БИОМАРКЕРЫ РАКА Российский патент 2012 года по МПК G01N33/574 G01N33/96 

Настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного гомеодоменсодержащего фактора транскрипции, такого как пептид HOX или пептид EN-2, в качестве биомаркера рака предстательной железы.

Рак предстательной железы в настоящее время является ведущей причиной связанной с раком смертности у мужчин, убивающей 10000 мужчин ежегодно только в UK. Однако доступность в настоящее время биомаркеров для неинвазивной детекции рака предстательной железы является по существу ограниченной простатическим специфическим антигеном (PSA). Уровни PSA в сыворотке значительно повышены у пациентов с раком предстательной железы, и тест PSA в настоящее время используют, чтобы следить за прогрессированием заболевания и его ответом на лечение.

К сожалению, у теста PSA существует ряд существенных недостатков. Поскольку уровни PSA также значительно повышены при других, не относящихся к раковым, состояниях предстательной железы, таких как простатит и доброкачественная гипертрофия, не всегда является несомненным, что детекция увеличения уровней PSA действительно является показателем рака предстательной железы у пациента. Более того, уровни PSA не обязательно коррелируют с объемом заболевания или с развитием метастазов в узлах или кости.

Недавние попытки использовать такие признаки, как соотношение свободного PSA к общему и «прирост уровня концентрации PSA», показаны как большей частью безуспешные, из-за очень высокого уровня ложноположительных результатов, что приводит к большому числу не являющихся необходимыми инвазивных биопсий.

Действительно, считают, что уровни PSA повышаются только очень медленно при раке предстательной железы, так что заболевание часто успевает стать прогрессирующим до того, как получают положительный результат при измерении уровней PSA. Более того, уровни PSA необходимо нормализовать, так как они могут меняться с возрастом и размером предстательной железы.

Существует также ряд дополнительных потенциальных химических маркеров рака предстательной железы, включая калликреины, и с более недавнего времени, 80 кДа фрагменты e-кадгерина (Kuefer et al., 2005). Снова, эти биомаркеры проявляют тенденцию обладать многими из существенных недостатков, обсуждаемых выше по отношению к PSA.

Таким образом, в данной области существует необходимость в надежном биомаркере рака предстательной железы.

Неожиданно, авторы изобретения обнаружили, что гомеозисный фактор транскрипции, HOXC4, секретируется из опухолей предстательной железы, и его концентрация в сыворотке значительно повышена у пациентов с раком предстательной железы. Таким образом, присутствие HOXC4 в жидкостях организма, таких как сыворотка, является применимым показателем рака предстательной железы как на ранней, так и на поздней стадии.

Авторы настоящего изобретения обнаружили также, что второй HOX белок, HOXB6, и третий белок HOXB5, также показывают сходные результаты. HOXA3 и HOXD9 также рассматривают как применимые в качестве биомаркеров.

Далее авторы настоящего изобретения идентифицировали гомеодоменсодержащий фактор транскрипции Engrailed 2 (EN-2) как экспрессирующийся на уровне и РНК, и белка в линиях клеток, происходящих от рака предстательной железы, LNCaP и PC3, а также в первичных клетках рака предстательной железы. Более того, белок EN-2 может секретироваться в окружающую клетки среду.

Неожиданно, повышенные уровни всех этих маркеров рака можно детектировать у пациентов с раком предстательной железы, даже когда обнаружено, что уровни PSA являются нормальными. Это дополнительно иллюстрирует, что маркеры по настоящему изобретению являются более надежными при диагностике рака предстательной железы при сравнении с другими маркерами, такими как PSA.

Таким образом, в первом аспекте, настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного гомеодоменсодержащего фактора транскрипции, или его фрагмента, в качестве биомаркера рака предстательной железы. Примеры гомеодоменсодержащих факторов транскрипции включают пептиды HOX и EN-2. Изобретение также относится к способу диагностики заболевания раком предстательной железы, включающему детекцию по меньшей мере одного гомеодоменсодержащего фактора транскрипции в образце от пациента.

Является особенно предпочтительным, чтобы по меньшей мере один пептид HOX, или EN-2, или его фрагмент, можно было детектировать в жидкости организма.

Предпочтительно биомаркер представляет собой один HOXC4. Также является предпочтительным, чтобы биомаркер представлял собой один HOXB5 или, более предпочтительно, один HOXB6. Также является предпочтительным, чтобы биомаркер представлял собой один EN-2. Также является предпочтительным, чтобы биомаркер представлял собой один HOXA3. Также является предпочтительным, чтобы биомаркер представлял собой один HOXD9. Однако комбинации также являются предпочтительными. Такие комбинации включают HOXC4 и HOXB5; HOXC4 и HOXB6; HOXB5 и HOXB6; HOXC4, HOXB5 и HOXB6; EN-2 и HOXC4; EN-2 и HOXB5; EN-2 и HOXB6; EN-2, HOXC4 и HOXB5; EN-2, HOXC4 и HOXB6; EN-2, HOXB5 и HOXB6; EN-2, HOXC4, HOXB5 и HOXB6. Такие комбинации могут также дополнительно содержать один или оба из HOXA3 и/или HOXD9. Дополнительные комбинации включают HOXA3 и HOXD9; HOXA3 и HOXC4; HOXA3 и HOXB5; HOXA3 и HOXB6; HOXA3 и EN-2; HOXD9 и HOXC4; HOXD9 и HOXB5; HOXD9 и HOXB6; HOXD9 и EN-2. Особенно предпочтительная комбинация маркеров содержит один или несколько из, предпочтительно, все из HOXC4, HOXB5, HOXB6 и EN-2.

Предпочтительно, жидкость организма представляет собой сыворотку или мочу. Другие предпочтительные жидкости организма обсуждают ниже.

Гены HOX представляют собой семейство гомеодоменсодержащих факторов транскрипции, которые определяют идентичность клеток и тканей в ходе раннего развития (обзор дан Morgan, 2006). В недавних публикациях, включая Miller et al., 2003, эффективно идентифицировали каждый отдельный белок, который экспрессируется и остается внутри клеток, в опухолевых клетках при раке предстательной железы. Естественно, это означает что идентифицировали всего приблизительно 10000-12000 белков, включая пептиды HOX.

Однако авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что среди этих тысяч белков, экспрессирующихся в клетках рака предстательной железы, белок HOXC4, например, обнаружен вне клеток и является отличным биомаркером рака предстательной железы.

Это является неожиданным по ряду причин. Во-первых, HOXC4 представляет собой фактор транскрипции, и, таким образом, обнаружение его в сыворотке является неожиданным. Во-вторых, хотя известны другие биомаркеры рака предстательной железы, обнаружение надежного биомаркера остается труднодостижимым, смотри, например, проблемы, описанные выше по отношению к PSA. Действительно, HOXC4 является биомаркером как для ранней стадии, так и, в частности, для поздней стадии, как показано на фигуре 1.

Таким образом, этот белок не был идентифицирован ранее как биомаркер рака предстательной железы, хотя известно, что он экспрессируется в клетках рака предстательной железы, вместе с многими тысячами других белков, многие из которых нельзя описать как биомаркеры рака предстательной железы. Это также применимо к другим пептидам HOX, включая HOXB5 и HOXB6.

Подобно пептидам HOX, белки Engrailed (En) также представляют собой гомеодоменсодержащие факторы транскрипции, которые обладают очень высокой степенью функционального консерватизма в ходе развития (обзор дан Morgan, 2006). Исходный ген En охарактеризован у Drosophila, где мутант по En являлся неспособным формировать границу между передним и задним крылом (Garcia-Bellido and Santamaria, 1972). Подобным образом, гомологи En у позвоночных играют регуляторные роли в ходе развития, что включает развитие конечностей и как раннюю спецификацию, так и в последующие миграции аксонов нервной системы (Morgan, 2006).

В дополнение к регуляции транскрипции, белки EN обладают рядом других, по-видимому, несвязанных свойств, которые являются функционально важными. Первым из них является способность секретироваться из клеток и интернализоваться другими клетками (Cosgaya et al, 1998; Joliot et al., 1998, обзор дан Morgan, 2006). Точная механистическая основа этого явления неизвестна, хотя является ясным, что это зависит от консервативной последовательности для экспорта из ядра, локализованной в гомеодомене (Maizel et al., 1999; Chatelin et al., 1996; Derossi et al., 1996; Joliot et al., 1997).

