ШТАММ BIFIDOBACTERIUM LONGUM, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИФИДОСОДЕРЖАЩЕЙ ПРОДУКЦИИ Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 A23L1/30 A61P1/14 

В связи с неблагоприятными экологическими условиями, стрессами, длительной антибактериальной, лучевой и химиотерапией, дисбиозами, возникающими вследствие перенесенных заболеваний, увеличивается количество людей, страдающих нарушениями нормальной микрофлоры организма. Для лечения и профилактики этих нарушений все большее внимание уделяется как препаратам, обладающим пробиотическим действием, так и пищевым продуктам, содержащим бифидобактерии.

В кишечнике человека в основном встречаются 5 видов бифидобактерии - B. bifidum, B. longum, B. adolescentis, B. breve и B. infantis. Из них с наибольшей частотой в биоценозе обнаруживаются виды B. bifidum и B. longum. Вид B. adolescentis чаще встречается у взрослых людей, а виды B. breve и B. infantis - преимущественно у детей грудного возраста.

Известны зарубежные моно- и комплексные препараты-эубиотики и кисломолочные продукты, включающие в свой состав бифидобактерии видов B.bifidum, B.lonqum, B.adolescentis, B.breve (патент №2336886, патент №2411008, Франция; патент №637297, Швейцария; патент №2134179, патент №2421066, ФРГ; патент №05227946, патент №0430642, Япония; патент №4645667, США, патент №6063935, Япония, патент №5922375, США, патент №5902743, США, патент №6746672, США, патент №6548057, США). У нас в стране для приготовления бактерийных препаратов, биологически активных добавок, продуктов лечебно-диетического питания применяют отечественные штаммы бифидобактерий видов B.bifidum 1,791,792; B.lonqum В379М, Я-2, Я-4; B. adolescentis МС - 42, Г 7513; В.breve 79-119; B.infantis 79-43 (авторское свидетельство №343588, патент РФ №1347221, патент РФ №849779, патент РФ №2108383, патент РФ №2152993, патент РФ №863639, патент РФ №2120991, патент РФ №2078814, патент РФ №2111248).

Качество лечебных продуктов и препаратов во многом обусловлено свойствами штамма-продуцента - его специфической активностью и технологичностью. Большой ассортимент биологически активных и технологичных штаммов бифидобактерий делает возможной разработку новых моно- и комплексных продуктов лечебного питания и бакпрепаратов, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность кишечника человека, восстановить его нормальную микрофлору и снизить заболеваемость различными кишечными инфекциями.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма микроорганизмов вида Bifidobacterium longum B-NH с высокой биологической активностью, устойчивостью к условиям внешней среды, обладающего стабилизирующим кислотообразованием во всем температурном диапазоне развития клеток, хорошо сквашивающего молоко и быстро размножающегося на искусственных питательных средах.

Штамм Bifidobacterium longum B-NH выделен от здорового ребенка грудного возраста, депонирован в ВКПМ, ФГУП ГосНИИгенетика, коллекционный номер Ас-1876.

Заявляемый штамм может быть использован при производстве кисломолочной продукции, ферментированных пищевых продуктов, например квас, пиво и т.п., неферментированных пищевых продуктов, например соки, напитки и т.п., заквасок для приготовления кисломолочной продукции и биологически активных добавок к пище. Также штамм Bifidobacterium longum B-NH может широко использоваться для производства гигиенических и косметических средств, например кремов, лосьонов, салфеток, мыла, присыпок, тампонов, питательных масок, гелей, женских прокладок, косметического молочка, различных пудр и т.д. Кроме того, штамм Bifidobacterium longum B-NH может быть использован при производстве бактериальных препаратов в виде свечей, пероральных и других средств.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение штамма Bifidobacterium longum B-NH, который может быть использован в качестве биологически активного компонента в составе различных пробиотических средств коррекции микробиоценозов организма человека, обладающего биологически и технологически значимыми свойствами, такими как высокая кислотообразующая активность, способность наращивать микробную биомассу в искусственных питательных средах за короткие сроки культивирования, сквашивать молоко, антагонистически активного по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.

