ШТАММ БАКТЕРИЙ Bifidobacterium longum 58B ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК, РЕГУЛИРУЮЩИХ МИКРОФЛОРУ КИШЕЧНИКА У ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 A23C9/12 A61K35/74 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к педиатрической практике, в частности может быть использовано при изготовлении биологически активных добавок, а также бактерийных препаратов для нормализации микрофлоры при нарушениях микробиоценоза кишечника у детей раннего возраста.

В настоящее время для коррекции дисбиотических изменений желудочно-кишечного тракта применяют биопрепараты, состоящие из лиофилизированных штаммов бактерий - представителей нормальной микрофлоры (Ефимов Б.А., Коршунов В.М., Кафарская Л.И., Тарабрина Н.П., Гладько И.А. Диагностика, профилактика и лечение дисбактериозов кишечника. Методические рекомендации. М. МЗ РФ, 1991. -С.9) Это "Бифидумбактерин" и "Лактобактерин" (Гончарова Г.И., Дьякова Е. И., Семенова Л.П. и др. Новый отечественный препарат "Сухой бифидумбактерин" и его эффективность при кишечных заболеваниях детей и взрослых. // Всероссийский съезд эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов: Тезисы докладов. - Казань, 1972. - С. 37-38.; Тарасова Н.Б., Соколова К.Я. Новый препарат лактобактерин для профилактики и лечения дисбактериозов кишечника. // Всесоюзный съезд эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов, 11-й: Тезисы докладов. - Тбилиси, 1970. - 40 с.).

Однако эти препараты разработаны на основе штаммов, выделенных от взрослых людей, и поэтому недостаточно эффективны для регуляции микрофлоры у детей. Каких-либо препаратов, состоящих из комплекса штаммов, характерных для детей раннего возраста, в Российской Федерации в настоящее время не существует.

Целью изобретения является получение штамма бифидобактерий, обладающего высокой кислотообразующей активностью, для использования в производстве биологически активных добавок, эффективных для профилактики и коррекции дисбиотических нарушений микрофлоры кишечника у детей раннего возраста.

Эта цель достигнута тем, что из кишечника клинически здорового ребенка первого года жизни был выделен штамм Bifidobacterium longum 58В, принадлежащий к виду, характерному для детей данной возрастной группы, обладающий значительной кислотообразующей функцией, хорошей антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам и естественной устойчивостью к ряду антибиотиков.

Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов "ГосНИИГенетика" и характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические свойства. При культивировании в жидкой селективной среде Блаурокка в анаэробных условиях образует рыхлый осадок и равномерное помутнение через 24 часа. При культивировании в столбике 0,75% агара Блаурокка образует колонии в виде гречишных зерен или дисков размером до 0,5-1 мм в диаметре в течение 2 суток. На плотной среде Блаурокка образует колонии S-типа, круглые, с ровными краями, гомогенные, непрозрачные, пигмента не образуют, профиль колоний выпуклый, без блеска, легко снимаются петлей с поверхности плотной питательной среды.

В мазках клетки расположены в форме "китайских иероглифов", имеют вид прямых или разветвленных палочек с У-образными раздвоениями на одном или обоих концах, иногда образуют утолщения на концах. Неподвижны, в мазке располагаются беспорядочно. Окрашиваются грамположительно, иногда внутри клеток выявляется зернистость. Спор не образуют.

Физиологические свойства. Облигатный анаэроб, растет в высоком столбике агара в пробирке, в пробирках с жидкой средой и на чашках Петри с плотной средой в анаэробных условиях. При культивировании в жидкой среде в анаэробных условиях через 18-20 часов после посева в 1 мл среды вырастает 1,0•10⁸-5,0•10⁸ живых микробных клеток. Оптимум роста при температуре 37,5^o.

Биохимические признаки. Синтезирует фермент фруктозо-6-фосфатфосфокеталазу. Каталазы не образует. Сбраживает арабинозу, фруктозу, галактозу, глюкозу, лактозу, рибозу, раффинозу, сахарозу, мелибиозу. Не сбраживает целлобиозу, мелезитозу, манному, ксилолу, мальтозу, трегалозу, сорбитол, магнитол, инулин, салицин. Желатин не разжижает. Индол не продуцирует, не восстанавливает нитраты.

Кислотообразование при выращивании в среде Блаурокка 170,9^o (по Тернеру).

Чувствительность к антибиотикам представлена в таблице 1.

Антагонистическая активность по отношению к условно-патогенным микроорганизмам представлена в таблице 2.

Лабораторная проверка показала непатогенность штамма Bifidobacterium longum 58B для экспериментальных животных (мышей), а также для людей (в опытах на добровольцах).

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Изучение кислотообразующей активности штамма Bifidobacterium longum 58B.

Активность кислотообразования определяли нитрометрическим методом. С этой целью по 1 мл 1-миллиардной взвеси суточной культуры бифидобактерий вносили в пробирки с 9 мл среды Бактофок и культивировали при 37,5^oС в анаэробных условиях. Через 6-12-24-36-48-60-72 часа от начала культивирования вынимали по две пробирки, из которых отбирали по 5 мл культуральной жидкости и титровали ее 0,1 н. раствором щелочи. Количество щелочи, пошедшей на титрование, соответствует количеству образуемой 0,1 н. кислоты в 5 мл культуральной жидкости. Окончательный результат выражали в градусах Тернера: Т^o= А•К•20, где А - количество 0,1 н. щелочи, пошедшее на титрование 5 мл исследуемой жидкости, К - поправка к титру, определяемая при титровании 0,1 н. раствора щелочи 0,1 н. янтарной кислотой, Т^o - величина, выражающая количество 0,1 н. щелочи, пошедшей на титрование 100 мл исследуемого образца.