Недавно показано, что в дополнение к его роли в развитии, EN-2 является потенциальным онкогеном при раке молочной железы (Martin et al., 2005). Для не вызывающих образование опухолей линий клеток молочной железы мыши, в которых вызывали экспрессию EN-2, впоследствии показали ряд злокачественных характеристик, включая укорачивание клеточного цикла и потерю контакта клетки с клеткой. Кроме того, сайленсинг EN-2 с помощью РНКи показывает, что он является необходимым для поддержания трансформированного фенотипа в линии клеток рака молочной железы человека.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что экспрессия EN-2 повышена в линии клеток LNCaP, происходящих из рака предстательной железы, и в образцах тканях человека из аденокарциномы предстательной железы, и он секретируется оттуда. Более того, EN-2 секретируется из клеток протоков и опухолей - аденокарцином, и присутствует в моче пациентов с раком предстательной железы. Это первый случай, когда предположили, что EN-2 является маркером рака предстательной железы.

Предпочтительно, детектируют присутствие или отсутствие по меньшей мере одного гомеодоменсодержащего фактора транскрипции, такого как пептид HOX, или пептид EN-2, или его фрагмента.

Предпочтительно, по меньшей мере один пептид HOX выбран из любого пептида HOX, как перечислено ниже, при условии, что пептид HOX, или его фрагмент поддается детекции в жидкости организма, такой как сыворотка или моча.

Предпочтительно, по меньшей мере один пептид HOX, или его фрагмент происходит из подсемейства HOXA, HOXB, HOXC или HOXD. Если используют более одного пептида HOX, тогда они могут происходить из одного и того же семейства или из комбинации семейств. Предусматривают также комбинации фрагментов, либо фрагментов одного и того же белка, либо фрагментов различных белков. Комбинации различных пептидов могут обеспечивать более точные диагнозы. Является предпочтительным, чтобы пептид HOX не представлял собой HOXA4, HOXA1, HOXA7, HOXB3 или HOXB9.

Является особенно предпочтительным, чтобы пептид HOX представлял собой пептид HOXC4, и/или пептид HOXB6, и/или пептид HOXB5, и/или пептид HOXA3, и/или пептид HOXD9, или их фрагменты.

Предпочтительно, пептид HOXC4 представляет собой пептид, представленный в последовательности ID NO. 1 (инвентарный no. в NCBI P09017, gi: 123279), или его фрагмент. Предпочтительно, пептид HOXB6 представляет собой пептид, представленный в последовательности ID NO. 2 (инвентарный no. в NCBI P17509, gi: 116242515), или его фрагмент. Предпочтительно, пептид HOXB5 представляет собой пептид, представленный в последовательности ID NO. 3 (инвентарный no. в NCBI P09067, gi: 400000), или его фрагмент. Предпочтительно, пептид EN-2 представляет собой пептид, представленный в последовательности ID NO. 4 (инвентарный no. в NCBI P19622, gi: 21903415) или его фрагмент. Предпочтительно, пептид HOXA3 представляет собой пептид, представленный в последовательности ID NO.5 (инвентарный no. мРНК в NCBI NM_030661, gi: 84043946), или его фрагмент. Предпочтительно, пептид HOXD9 представляет собой пептид, представленный в последовательности ID NO.6 (инвентарный no. мРНК в NCBI NM_014213, gi: 23397673), или его фрагмент.

В то время как приведена ссылка на HOXC4, пептид HOXC4 или его фрагмент, следует понимать, что эти термины можно использовать взаимозаменяемо, если не очевидно иное. Тому же самому подчиняются другие пептиды HOX и EN-2.

Более того, когда здесь приведена ссылка на HOXC4, HOXB6, HOXB5, HOXA3 или HOXD9, это также применимо к другим пептидам HOX, или их комбинациям, если не очевидно иное.

Подобным образом, когда здесь приведена ссылка на конкретную последовательность, такую как контрольная последовательность или последовательность ID NO, это применимо ко всем последовательностям ID NO и к любой из последовательностей HOX, представленных ниже, если не очевидно иное.

Предпочтительно, фрагмент содержит по меньшей мере 80% гомологии последовательности с контрольной последовательностью (например, HOXC4, HOXB6, HOXB5, HOXA3, HOXD9 или EN-2), более предпочтительно, 85%, более предпочтительно, 90%, более предпочтительно, 95%, более предпочтительно, 97%, более предпочтительно, 99% и, наиболее предпочтительно, 99,9% гомологии последовательности с контрольной последовательностью, или является настолько близким к ней, насколько необходимо. Подходящие способы для определения гомологии последовательности включают использование программы BLAST.

Предпочтительно, фрагмент содержит по меньшей мере 80% идентичности последовательности с контрольной последовательностью (например, HOXC4, HOXB6, HOXB5, HOXA3, HOXD9 или EN-2), более предпочтительно, 85%, более предпочтительно, 90%, более предпочтительно, 95%, более предпочтительно, 97%, более предпочтительно, 99% и, наиболее предпочтительно, 99,9% идентичности последовательности с контрольной последовательностью или является настолько близким к ней, насколько необходимо. Подходящие способы для определения гомологии последовательности включают использование программы BLAST.

Говорят, что два полипептида являются «гомологичными», в том смысле, в котором этот термин используют в настоящем описании, если последовательность одного из полипептидов обладает достаточно высокой степенью идентичности или сходства с последовательностью другого полипептида. «Идентичность» означает, что в любом конкретном положении в выровненных последовательностях аминокислотный остаток является идентичным между последовательностями. «Сходство» обозначает, что в любом конкретном положении в выровненных последовательностях аминокислотный остаток принадлежит к сходному типу между последовательностями. Степени идентичности и сходства можно легко вычислить (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; и Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). Процентная идентичность, на какую ссылаются здесь, является такой, как определено с использованием BLAST версии 2.1.3 с использованием параметров по умолчанию, указанных в NCBI (Национальный центр биотехнологической информации; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [Матрица Blosum 62; штраф за внесение делеции=11 и штраф за продолжение делеции=1].

Предпочтительно, фрагмент содержит по меньшей мере четыре последовательных аминокислоты из контрольной последовательности, более предпочтительно, по меньшей мере 5, более предпочтительно, по меньшей мере 6, более предпочтительно, по меньшей мере 7, более предпочтительно, по меньшей мере 8 последовательных аминокислот из контрольной последовательности, такой как последовательность ID NO. 1, 2, 3, 4, 5 или 6, хотя более длинные фрагменты по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 225 и вплоть до по меньшей мере 250 аминокислот также являются предпочтительными. Фрагменты также включают усеченные пептиды, обладающие x аминокислотами, делетированными с N-конца и/или C-конца. В таких усечениях x может представлять собой 1 или более (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более), но предпочтительно менее чем 150.

Без связи с теорией, считают, что HOXC4 секретируется через неклассический путь, без необходимости в сигнальной последовательности. Таким образом, считают, что последовательность, приведенная в последовательности ID NO. 1, является такой же самой, как белок, обнаруженный в сыворотке. Это подтверждается наблюдением, что детектируемая полоса обладает размером (Mw), соответствующим предсказанному размеру, основанному на последовательности гена. Белки HOX могут также покидать клетки посредством других механизмов, например, лизиса клеток.

Термин «биомаркер» используют повсеместно в данной области, и он означает отличительный биологический или имеющий биологическое происхождение показатель процесса, события или состояния. Иными словами, биомаркер является показателем конкретного биологического состояния, такого как присутствие раковой ткани. В некоторых случаях различные формы биомаркеров могут являться показателями конкретных состояний заболевания, однако, без связи с теорией, считают, что просто присутствие повышенных уровней пептида HOXC4 или его фрагмента в жидкостях организма, таких как сыворотка, является показателем рака предстательной железы. Хотя в настоящее время не предусмотрено, что различные гликоформы, например, пептида HOXC4 секретируются, тем не менее, они охвачены настоящим изобретением. Например, различные гликоформы, такие как с измененной структурой гликоформы или содержанием сахара, могут еще определить для HOXC4, но они также являются охваченными и даже могут также являться показателями прогрессирования рака предстательной железы. Усечения, мутации или делеции пептида HOXC4 или его фрагмента или присоединения к нему или его фрагменту, также предусмотрены.

Однако принципиальным открытием, лежащим в основе настоящего изобретения, является то, что существует значительное увеличение уровня HOXC4, которое можно детектировать в жидкостях организма, таких как сыворотка. Считают, что HOXC4 секретируется, но предусматривают, что это может быть обусловлено тем, что белок HOXC4 вытекает из умирающих клеток. Подобным образом, EN-2 может секретироваться, или его можно детектировать в жидкостях организма из-за вытекания из разрушенных или мертвых клеток. Такие увеличенные уровни являются показателями рака предстательной железы как на ранней стадии, так и на поздней стадии. В то время как существует значительное повышение между контрольным или нормальным уровнями и ранней стадией рака предстательной железы, существует также очень значительное увеличение между ранней и поздней стадией рака предстательной железы. В широком смысле, представляет собой преимущество по настоящему изобретению то, что можно детектировать вещество, а также состояние рака предстательной железы. Это облегчает прогноз и обеспечение соответствующих видов терапии.

