1810,86±193,49* 1035,60±102,77# 5606,39±496,87* 1439,33±174,92# Площадь, занимаемая коллагеновыми волокнами в стенках и окружении центральных вен 188,70±18,10 457,85±40,08* 255,93±24,82*# 2654,30±314,46* 226,55±37,44# * - достоверные отличия по сравнению с интактными животными, # - достоверные отличия между группами с введением и без введения мелатонина в аналогичные сроки после воспроизведения хронической инфекции.

Предлагается средство для предупреждения (профилактики) поражения печени при формировании синдрома сочетанных дистрофически-дегенеративных изменений мезенхимальных производных при локальном хроническом воспалительном процессе, находящемся вне печени (СДДИМП при ЛХВП, находящемся вне печени), представляющее собой гормон пинеальной железы - мелатонин, и соответствующий способ предупреждения (профилактики) поражения печени при формировании СДДИМП при ЛХВП. Изобретение обеспечивает: уменьшение микроциркуляторных нарушений; предотвращение дистрофических изменений паренхиматозных клеток, разрастания соединительной ткани, изменения строения стенок сосудов печеночных вен; предотвращение увеличения количества тучных клеток в окружении сосудов портальных трактов; при этом токсичность мелатонина низка, а побочные эффекты - минимальны. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл.

1. Средство для профилактики поражения печени при формировании синдрома сочетанных дистрофически-дегенеративных изменений мезенхимальных производных при локальном хроническом воспалительном процессе, находящемся вне печени, представляющее собой мелатонин.

2. Способ профилактики поражения печени при формировании синдрома сочетанных дистрофически-дегенеративных изменений мезенхимальных производных при локальном хроническом воспалительном процессе, характеризующийся тем, что в затемненном помещении перед сном в организм вводят мелатонин в эффективной дозе, например, в дозе 0,7-1,5 мг/кг веса, эффективным курсом, например, в течение 5-10 дней.