Культурально-морфологические свойства штамма.

Клетки представляют собой гр+полиморфные палочки с утолщением на 1-2-х концах, встречаются с бифуркацией, в жидких питательных средах растут по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза. Отдельно выросшие колонии на Бифидум-среде имеют шарообразную форму колоний. Логарифмическая фаза роста заканчивается к 12-18 ч культивирования.

Физико-биохимические свойства штамма.

Бесспоровый, неподвижный анаэроб. Оптимальная температура выращивания 38±1°C. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L+молочной кислот, без образования газа, закисляя среду выращивания до рН 4,3-3,8. Ферментирует лактозу, мелецитозу, раффинозу, галактозу, арабинозу, ксилозу, целлобиозу, галактозу, не ферментирует маннит, сорбит, инозит. Штамм сквашивает молоко к 12-16 ч культивирования.

Штамм Bifidobacterium longum B-NH обладает антагонистической активностью по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре (табл.1).

Таблица 1 Антагонистическая активность штамма B.longum B-NH Штамм Зона задержки роста тест-культур мм/M±m Sh. sonnci Sh. flexneri Е. coli S. aureus Pr. vulgaris В. longum B-NH 28±1,6 22±1,4 20±2,2 16±1,8 26±1,2

Штамм активно наращивает микробную массу при росте на гидролизатно-молочной среде (ГМ), Бифидум-среде (БФ), молоке (М), продуцируя кислоты (табл.2).

Таблица 2 Накопление микробной массы (КОЕ/мл lg 10) и активность кислотообразования (в градусах Тернера) штамма В. longum B-NH в динамике развития   ВРЕМЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА 12 ч 24 ч 48 ч КОЕ °T КОЕ °T КОЕ °T ГМ 8,2 98 9,2 132 7,4 172 БФ 8,6 92 8,6 116 7,0 142 М 8,0 86 9,0 108 7,6 132

Штамм максимально накапливает микробную массу к 12-18 ч, достигая в 1 мл lg 8-9 микробных клеток, активно продуцирует кислоты.

Таким образом, предлагаемый штамм Bifidobacterium longum B-NH технологичен, поскольку размножается в различных питательных средах с накоплением производственной биомассы с высокой концентрацией бифидобактерий; обладает кислотообразующей активностью, а также антагонистической активностью в отношении к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.

Кисломолочные, ферментированные, неферментированные пищевые продукты, гигиенические, косметические средства, биологически активные добавки и бактерийные препараты, содержащие штамм Bifidobacterium longum B-NH, могут найти широкое применение в пищевой, медицинской, биотехнологической и косметической отраслях промышленности. Способность штамма Bifidobacterium longum B-NH наращивать биомассу в питательной среде в короткие сроки культивирования, кислотообразующая, антагонистическая активность по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре, а также другие полезные для организма человека свойства, характерные для вида Bifidobacterium longum, делают возможным использование штамма в составе различных корригирующих средств лечебно-профилактического назначения.

Пример 1. Использование штамма Bifidobacterium longum B-NH в составе биологически активных добавок.

1 пассаж: лиофилизированный штамм Bifidobacterium longum B-NH в количестве 0,1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной средой и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при температуре 38±1°C до образования видимого роста в последних разведениях.

2 пассаж: выросшую культуру из 10^-7-9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную среду и культивируют при температуре 38±1°C в течение 12-18 ч до образования густого роста с видимой зоной аэробиоза.

3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-18 ч при 38±1°C до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10⁸/мл.

В результате получают биологически активную добавку, которая представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 10⁸/мл, содержанием бифидобактерий.

Пример 2. Использование штамма Bifidobacterium longum B-NH для приготовления ферментированных и неферментированных пищевых продуктов.

1 пассаж: лиофилизированный штамм Bifidobacterium longum B-NH в количестве 0,1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной средой и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при 38±1°C до образования видимого роста в последних разведениях.

2 пассаж: выросшую культуру из 10^-7-9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную среду и культивируют при температуре 38±1°C в течение 12-18 ч до образования густого роста с хорошо видимой зоной аэробиоза.

3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-18 ч при 38±1°С до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10⁸/мл.