Преимуществом настоящего изобретения является то, что оно способно отличать такие состояния, как доброкачественная гиперплазия предстательной железы BTH (BPH). Такие состояния, которые приводят к увеличению предстательной железы, можно неправильно интерпретировать как рак предстательной железы с использованием разработанных способов для определения наличия рака предстательной железы, таких как пальцевое ректальное исследование (DRE). Другим преимуществом настоящего изобретения является то, что точный диагноз можно предоставить без обращения к неприятным и потенциально опасным инвазивным процедурам, которые также могут являться неточными. Более того, настоящее изобретение является особенно чувствительным. Предпочтительно, способами по настоящему изобретению можно детектировать появление рака предстательной железы ранее любого другого способа детекции и ранее появления выраженных симптомов рака предстательной железы. Таким образом, рак можно лечить на ранней стадии, когда он является более чувствительным к такому лечению и менее вероятно войдет в стадию метастазирования.

Известны различные типы рака предстательной железы. Наиболее распространенный начинается в клетках предстательной железы и является известным как аденокарцинома предстательной железы. Однако существуют другие формы рака предстательной железы, такие как саркомы, мелкоклеточные карциномы и переходно-клеточные карциномы. Способы по изобретению можно использовать для детекции появления любого из этих типов рака, хотя детекция аденокарциномы является предпочтительной.

Прогрессирование рака мониторируют способом разделения на стадии. Это показывает, насколько хорошо развился рак и распространился ли он. Баллы продвигаются от одного до четырех, где прогноз постепенно ухудшается на каждой стадии.

Стадия один: Злокачественные клетки заключены в предстательной железе; они не распространяются до лимфатических узлов или других органов; баллы по шкале Глисона составляют между двумя и четырьмя, и менее пяти процентов предстательной железы состоит из растущей опухоли.

Стадия два: Баллы по шкале Глисона составляют пять или выше, или для более чем пяти процентов железы показан аномальный рост; рак еще ограничен предстательной железой.

Стадия три: Злокачественные клетки распространяются до семенных пузырьков, но не до лимфатических узлов или других органов.

Стадия четыре: Поражены лимфатические узлы, ткани таза или более отдаленные органы.

Предпочтительно, способами по изобретению детектируют появление рака предстательной железы до или во время стадии один или стадии два, более предпочтительно, стадии один.

Пептидные биомаркеры по настоящему изобретению можно использовать в способах диагностики, например, для клинического скрининга и в способах прогностической оценки, мониторинга результатов терапии, идентификации пациентов, с наиболее вероятным ответом на конкретное терапевтическое лечение, для скрининга и разработки лекарственных средств. Более того, биомаркеры по настоящему изобретению и их применения являются полезными для идентификации новых видов лечения лекарственными средствами и для обнаружения новых мишеней для лечения лекарственными средствами.

Таким образом, в следующем аспекте, изобретение относится к способу диагностики или мониторинга прогрессирования рака предстательной железы, включающему детекцию и/или количественное определение по меньшей мере одного гомеодоменсодержащего фактора транскрипции, такого как пептид HOX или пептид EN-2 или их фрагмент. Предпочтительно, пептид содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5 или 6, или состоит из нее. Предпочтительно, по меньшей мере один пептид HOX, пептид EN-2, или их фрагмент, присутствует в биологическом образце от тестируемого субъекта. Указанный биологический образец предпочтительно представляет собой образец жидкости организма.

Жидкость организма может представлять собой любую жидкость организма человека, включая клеточную жидкость, цереброспинальную жидкость (CSF), сперму, мочу, кровь, лимфу или слюну. Однако является особенно предпочтительным, чтобы жидкость организма представляла собой цельную кровь, в частности сыворотку крови, или мочу. Является предпочтительным также, чтобы жидкость организма в основном или полностью не содержала целых/интактных клеток. Предпочтительно, жидкость организма не содержит тромбоцитов и клеточного дебриса (такого как полученный при лизисе клеток). Предпочтительно, жидкость организма не содержит как прокариотических, так и эукариотических клеток.

Такие жидкости можно получать посредством любого числа способов, известных в данной области, таких, какие будут очевидными специалисту в данной области. Например, образец мочи легко доступен, в то время как образцы крови или сыворотки можно получить парентерально, например, с использованием иглы и шприца. Не содержащие клеток или в основном не содержащие клеток образцы можно получить, подвергая жидкость организма обработке различными способами, известными специалистам в данной области, которые включают в качестве неограничивающих примеров центрифугирование и фильтрацию.

Хотя, как правило, предпочтительно не использовать инвазивных способов для получения образца, тем не менее, может быть предпочтительным получение таких образцов, как гомогенаты тканей, срезы тканей и биоптаты.

Способы мониторинга по настоящему изобретению можно использовать для детекции появления, прогрессирования, стабилизации, улучшения и/или ремиссии рака предстательной железы. Таким образом, детекцию по меньшей мере одного пептида HOX, пептида EN-2 или их фрагмента, можно использовать для определения прогрессирования заболевания, чтобы указывать врачу на конкретное лечение.

Предпочтительно, обеспечивают по меньшей мере две стадии детекции и/или количественного определения, предпочтительно, разделенные по времени, например несколькими сутками, неделями, годами или, более предпочтительно, месяцами, для определения, изменились ли уровни по меньшей мере одного пептида HOX, или EN-2, или их фрагмента, таким образом, показывая, присутствовало ли изменение в прогрессировании рака. Это позволяет делать сравнения между уровнем биомаркера в образцах, взятых на двух или более приемах, так как увеличение уровня пептида в течение времени является показателем появления или прогрессирования рака, в то время как уменьшение уровня пептида может указывать на улучшение и/или ремиссию рака.

Предпочтительно, способ диагностики или мониторинга в соответствии с настоящим изобретением включает сравнение уровня пептида, присутствующего в тестируемом образце, с уровнем в одном или нескольких контролях. Предпочтительно, контроли могут происходить от того же самого пациента, из предыдущего образца, чтобы таким образом мониторировать появление или прогрессирование. Однако является предпочтительным также, чтобы контроли можно было нормализовать для популяции, в частности здоровой или нормальной популяции, без рака предстательной железы. Иными словами, контроль может состоять из уровня биомаркера, обнаруженного в нормальном контрольном образце от нормального субъекта.

Таким образом, представлен способ диагностики рака предстательной железы, включающий количественное определение или детекцию количества по меньшей мере одного пептида HOX, пептида EN-2 или их фрагмента, и сравнение количества указанного пептида в указанном тестируемом образце с количеством, присутствующим в нормальном биологическом образце от нормального субъекта или от того же самого субъекта задолго до возникновения заболевания. Если значительное увеличение уровня по меньшей мере одного пептида HOX, пептида EN-2 или их фрагмента обнаружено в тестируемом образце, это является показателем того, что заболевание либо прогрессирует, либо началось.

Как указано выше, этот способ детекции по меньшей мере одного пептида HOX, пептида EN-2 или их фрагмента является особенно полезным для детекции ранней стадии рака предстательной железы и является более чувствительным, чем общепринятый тест детекции уровней PSA. Таким образом, способы по изобретению являются особенно полезными для подтверждения рака, когда пациента тестируют как отрицательного по раку с использованием общепринятых способов, таких как детекция PSA.

В общем, уровень секреции по меньшей мере одного пептида HOX или пептида EN-2 в жидкости организма лежит в диапазонах, описанных ниже.

Будет понятно, что термины «пептид» и «белок» являются взаимозаменяемыми, как используют их в настоящем описании, если не очевидно иное.

Например, в таблице 1 и на фигуре 1 показано очень значительное увеличение концентраций белка HOXC4 в сыворотке. В таблице 2 и на фигуре 2 показаны сходные результаты для HOXB6. Авторы настоящего изобретения также показали, что HOXB6 является биомаркером поздней стадии рака предстательной железы (данные не представлены). HOXB5 также является биомаркером, однако он является менее предпочтительным, чем HOXB6 или HOXC4 (Таблица 3 и фигура 7). Другие альтернативные биомаркеры включают HOXA3 и HOXD9 (смотри фигуру 8).

Предпочтительно, увеличение является статистически значимым, определенным с использованием общепринятых способов, таких как «t-тест» при условии доверительных интервалов предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 85%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, более предпочтительно, по меньшей мере 95%, более предпочтительно, по меньшей мере 97%, более предпочтительно, по меньшей мере 99%, более предпочтительно, по меньшей мере 99,5%, более предпочтительно, по меньшей мере 99,95% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 99,99%.