В результате проведенных исследований установлено (таблица 3), что уже спустя 12 часов от начала культивирования рН начинала изменяться в кислую сторону, и к 24 часам происходило значительное закисление культуральной жидкости (кислотность составила 129,9^o Т). В последующие часы наблюдалось более медленное нарастание до максимума к 48 часам (кислотность составила 170,9^o Т).

Штамм бифидобактерий Bifidobacterium longum 58B обладает высокой кислотообразующей активностью.

Пример 2. Изучение непатогенности, апирогенности и антагонистической активности штамма Bifidobacterium longum 58B в кишечнике добровольцев.

Штамм Bifidobacterium longum 58B получал доброволец 22 лет в течение 10 дней в дозе 1,0•10⁹ клеток в сутки. Производили оценку общего состояния, температуры утром и вечером в течении всего периода приема суспензии микроорганизмов. Кроме того, провели бактериологическое исследование содержимого толстой кишки перед началом и на второй день после окончания приема взвеси бифидобактерий.

Другой доброволец 27 лет для контроля получал препарат "Бифидумбактерин". У него также было проведено бактериологическое исследование микрофлоры толстой кишки перед началом и на вторые сутки после окончания приема препарата.

В течение всего периода наблюдений штамм Bifidobacterium longum 58B не вызывал никаких побочных действий, жалоб обследуемый не предъявлял, температура тела оставалась нормальной, сон и аппетит не нарушались, диспепсических расстройств не было.

Анализ данных бактериологического исследования выявил позитивные сдвиги в количественном составе микроорганизмов, присутствующих в кишечнике добровольца. Отмечалось повышение уровня бифидобактерий с 9,0•10⁸ колониеобразующих единиц на грамм кишечного содержимого (КОЕ/г) до 8,5•10⁹ КОЕ/г, а также снижение уровня энтерококков с 2,5•10⁸ КОЕ/г до <10⁴ КОЕ/г, стафилококков с 1,0•10⁴ до 2,4•10³ КОЕ/г, дрожжеподобных грибов рода Candida с 1,0•10⁴ до <10² КОЕ/г.

У добровольца, принимавшего препарат "Бифидумбактерин", отмечалось повышение уровня бифидобактерий с 7,7•10⁹ КОЕ/г до 1,1•10¹⁰ КОЕ/г. Но при этом уровень условно-патогенных микроорганизмов существенно не менялся.

Штамм Bifidobacterium longum 58B является непатогенным и апирогенным для человека и обладает антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам не только in vitro, но и in vivo.

Пример 3. Изучение влияния штамма Bifidobacterium longum 58B на микрофлору кишечника ребенка.

Штамм Bifidobacterium longum 58B получал ребенок 3 лет в течение 10 дней в дозе 1,0•10⁹ клеток в сутки. Проводили бактериологическое исследование содержимого толстой кишки перед началом и на второй день после окончания приема взвеси лактобактерий.

Другой ребенок для контроля получал препарат "Бифидумбактерин". У него также было проведено бактериологическое исследование микрофлоры толстой кишки перед началом и на вторые сутки после окончания приема препарата.

Анализ данных бактериологического исследования выявил позитивные сдвиги в количественном составе микроорганизмов, присутствующих в кишечнике ребенка, принимавшего штамм Bifidobacterium longum 58B. Отмечалось повышение уровня бифидобактерий с 3,2•10⁸ колониеобразующих единиц на грамм исследуемого материала (КОЕ/г) до 6,4•10⁹ КОЕ/г и лактобактерий с 1,0•10⁷ до 1,2•10⁸ КОЕ/г.

У добровольца, принимавшего препарат "Бифидумбактерин", отмечалось повышение уровня бифидобактерий с 2,6•10⁹ КОЕ/г до 1,1•10¹⁰ КОЕ/г. При этом уровень лактобактерий существенно не менялся.

Несмотря на кажущуюся простоту, восстановление микрофлоры кишечника у детей раннего возраста представляет собой сложную микробиологическую и педиатрическую проблему. Выделение из кишечника клинически здорового ребенка первого года жизни перспективного для производства штамма бифидобактерий, наиболее характерного в отличие от уже известных штаммов для микрофлоры кишечника детей данной возрастной группы, и изучение его свойств является плодом длительной исследовательской работы. В результате этого впервые получен штамм Bifidobacterium longum 58B, обладающий значительной кислотообразующей функцией, высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам и устойчивостью к ряду антибиотиков. Штамм проверен на непатогенность и апирогенность для животных и человека.

Все эти свойства дают возможность использовать штамм Bifidobacterium longum 58B в качестве биологически активных добавок для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта у детей раннего возраста.

Штамм Bifidobacterium longum 58B полностью готов к использованию.

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской микробиологии и может быть использовано для применения в качестве биологически активных добавок для коррекции нарушений микробиоценоза желудочно-кишечного тракта у детей. Штамм Bifidobacterium longum 58В выделен из кишечника здорового ребенка первого года жизни, является хорошим кислотообразователем, способен активно ингибировать условно-патогенные микроорганизмы, обладает естественной устойчивостью к ряду антибиотиков. Штамм непатогенен и апирогенен для людей и животных. Штамм депонирован в коллекции ВКПМ под номером Ас-1635, свойства штамма позволяют использовать его в педиатрической практике, и в виде биологически активных добавок он обеспечивает эффективную профилактику и коррекцию дисбиотических нарушений микрофлоры кишечника у детей раннего возраста. 3 табл.

Штамм бактерий Bifidobacterium longum 58В, ВКПМ Ас-1635 для приготовления биологически активных добавок, регулирующих микрофлору кишечника у детей раннего возраста.