Получение ферментированного или неферментированного пищевого продукта: выросшую биомассу вносят в пищевое сырье (молоко, соки, пиво, квас и пр.) в количестве до 10% от объема, перемешивают и разливают в емкости. В результате получают продукт с концентрацией живых бифидобактерий не менее 10⁶/мл.

Пример 3. Использование штамма Bifidobacterium longum B-NH для приготовления кисломолочного продукта.

1 пассаж: лиофилизированный штамм вносят в среду культивирования и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при 38±1°C до образования видимого роста в последних разведениях. Или сухую лиофилизированную биомассу бифидобактерий вносят в количестве 1-2 дозы в пробирку с 30 мл питательной среды. Культивируют при температуре 38±1°C до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10⁷/мл.

2 пассаж: выросшую культуру штамма Bifidobacterium longum B-NH из последних разведений или из пробирки с выросшей биомассой вносят в среду накопления объемом до 10% и культивируют при температуре 38±1°C до получения биомассы с содержанием бифидобактерии не менее 10⁸/мл.

3 пассаж: полученную биомассу штамма Bifidobacterium longum B-NH в объеме до 10% вносят в стерильное молоко, культивируют до образования сгустка (кисломолочный продукт). Количество пассажей №2 может быть увеличено в зависимости от объема производства.

Пример 4. Использование штамма Bifidobacterium longum B-NH для получения бактерийных препаратов.

Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду, культивируют при температуре 38±1°C до получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 10⁸ в 1 мл. К полученной биомассе добавляют защитные среды высушивания (сахарозо-желатиновая среда, обезжиренное молоко). Полученную суспензию разливают в ампулы, флаконы и другие емкости, замораживают при температуре минус 35-45°C и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат содержит не менее 10⁷ живых клеток бифидобактерий. Данное содержание бифидобактерий согласуется с научно-технической документацией на аналогичный бифидосодержащий препарат "Бифидумбактерин сухой" и является достаточным для использования полученного средства в качестве препарата - эубиотика.

Пример 5. Использование штамма Bifidobacterium longum B-NH для получения гигиенических и косметических средств.

Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду, культивируют при температуре 38±1°C до получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 10⁸ в 1 мл. Полученную биомассу бифидобактерий штамма Bifidobacterium longum B-NH вводят в количестве не более 1% в состав мыла или крема.

Клиническая эффективность Bifidobacterium longum изучалась на базе Московской медицинской академии имени И.М.Сеченова в составе жидкой биологически активной добавки (БАД) - «Нормофлорин». Под наблюдением находились 20 взрослых человек с воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК) - язвенный колит, болезнь Крона, хронический колит.

Больные, наряду с базисной терапией, получали «Нормофлорин» по 1 столовой ложке перед едой в течение 30 дней. В результате у больных отмечено снижение отрицательных проявлений диспепсического синдрома (тошнота, отрыжка, снижение аппетита), абдоминального синдрома (вздутие живота, метеоризм, частота и характер стула). Нежелательные явления не наблюдались.

Изобретение относится к биохимии. Штамм Bifidobacterium longum B-NH выделен от здорового ребенка грудного возраста, активно размножается в питательной среде с накоплением производственной биомассы в короткие, 12-18 ч, сроки культивирования с высокой концентрацией бифидобактерий, способен сквашивать молоко. Штамм Bifidobacterium longum B-NH обладает кислотообразующей активностью, антагонистической активностью в отношении к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Это позволяет использовать штамм Bifidobacterium longum B-NH в составе бифидосодержащей продукции - бактерийных препаратах, биологически активных добавках к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктах, гигиенических и косметических средствах, обеспечивающих нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и урогенитального трактов, кожных и слизистых покровов, и расширяет арсенал средств коррекции микрофлоры человеческого организма. Штамм Bifidobacterium longum B-NH депонирован в ВКПМ под номером ВКПМ Ас-1876. Изобретение позволяет повысить активность бифидосодержащей продукции. 2 табл., 5 пр.

Штамм Bifidobacterium longum, ВКПМ Ac-1876, используемый для получения бифидосодержащей продукции.