Предпочтительно, увеличение между контролем и образцом, показательное для ранней стадии рака предстательной железы, составляет приблизительно 110-200%, более предпочтительно, приблизительно 120-180%, более предпочтительно, приблизительно 130-160%, более предпочтительно, приблизительно 140-150%, более предпочтительно, приблизительно 110-140%, более предпочтительно, 115-130%, более предпочтительно, приблизительно 120-130%, более предпочтительно, приблизительно 120-140% и, наиболее предпочтительно, приблизительно 125%. Предусматривают также другие комбинации вышеуказанных конечных точек.

По отношению к определению рака на поздней стадии или прогрессирующего рака, увеличение между контролем и образцом, показательное для указанной поздней стадии рака предстательной железы, составляет приблизительно 400-800%, более предпочтительно, приблизительно 450-750%, более предпочтительно, приблизительно 500-700%, более предпочтительно, приблизительно 520-680%, более предпочтительно, приблизительно 540-640%, более предпочтительно, приблизительно 550-620%, более предпочтительно, приблизительно 560-600%, более предпочтительно, приблизительно 570-590% и, наиболее предпочтительно, приблизительно 580%. Увеличение может также лежать в диапазоне 550-800% или 400-600%. Предусматривают также другие комбинации вышеуказанных конечных точек.

Увеличение между раком на ранней и на поздней стадии можно измерять по сравнению с нормальным (т.е. свободным от рака) контролем или с образцом на ранней стадии или контролем от того же самого пациента. По отношению к образцу на ранней стадии, предпочтительным является увеличение приблизительно между 100% и 300%, более предпочтительно, приблизительно между 150% и 250%, более предпочтительно, приблизительно между 175% и 225%, более предпочтительно, приблизительно между 185% и 215%, более предпочтительно, приблизительно между 100% и 220%, более предпочтительно, приблизительно между 170% и 300% и, наиболее предпочтительно, приблизительно 200%.

Как упомянуто выше, когда в настоящем документе ссылаются на по меньшей мере один гомеодоменсодержащий пептид, это относится к пептидам HOX, таким как HOXC4, HOXB6, HOXB5, HOXA3 и HOXD9, и к пептиду EN-2, если не очевидно иное.

Когда в настоящем документе ссылаются на по меньшей мере один пептид HOX или пептиды HOX, это относится к HOXC4, HOXB6, HOXB5, HOXA3 и HOXD9, в частности, так же как к другим пептидам HOX, перечисленным ниже, если не очевидно иное.

В терминах абсолютных количеств по меньшей мере одного белка HOX или EN-2 на мл жидкости организма, предпочтительно, сыворотки, это составляет предпочтительно приблизительно 0,5-1,5 нг/мл, более предпочтительно, приблизительно 0,75-1,25 нг/мл и, наиболее предпочтительно, приблизительно 1,0 нг/мл для контрольных образцов. Для образцов на ранней стадии рака, предпочтительные диапазоны составляют приблизительно 2,0-5,0 нг/мл, более предпочтительно, приблизительно 2,5-4,5 нг/мл, более предпочтительно, приблизительно 2,5-4,0 нг/мл, более предпочтительно, приблизительно 2,75-3,5 нг/мл, более предпочтительно, приблизительно 2,75-3,0 нг/мл, более предпочтительно, приблизительно 2,0-3,5 нг/мл, более предпочтительно, приблизительно 2,0-3,0 нг/мл и, наиболее предпочтительно, приблизительно 3,0 нг/мл.

Для образцов на поздней стадии рака предпочтительные диапазоны составляют приблизительно 6,0-20 нг/мл, более предпочтительно, приблизительно 8,0-15 нг/мл, более предпочтительно, приблизительно 8,5-13 нг/мл, более предпочтительно, приблизительно 9,0-12 нг/мл, более предпочтительно, приблизительно 9,5-11 нг/мл, более предпочтительно, приблизительно 7-13 нг/мл, более предпочтительно, приблизительно 8,5-16 нг/мл и, наиболее предпочтительно, приблизительно 10 нг/мл.

Термин «диагноз» относится к идентификации, подтверждению, и/или характеризации присутствия или отсутствия рака предстательной железы, вместе со стадией его развития, такой как ранняя стадия или поздняя стадия, или доброкачественной или метастазирующей опухоли предстательной железы.

Следует понимать, что характер состояний ракового заболевания «на ранней стадии» и «на поздней стадии» может определить врач. Предусматривают также, что они могут относиться к неметастазирующим и метастазирующим соответственно.

Изобретение относится также к способу мониторинга эффективности лечения рака предстательной железы, включающему детекцию и/или количественное определение по меньшей мере одного пептида HOX, пептида EN-2 или их фрагмента, присутствующих в биологическом образце от субъекта. Как указано выше, может являться предпочтительным получение двух образцов, разделенных по времени, например парой месяцев, чтобы определить, присутствует ли какой-либо прогресс в лечении, иными словами, увеличились или уменьшились ли уровни по меньшей мере одного пептида HOX, пептида EN-2 или их фрагмента. Уменьшение уровней указанных по меньшей мере одного пептида HOX или пептида EN-2 показывает, что заболевание регрессирует и, таким образом, режим лечения является успешным. Такой мониторинг заболевания будет быстро показывать, отвечает ли пациент на лечение или является устойчивым к лечению. В последнем случае можно обеспечить альтернативное лечение. Таким образом, такой способ обеспечивает быстрые показатели того, является ли режим лечения эффективным, и позволяет врачу изменять такой режим, если эффекта для пациента не наблюдают.

В способе по настоящему изобретению является предпочтительным, чтобы количество пептида или его фрагмента в тестируемом образце сравнивали с количеством, присутствующим в одном или нескольких контролях(контроле) и/или в одном или нескольких предыдущих тестируемых образцах(образце), взятых в более раннее время от указанного одного и того же тестируемого субъекта. Промежуток времени между более ранними и более поздними образцами может составлять только несколько суток, однако может составлять вплоть до нескольких месяцев или даже нескольких лет, и его может определить врач на основании прогрессирования заболевания и истории болезни пациента. Альтернативно, контроль может представлять собой тестируемый образец от не имеющего заболевания пациента.

Пептид или его фрагмент детектируют посредством подтверждения присутствия указанного биомаркера. Количественное определение количества биомаркера, присутствующего в образце, предпочтительно, включает определение концентрации пептидного биомаркера в образце. Стадии детекции и/или количественного определения можно проводить непосредственно в образце или опосредованно в экстракте из него или в его разведении.

Настоящее изобретение относится к биомаркерам, и следует понимать, что необходимо, чтобы они поддавались детекции в жидкости организма. Некоторые члены семейства HOX могут не поддаваться детекции в жидкости организма и, таким образом, не являются биомаркерами в соответствии с настоящим изобретением.

Поддающиеся детекции уровни по меньшей мере одного пептида HOX, пептида EN-2 или их фрагментов обсуждают в других местах, однако следует понимать, что может существовать ряд причин, почему пептид HOX, пептид EN-2 или их фрагменты не поддаются детекции. Без связи с теорией, одной причиной может являться то, что пептид деградирует в жидкости организма, т.е. не является «стабильным».

Таким образом, является предпочтительным, чтобы по меньшей мере один пептид HOX, пептид EN-2 или их фрагменты по существу не деградировали и/или еще поддавались детекции (т.е. присутствовали в поддающихся детекции концентрациях) на периферии организма, т.е. в вене близко к поверхности кожи, предпочтительно, на руке, откуда можно более легко получить их образец.

Пептид может высвобождаться в жидкость организма, либо посредством разрушения клеток или вытекания из них, либо посредством секреции.

Детекцию и/или количественное определение по меньшей мере одного пептида HOX, или пептида EN-2, или их фрагментов можно осуществлять любым способом, подходящим для детекции присутствия и/или количества специфического белка или пептида в биологическом образце. Это можно осуществлять прямой детекцией биомаркера, например, посредством MALDI-TOF или SELDI.

Однако является также предпочтительным, чтобы по меньшей мере один пептид HOX, или пептид EN-2, или их фрагмент детектировали напрямую или опосредованно через взаимодействие с лигандом или лигандами. Такие лиганды могут включать антитело против HOX или против EN-2 или его связывающий фрагмент, аптамер или олигонуклеотид. Следует понимать, что эти лиганды должны является способными специфически связывать пептид HOX, или пептид EN-2, или их фрагмент. Они могут являться подходящим образом мечеными и содержать аффинную метку. Подходящие метки могут являться флуоресцентными, радиоактивными или люминесцентными. Метки можно присоединять к антителу напрямую или через линкер.

Например, детекцию и/или количественное определение можно осуществлять одним или несколькими способами, выбранными из группы, состоящей из: MALDI-TOF, SELDI, систем анализа на основе 1-D или 2-D гелей, жидкостной хроматографии, способов объединенной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии. Последние могут включать, предпочтительно, ICAT®, или iTRAQ® (оба доступны из Applied Biosystems, USA).

Способы жидкостной хроматографии могут включать HPLC (жидкостную хроматографию высокого давления) или даже жидкостную хроматографию низкого давления (LPLC). Более того, предпочтительными являются также такие способы, как тонкослойная хроматография, ЯМР-спектроскопия и любой другой способ, описанный здесь.

Пептид или его фрагмент можно детектировать и/или оценивать количественно с использованием иммунологических способов, таких как сэндвич-иммуноанализы, например твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунные анализы (RAI), иммуноферментные анализы (EIA), Вестерн-блоттинг, иммунопреципитация. Предпочтительными являются также иммуноанализы на основе частиц, которые могут включать, например, использование частиц золота, серебра или латекса, магнитных частиц или Q-dot. Такие способы можно осуществлять, например, в формате планшета для микротитрования или полосы или на «чипе».

Особенно предпочтительными являются ELISA, включающие антитела, специфичные по меньшей мере для одного пептида HOX или EN-2. Антитело или антитела против HOX или против EN-2 предпочтительно являются связанными, либо непосредственно, либо через линкер, с репортерной молекулой, такой как радиоактивный изотоп, флуоресцентная молекула, люминесцентная молекула или фермент. Одним примером предпочтительного фермента является щелочная фосфатаза, доступная из Invitrogen, UK, хотя в данной области известны другие репортеры.

Пример антитела против HOXC4 человека доступен из Abeam, UK, каталожный no. ab24338. Это антитело кролика против HOXC4 человека, и, таким образом, может являться предпочтительным использовать вторичное антитело против IgG кролика, связанное с репортером, таким как щелочная фосфатаза, для детекции комплекса HOXC4-антитело. Примером антитела против HOXB6 является антитело из Abeam, каталожный no. ab26077. Примером антитела против HOXB5 является антитело из Abeam, каталожный no. ab26079. Примером антитела против HOXA3 является антитело из Abeam, каталожный no. ab28771. Примером антитела против HOXD9 является антитело из Abeam, каталожный no. ab60708. Известны примеры других антител против HOX. Примером антитела против EN-2 является антитело из Abeam, каталожный no. ab45867.

Способы Вестерн-блоттинга также являются предпочтительными, в частности, из-за того, что они могут предоставлять данные денситометрии.

Подходящие сравнительные уровни присутствия по меньшей мере одного пептида HOX или EN-2, достаточные для различения между контролем, раком на ранней стадии и на поздней стадии или их сочетаниями обсуждают выше.

Когда используют антитела, они могут представлять собой поликлональные, моноклональные, биспецифические, гуманизированные или химерные антитела. Антитела могут состоять из одной цепи, однако будут предпочтительно состоять из по меньшей мере легкой цепи или тяжелой цепи, однако следует понимать, что по меньшей мере одна определяющая комплементарность область (CDR) является необходимой, чтобы связывать эпитоп HOX или эпитоп EN-2.

Конечно, следует также понимать, что эпитоп или эпитопы должны являться доступными для связывания или узнавания лигандом, таким как антитело. Антитела против HOX и против EN-2 уже известны, однако, если потребуются другие антитела или связывающие лиганды с различными специфичностями, их можно получить. Способы получения антител известны в данной области. Например, если поликлональные антитела являются желательными, тогда выбранного млекопитающего, такого как мышь, кролик, коза или лошадь, можно иммунизировать выбранным антигеном, таким как HOX или EN-2 человека. Затем сыворотку от иммунизированного животного собирают и обрабатывают для получения антитела, например, посредством иммуноаффинной хроматографии. HOX или EN-2 человека можно, например, инъецировать кроликам, запуская иммунный ответ кролика, вызывающий образование антител против HOX или против EN-2, которые таким образом можно выделить с использованием общепринятых способов.

Конечно, моноклональные антитела можно получить способами, известными в данной области, и они, как правило, являются предпочтительными. Хорошо известен общий способ получения моноклональных антител с использованием способа гибридомы (смотри, например, Kohler, G. and Milstein, C, Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al, Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al, 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985).

Таким образом, антитело, как обозначают здесь, должно состоять из связывающей эпитоп области, такой как CDR. Как используют в настоящем описании, термин «антитело» относится к интактным молекулам, так же как к их фрагментам, таким как Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv, которые являются способными связывать эпитоп. Предпочтительно, антитело содержит также эффекторную часть, такую как область Fc.

Антитело может принадлежать к любому подходящему классу, включая IgE, IgM, IgD, IgA и, в частности, IgG. Предусматривают также различные подклассы этих антител.

Таким образом, является также предпочтительным использовать биосенсор для детекции по меньшей мере одного пептидного биомаркера или его фрагмента. Биосенсор может включать иммунологический способ, как описано выше, например, для детекции биомаркера, или электрические, термические, магнитные, оптические, например голограмму, или акустические средства или способы. Предусматривают, что с использованием таких биосенсоров биомаркер детектируют и/или определяют количественно. Таким образом, в следующем аспекте, настоящее изобретение относится к использованию биосенсора для детекции и/или количественного определения пептида или его фрагмента.

Предпочтительно, по меньшей мере один биомаркер HOX или EN-2 можно детектировать с использованием биосенсора на основе «умных» голограмм или высокочастотных акустических систем, в частности, поскольку такие системы пригодны для конфигураций массива. Например, с помощью сенсоров с умными голограммами, доступными из Smart Holograms Limited, Cambridge UK, голографическое изображение сохраняют на тонкой полимерной пленке, которую сенсибилизируют для специфической реакции с биомаркером. При экспонировании биомаркер реагирует с полимером, приводя к изменению изображения, отображаемого на голограмме. На выводе данных теста можно видеть изменение видимой яркости, изображения, цвета и/или положения изображения. Это можно считывать даже визуально.

Следует понимать, что является предпочтительным, чтобы биосенсоры, способные детектировать и/или количественно определять по меньшей мере один биомаркер HOX или EN-2, сочетали биомолекулярное узнавание с подходящими средствами для перевода детекции присутствия или количественного определения указанного биомаркера в образце в поддающийся детекции сигнал. Например, печатные узнающие элементы, тонкопленочные транзисторные технологии, магнитоакустические резонаторные устройства и другие новые акустико-электрические системы можно предпочтительно использовать в существующем биосенсоре для детекции и/или количественного определения по меньшей мере одного биомаркера HOX или EN-2. Предпочтительно, биосенсор по изобретению будет детектировать один или несколько из предпочтительно, двух, трех, четырех, пяти или всех шести из HOXC4, HOXB5, HOXB6, HOXA3, HOXD9 и EN-2. Дополнительные предпочтительные биосенсоры могут также дополнительно детектировать другие биомаркеры HOX, как указано выше.

Предпочтительно, биосенсор включает лиганд и/или антитело, как обсуждают выше. Биосенсор можно предоставлять на подходящем массиве или «чипе», так что биосенсор является способным специфически связывать по меньшей мере один пептид HOX, или пептид EN-2, или их фрагмент и предоставлены средства для детекции. Подходящие средства для детекции обсуждают выше, однако они могут включать репортерные системы, такие как щелочная фосфатаза, или умные голограммы, способные предоставлять пользователю поддающийся детекции сигнал, чтобы показать, что достигнуто специфическое связывание по меньшей мере одного пептида HOX, или EN-2, или его фрагмента и, предпочтительно, показатель концентрации HOX или EN-2 или число событий специфического связывания, которое произошло на указанном массиве или чипе.

Кроме того, настоящее изобретение относится к наборам для указанной детекции и/или количественного определения. Такие наборы являются применимыми для диагностики и/или мониторинга рака предстательной железы. Таким образом, такие наборы будут предпочтительно содержать биосенсор, такой как лиганд, предпочтительно, антитело, способный специфически связывать по меньшей мере один пептид или его фрагмент, и средства, чтобы показывать указанное специфическое связывание пользователю, например, с использованием репортерной системы, как описано в настоящем описании. В частности, указанные наборы включают массив или чип.

В дополнительном аспекте изобретение относится к использованию биосенсора, предпочтительно, лиганда и, наиболее предпочтительно, антитела, способного к специфическому связыванию и узнаванию по меньшей мере одного пептида HOX, или EN-2, или их фрагмента для идентификации вещества, способного супрессировать образование по меньшей мере одного пептида HOX, или EN-2, или его фрагмента. Предпочтительно, это вещество способно супрессировать продукцию биомаркера при раке предстательной железы. Иными словами, лиганд можно использовать для определения, по эффективности или иным образом, предполагаемого или разработанного лечения против рака предстательной железы.

Таким образом, способ детекции эффективности предполагаемого лечения против рака может включать стадии:

(a) инкубации целой клетки, экспрессирующей пептид HOX или пептид EN-2, и детекции количества высвободившегося пептида HOX или пептида EN-2,

(b) обработки клетки с помощью предполагаемого лечения против рака,

(c) детекции количества пептида HOX или пептида EN-2, высвободившегося после обработки, и

(d) сравнения количества пептида HOX или пептида EN-2, высвободившегося как до, так и после обработки, чтобы увидеть, оказало ли предполагаемое лечение против рака эффект на количество высвободившегося пептида.

Альтернативно, способ может включать стадии:

(a) инкубации меченого лиганда с целой клеткой, экспрессирующей пептид HOX или пептид EN-2 на поверхности клетки, или с мембраной клетки, содержащей пептид HOX или пептид EN-2,

(b) измерения количества меченого лиганда, связанного с целой клеткой или с мембраной клетки;

(c) добавления предполагаемого противоракового средства к смеси меченого лиганда и целой клетки или мембраны клетки со стадии (a) и позволения смеси достигнуть равновесия;

(d) измерения количества меченого лиганда, связанного с целой клеткой или с мембраной клетки после стадии (c); и

(e) сравнения разницы в количестве меченого лиганда, связавшегося на стадии (b) и (d), так что соединение, которое вызывает уменьшение связывания на стадии (d), считают ингибитором экспрессии HOX или EN-2 и, таким образом, противораковым средством.

Например, в таком анализе можно использовать линию клеток, такую как линия клеток карциномы предстательной железы LNCaP. Клетки LNCaP можно выращивать в присутствии или в отсутствие предполагаемого или разработанного противоракового средства и сравнивать относительную экспрессию EN-2. Более низкий уровень экспрессии EN-2 будет указывать на лучшую противораковую активность. Уровни экспрессии можно детектировать посредством детекции продуцированного белка (т.е. конечного продукта) или посредством детекции продуцированной РНК (т.е. промежуточного продукта). Способы детекции белкового продукта обсуждают выше. РНК можно детектировать с использованием, например, количественной ПЦР или массива олигонуклеотидов.

Вышеуказанное также относится к способам и наборам по настоящему изобретению.

Другие способы или наборы для использования в соответствии с настоящим изобретением будут очевидны специалисту в данной области. Они могут включать, например, системы детекции биомаркеров, описанные в US-2006-014301, US-2004-063216, WO 01/92879 и WO 02/054936.

Таким образом, настоящее изобретение можно использовать для идентификации новых способов лечения против рака предстательной железы, где уровни по меньшей мере одного пептида HOX, или EN-2, или их фрагмента детектируют и/или определяют количественно в присутствии или в отсутствие предположительного противоракового средства, чтобы определить его эффективность. Настоящее изобретение можно использовать также в способе технологий высокопроизводительного скрининга, например, в формате конфигурированного массива, такого как чип или многолуночный массив.

Поскольку рак предстательной железы представляет собой связанное с мужским полом заболевание, следует понимать, что субъект или пациент является мужчиной.

Описание фигур

Фигура 1: Пример Вестерн-блоттинга для поиска белка HOXC4 в сыворотке. Результаты проанализированы также денситометрией и представлены как среднее для всех шести образцов из каждой группы. Планки погрешностей представляют стандартную ошибку среднего. Эти данные показывают, что HOXC4 потенциально является специфическим и точным диагностическим маркером рака предстательной железы как на ранних, так и на поздних стадиях заболевания.

Фигура 2: Детекция HOXB6 у шести пациентов на ранней стадии рака предстательной железы, опухоли которых являются небольшими и ограниченными предстательной железой, и у шести совпадающих по возрасту контролей.

Фигура 3: (a) Анализ RT-QPCR экспрессии EN-2 в LNCaP и первичных клетках опухоли (уровень транскрипта как процент от β-актина). (b,c) Пункционный биоптат аденокарциномы предстательной железы, окрашенный антителом против En2. Положительное по En2 окрашивание (коричневое) присутствует в цитоплазме опухолевых клеток, с наиболее сильным окрашиванием на границе просвета (1). Видны положительные по En2 пузырьки, присоединенные к границе просвета (2) или свободные внутри просвета (3). Ядра окрашены голубым. Увеличение: (a) x100, (b) x60.

Фигура 4: Срезы через пункционные биоптаты TMA (a) нормальной ткани предстательной железы, (b) доброкачественной гипертрофии предстательной железы, и (c и d) злокачественной опухоли предстательной железы. Окрашивание EN-2 (коричневое) присутствует в стромальных клетках (закрашенные белым стрелки) и в железах, где наиболее сильное окрашивание наблюдается на границе просвета (закрашенное острие стрелки). Ядра окрашены голубым. Увеличение: (a-c) x60, (d) x100.

Фигура 5: Детекция белка EN-2 в культуральной среде Вестерн-блоттингом.

Фигура 6: Белок EN-2 в моче. Мочу собирали от индивидуумов, обследуемых по симптомам, соответствующим раку предстательной железы, и подвергаемых скринингу по присутствию белка EN-2. Присутствие или отсутствие рака тестировали биопсией. Предсказанная MW EN-2 составляет 30 кДа, однако вторую полосу 33 кДа также детектировали в положительном контроле (экстракт мозжечка мыши). Полоса 30 кДа присутствует исключительно в моче 50% пациентов с наличием клеток рака предстательной железы в их биоптатах (C Pa), она не присутствует у пациентов с отрицательными биоптатами или с доброкачественной гипертрофией предстательной железы (BHP) или с интраэпителиальной неоплазией высокой степени злокачественности (HGPIN).

Фигура 7: Детекция HOXB5 у трех пациентов с раком предстательной железы на ранней стадии, где опухоли являются небольшими и ограниченными предстательной железой, у трех пациентов с раком предстательной железы на поздней стадии и у трех совпадающих по возрасту контролей.

Фигура 8: Уровни экспрессии различных генов HOXA и HOXD в опухолевой ткани по сравнению с нормальной прилегающей тканью. DU145 и PC3 представляют собой линии клеток, происходящих из опухолей предстательной железы.

Пример 1

HOXC4

Сыворотку получали от шести пациентов с прогрессирующим, устойчивым к гормонам раком предстательной железы, шести пациентов с раком предстательной железы на ранней стадии, опухоли которых являются небольшими и ограничены предстательной железой, и от шести совпадающих по возрасту контролей. Ее обессоливали и фракционировали с использованием 12,5% геля PAGE/SDS. Белок HOXC4 человека (UniProtKB/Swiss-Prot, входной номер P09017) детектировали с использованием вестерн-блоттинга с антителом кролика против HOXC4 человека (Abeam, UK, каталожный номер ab24338), вместе с вторичным антителом против IgG кролика, связанным с щелочной фосфатазой (Invitrogen, UK). С использованием этого способа авторы настоящего изобретения детектировали высокие уровни белка HOXC4 в сыворотке всех пациентов с раком предстательной железы, но только очень низкие уровни в сыворотке совпадающих по возрасту контролей (Фиг. 1).

Результаты показаны ниже в таблице 1.

HOXC4 можно использовать как основу диагностического и/или прогностического теста для рака предстательной железы с использованием стандартного способа анализа, такого как ELISA. Тест будет включать использование антитела против HOXC4, связанного с репортером, таким как щелочная фосфатаза, для количественного определения количества белка HOXC4 в образцах сыворотки пациентов. Можно использовать также другие способы, включая Вестерн-блоттинг. Количество белка HOXC4 будет предоставлять показатель как для того, присутствует ли заболевание, так и для стадии, какой оно достигло.

Таблица 1 Наименование геля: HoxC4 blot 131006 (Raw 1-D Изображение) Индекс Наименование Пациент Диагноз Объем Прилегающий объем % прилегающего объема         OD*мм² OD*мм ²     1 U1 HR29 Рак 6,844796 0,272431 24,320686 2 U2 HR28 Рак 6,460027 0,092836 8,2877258 3 U3 HR27 Рак 9,731784 0,393355 35,115964 4 U4 SR5 Рак на ранней стадии 6,108735 0,086538 7,7255409 5 U5 SR2 Рак на ранней стадии 6,26387 0,01121 1,0007083 6 U6 SRI Рак на ранней стадии 8,427193 0,15222 13,589161 7 U7 VR30 Здоровый 6,459172 0,045458 4,0581642 8 U8 VR23 Здоровый 9,760506 0,062926 5,6175665 9 U9 VR21 Здоровый 6,740683 0,003187 0,2844833 Мембраны инкубировали с первичным антителом в течение только 1 часа Средние значения         % увеличения       sd sem     Контроль 0,037190112 0,030716 0,0177548 0 Рак на ранней стадии 0,08332277 0,07056 0,0407864 124,0455 Рак на поздней стадии 0,252873795 0,151211 0,0874053 579,949

Пример 2

HOXB6

Детекцию HOXB6 в этих образцах осуществляли точно так же, как для HOXC4, за исключением того, что первичное антитело представляло собой антитело кролика против HOXB6 человека (от Abeam, каталожный no. ab26077). Относительные значения для белка HOXB6 оценивали денситометрией рентгеновской пленки (с использованием полос, локализованных с предсказанной для них молекулярной массой). Эти значения представляют собой оптическую плотность полосы относительно оптической плотности локального фона. Таким образом, следует понимать, что возможно отрицательное значение сравнительной денситометрии, как показано для совпадающих по возрасту контролей (AMC), хотя следует понимать, что это нельзя переносить на отрицательное количество белка HOXB6.

Эти данные показаны графически на фигуре 2.

Таблица 2 HOXB6 в сыворотке Значения представляют собой относительную оптическую плотность полос       Среднее sd sem AMC1 -0,02671 AMC -0,09016 0,064043 0,036977 AMC2 -0,08899 Рак на ранней стадии 0,261033 0,076253 0,044026 AMC3 -0,15478         Ранний1 0,182775         Ранний2 0,33511         Ранний3 0,265214        

Пример 3

EN-2

С использованием количественной ПЦР (QPCR) тестировали уровни экспрессии EN-2 в линии клеток карциномы предстательной железы человека LNCaP (Horoszewicz et al., 1983). Это линия клеток, полученная из очага метастазирования аденокарциномы предстательной железы человека, и ее широко используют в качестве модели этого рака in vitro. Более того, экспрессию EN-2 тестировали в ткани, полученной из биоптатов опухолей предстательной железы. Оба образца экспрессировали EN-2. Первичные клетки опухоли экспрессировали также EN-2 в виде белка. Это можно детектировать на срезах аденокарцином предстательной железы (фиг. 3a). Окрашивание по EN-2 в этих срезах присутствует как в цитоплазматических, так и в ядерных компартментах, однако оно является наиболее интенсивным на границах просвета и в секреторных пузырьках, входящих в просвет (Фиг. 3b,c).

Для дополнительной проверки степени, в которой EN-2 присутствует в ткани из нормальной предстательной железы, доброкачественной гипертрофии и злокачественных опухолей, авторы настоящего изобретения окрашивали микромассив тканей (TMA), содержащий репрезентативные срезы из каждой, с помощью антител против EN-2. Это подтвердило, что EN-2 сильно экспрессируется в озлокачествленных железах, особенно на границах просвета (Фиг. 4), хотя присутствует некоторое окрашивание в железах с нормальной и гипертрофированной тканью. Для всех тканей показали также окрашивание по EN-2 в стромальных клетках (Фиг. 4). Для количественного окрашивания в железах каждую ткань оценивали в баллах от 0 до 3, где 0 представляет отсутствие окрашивания, а 3 - наиболее сильное окрашивание. На этом основании железы с нормальной тканью (Фиг. 4a) оценивали со средним значением 0,5 (n=10, sd=0,52), с доброкачественной гиперплазией (Фиг. 4b) 0,67 (n=6, sd=0,51) и со злокачественными опухолями (Фиг. 4c&d) 2,3 (n=6, sd=0,52).

Эти данные ясно показывают, что EN-2 является экспрессированным в этих клетках рака предстательной железы.

Пример 4

Исследовали среду, окружающую LNCaP и первичные клетки опухоли предстательной железы, для определения, может ли EN-2 секретироваться из этих клеток. Среду, использованную для культивирования обоих типов клеток в течение двух часов, обессоливали и концентрировали. Затем белки, содержащиеся в этом концентрате, разделяли в акриламидном геле. Вестерн-блоттинг выявил присутствие специфических для EN-2 полос в среде, окружающей оба типа клеток (Фиг. 5), и количественное определение с использованием стандартных количеств транскрибированного in vitro белка EN-2 показало, что количество EN-2 в среде, использованной для культивирования клеток LNCaP, составляло 3 нг/мл, в то время как первичные клетки опухоли продуцировали 1,75 нг/мл в течение 48 часов.

Пример 5

Образцы мочи получали от 17 индивидуумов, которых недавно подвергали биопсии и массажу предстательной железы. Обнаружили, что из этих индивидуумов 10 обладали раком по биопсии. Из других, двое обладали интраэпителиальной неоплазией высокой степени злокачественности (HGPIN), трое показали признаки доброкачественной гипертрофии, и двое не обладали злокачественными клетками в срезе биоптата. Пять из пациентов с диагнозом рак обладали большими количествами EN-2 в моче, в то время как ни один из образцов мочи индивидуумов без диагноза рак не содержал значительного количества белка EN-2 (Фиг. 6).

Пример 6

HOXB5

Детекцию HOXB5 в этих образцах осуществляли точно так же, как для HOXC4 и HOXB6, за исключением того, что первичное антитело представляло собой антитело кролика против HOXB5 человека (из Abeam, каталожный no. ab26079). Относительные количества для белка HOXB5 оценивали по денситометрии рентгеновской пленки (с использованием полос, локализованных с предсказанной для них молекулярной массой). Эти значения представляют собой оптическую плотность полосы относительно оптической плотности локального фона.

Таблица 3             % увеличения Средние значения                     sd sem     AMC 0,006597   0,005948 0,003438 0 Рак на ранней стадии 0,244012   0,055004 0,031794 3598,808 Рак на поздней стадии 0,471597   0,154221 0,089145 7048,621

Эти данные представлены графически на фигуре 7.

Пример 7

Образцы мочи получали от 17 индивидуумов, у которых подозревали наличие рака предстательной железы и которым впоследствии поставили диагноз заболевания. Уровни белка EN2 в образцах мочи оценивали, как описано выше. Для образцов мочи 8 (47%) из этих индивидуумов показали увеличенные уровни EN2. В отличие от этого, в образцах мочи, полученных от 15 пациентов, у которых подозревали наличие рака предстательной железы, но у которых рак впоследствии не подтвердили, ни один (0%) не обладал увеличенными уровнями EN2. Заслуживает внимания тот факт, что 3 из пациентов с диагнозом рак предстательной железы, которые показали увеличенные уровни EN2 в образцах мочи, не обладали увеличенными уровнями PSA. Это иллюстрирует, что способы по изобретению являются эффективными для детекции рака при неудаче общепринятых способов детекции.

Пример 8

Детекция экспрессии генов HOX в нормальной и опухолевой ткани.

Выделение РНК: РНК опухолевой и нормальной соседней ткани закупали из Ambion, USA. РНК из культур клеток выделяли с использованием мини-набора RNeasy (Qiagen, UK).

Синтез кДНК: Сначала РНК денатурировали нагреванием до 65°C в течение пяти минут. 1-5 мг РНК инкубировали в объеме 50 мл при 37°C в течение одного часа с конечными концентрациями 10 мМ DTT, 1 мМ смеси dNTP, так же как 100 мг/мл полиТ-праймеров, 200 единиц обратной транскриптазы (Invitrogen, USA) и 40 единиц RNASEout (Invitrogen, USA). Реакцию синтеза кДНК останавливали помещением пробирок на 65°C на пять минут.

ПЦР с детекцией в реальном времени: Полуколичественную RT-ПЦР осуществляли с использованием прибора для ПЦР с детекцией в реальном времени Stratagene MX4000. Stratagene MX4000 измеряет накопление продукта ПЦР во время экспоненциальной фазы реакции, до того как амплификация становится чувствительной к ограничению реагентов и изменчивости циклирования. Флуоресценция увеличивается в соответствии с увеличивающимися уровнями продукта ПЦР. Относительное количество каждого транскрипта определяли как соотношение с количеством транскрипта бета-актина в каждом образце.

Используемые праймеры перечислены в таблице 4 ниже.

Результаты показаны на фигуре 8. С использованием этого способа HOXA3 и HOXD9 идентифицировали как потенциальные биомаркеры рака предстательной железы, так как эти гены обладают явно повышенной экспрессией в образцах опухолевых тканей.

Ссылки

Chatelin, L., Volovitch, M., Joliot, A.H., Perez, F. and Prochiantz, A. (1996) Transcription factor hoxa-5 is taken up by cells in culture and conveyed to their nuclei. Mech. Dev. 55, 111-117.

Cosgaya, J.M., Aranda, A., Graces, J. and Martin-Bianco, E. (1998) Neuronal differentiation of PC 12 cells induced by engrailed homeodomain is DNA-binding specific and independent of MAP kinases. J. Cell Sci. 111 (Pt 16), 2377-2384.

Derossi, D., Calvet, S., Trembleau, A., Brunissen, A., Chassaing, G. and Prochiantz, A. (1996) Cell internalization of the third helix of the Antennapedia homeodomain is receptor-independent. J. Biol. Chem. 271, 18188-18193.

Garcia-Bellido, A. and Santamaria, P. (1972) Developmental analysis of the wing disc in the mutant Engrailed of Drosophila melanogaster. Genetics 72, 87-104.

Joliot, A., Maizel, A., Rosenberg, D., Trembleau, A., Dupas, S., Volovitch, M. and Prochiantz, A. (1998) Identification of a signal sequence necessary for the unconventional secretion of Engrailed homeoprotein. Curr. Biol. 8, 856-863.

Kuefer R, Hofer MD, Zorn CS, Engel O, Volkmer BG, Juarez-Brito MA, Eggel M, Gschwend JE, Rubin MA, Day ML. Assessment of a fragment of e-cadherin as a serum biomarker with predictive value for prostate cancer. Br J Cancer. 2005 Jun 6; 92(11): 2018-23.

Maizel, A., Bensaude, O., Prochiantz, A. and Joliot, A. (1999) A short region of its homeodomain is necessary for engrailed nuclear export and secretion. Development 126, 3183-3190.

Martin, N.L., Saba-El-Leil, M.K., Sadekova, S., Meloche, S. and Sauvageau, G. (2005) EN-2 is a candidate oncogene in human breast cancer. Oncogene 24, 6890-6901.

Miller GJ, Miller HL, van Bokhoven A, Lambert JR, Werahera PN, Schirripa O, Lucia MS, Nordeen SK. Aberrant HOXC expression accompanies the malignant phenotype in human prostate. Cancer Res. 2003 Sep 15; 63(18): 5879-88.

Morgan R. Hox genes: a continuation of embryonic patterning? Trends Genet. 2006 Feb; 22(2): 67-9.

Morgan R. Engrailed: complexity and economy of a multi-functional transcription factor. FEBS Lett. 2006 May 15; 580(11): 2531-3.

Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM, Mills GB, Simone C, Fishman DA, Kohn EC, Liotta LA. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet. 2002 Feb 16; 359(9306): 572-7.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ диагностики или мониторинга прогрессирования рака предстательной железы, включающий детекцию и/или количественное определение гомеодомен-содержащего фактора транскрипции EN-2 или его фрагмента в моче, и сравнение количества указанного гомеодомен-содержащего фактора транскрипции в тестируемом образце мочи с количеством, присутствующим в контрольном образце мочи от нормального, не страдающего раком субъекта, где увеличение уровня гомеодомен-содержащего фактора транскрипции или его фрагмента, обнаруживаемое в тестируемом образце, является показателем того, что заболевание либо прогрессирует, либо началось. Предложено применение in vitro указанного гомеодомен-содержащего фактора транскрипции или его фрагмента, поддающегося детекции в моче, в качестве биомаркера для рака предстательной железы. Предложенная группа изобретений обеспечивает высоко специфичный и чувствительный способ диагностики или мониторинга прогрессирования рака предстательной железы, в два раза превосходящий по эффективности стандартный тест на основе PSA. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 8 ил., 4 табл., 8 пр.

1. Способ диагностики или мониторинга прогрессирования рака предстательной железы, включающий детекцию и/или количественное определение гомеодомен-содержащего фактора транскрипции или его фрагмента, поддающегося детекции в моче, и сравнение количества указанного гомеодомен-содержащего фактора транскрипции в тестируемом образце мочи с количеством, присутствующим в нормальном контрольном образце мочи от нормального, не страдающего раком субъекта, где гомеодомен-содержащий фактор транскрипции представляет собой пептид EN-2, содержащий SEQ ID NO:4, и где фрагмент обладает по меньшей мере 80% гомологией последовательности с SEQ ID NO:4, более предпочтительно 85%, более предпочтительно 90%, более предпочтительно 95%, более предпочтительно 97%, более предпочтительно 99%, и наиболее предпочтительно 99,9% гомологией последовательности с указанной SEQ ID NO:4, где увеличение уровня гомеодомен-содержащего фактора транскрипции или его фрагмента, обнаруживаемое в тестируемом образце, является показателем того, что заболевание либо прогрессирует, либо началось.

2. Способ по п.1, где
(А) увеличение является статистически значимым, определенным с использованием «t-теста» при условии доверительных интервалов предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно по меньшей мере 99,5%, более предпочтительно по меньшей мере 99,95%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99,99%, и/или
(В) (i) увеличение между контролем и образцом, являющееся показателем ранней стадии рака предстательной железы, составляет приблизительно 110-200%, и наиболее предпочтительно приблизительно 125%, или
(ii) увеличение между контролем и образцом, являющееся показателем указанной поздней стадии рака предстательной железы, составляет приблизительно 550-620%, более предпочтительно приблизительно 560-600%, более предпочтительно приблизительно 570-590%, и наиболее предпочтительно приблизительно 580%, или
(iii) увеличение, по сравнению с образцом на ранней стадии или контролем, составляющее приблизительно между 100% и 300%, и предпочтительно приблизительно 200%, является показателем прогрессирования рака от ранней к поздней стадии заболевания.

3. Способ по п.1 или 2 для детекции появления, прогрессирования, стабилизации, улучшения и/или ремиссии рака предстательной железы или эффективности лечения рака предстательной железы, необязательно где представлены по меньшей мере две стадии детекции и/или количественного определения, разделенных по времени.

4. Способ по п.1 или 2, где детекцию и/или количественное определение гомеодомен-содержащего фактора транскрипции или его фрагмента, поддающегося детекции в моче, осуществляют посредством одного или нескольких из группы, состоящей из: MALDI-TOF, SELDI, через взаимодействие с лигандом или лигандами, посредством систем анализа на основе 1-D или 2-D гелей, жидкостной хроматографии, способов объединенной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии, включая ICAT^® или iTRAQ^®, тонкослойной хроматографии и ЯМР-спектроскопии.

5. Способ по п.1 или 2, где детекцию и/или количественное определение гомеодомен-содержащего фактора транскрипции или его фрагмента осуществляют посредством одного или нескольких из группы, состоящей из: сэндвич-иммуноанализов, твердофазных иммуноферментных анализов (ELISA), радиоиммунных анализов (RAI), иммуноферментных анализов (EIA), Вестерн-блоттинга, иммунопреципитации и иммуноанализов на основе частиц, включая использование частиц золота, серебра или латекса, магнитных частиц или Q-dot, необязательно где детекцию и/или количественное определение гомеодомен-содержащего фактора транскрипции или его фрагмента осуществляют в формате планшета для микротитрования, полосы, массива или на чипе, необязательно где детекцию и/или количественное определение гомеодомен-содержащего фактора транскрипции или его фрагмента осуществляют посредством ELISA, включающего антитела, специфические в отношении пептида EN-2 или его фрагмента, предпочтительно связанные с репортером.

6. Способ по п.1 или 2, где детекцию и/или количественное определение пептида EN-2 или его фрагмента осуществляют посредством биосенсора.

7. Применение in vitro гомеодомен-содержащего фактора транскрипции или его фрагмента, поддающегося детекции в моче, в качестве биомаркера для рака предстательной железы, где гомеодомен-содержащий фактор транскрипции представляет собой пептид EN-2, содержащий SEQ ID NO:4, и где фрагмент обладает по меньшей мере 80% гомологией последовательности с SEQ ID NO:4, более предпочтительно 85%, более предпочтительно 90%, более предпочтительно 95%, более предпочтительно 97%, более предпочтительно 99%, и наиболее предпочтительно 99,9% гомологией последовательности с указанной SEQ ID NO:4.

8. Применение по п.7, где указанное применение присутствует в способе, выбранном из группы, состоящей из: клинического скрининга, способов оценки прогноза, мониторинга результатов терапии, способа идентификации пациентов, которые наиболее вероятно будут отвечать на конкретное терапевтическое лечение, и скрининга и разработки лекарственных средств, необязательно где указанных пациентов ранее диагностировали как отрицательных по раку с использованием анализа, детектирующего PSA.