СПОСОБ ИММУНОТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2012 года по МПК G09B23/28 A61K35/16 A61P35/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальным исследованиям в онкологии, и может быть использовано при исследовании роли сывороточных факторов в обеспечении контроля опухолевого роста.

Разработка и использование препаратов антител для иммунотерапии опухолевых заболеваний является одним из развивающихся в настоящее время направлений онкологии иммунологии. Несмотря на наличие в клинической практике ряда противоопухолевых препаратов моноклональных антител (мабтера, герцептин), возможности обычных сывороток не исчерпаны, особенно неприменительно к достижению непосредственного противоопухолевого эффекта, а в регуляторном плане.

Известно, что на основе донорских пуловых сывороток разработан препарат IVIG, обладающий свойством препятствовать активизации метастатических клеток (см. А.Г.Исрафилов, М.М.Алсынбаев, Т.Б.Кудашева, В.П.Трофимов. «Вестник инфектологии и паразитологии», 2006 г., стр.1-12). Известно, что введение модифицированных аутологичных веществ, прежде всего белков, в организм опухоносителя может вызывать стимуляцию неспецифического (врожденного) и специфического (адаптивного) ответа его иммунной системы (см. С.В.Баракин. «Аутогемохимиотерапия при опухолевых заболеваниях». 2008 г., стр.5-10). Однако в этом обзоре основное внимание уделено применению аутологичной крови, а не плазмы и сыворотки.

Сыворотка и плазма крови онкологических больных может существенно и разнонаправлено влиять на функциональную активность иммунокомпетентных клеток: естественных киллеров и макрофагов, играющих большую роль в противоопухолевой защите.

Известен «Способ использования аутологичной крови и плазмы онкологических больных при проведении химиотерапии» (см. Автореф. докт. дисс. Л.Ю.Владимировой «О возможности использования аутоплазмохимиотерапии в лекарственной терапии больных раком молочной железы», 2006, г.Ростов н/Дону), выбранный нами в качестве прототипа. В работе описана аутоплазмохимиотерапия (АПХТ), способствующая повышению эффекта химиопрепаратов и снижению токсических реакций у больных раком молочной железы, и показано связывание цитостатиков альбумином плазмы, являющимся основным транспортным белком. Однако в работе не изучалось влияние аутологичной плазмы, не связанной с химиопрепаратами, на опухолевый рост. Тем не менее ее введение может играть определенную самостоятельную роль в противоопухолевой защите за счет антител и других содержащихся в ней факторов.

Исследование влияния введения плазмы опухоленосителей на опухолевый рост может уточнить механизм действия АПХТ и послужить для дальнейшего развития этого метода лечения злокачественных опухолей.

Целью изобретения является индукция торможения или регрессии перевивной опухоли при введении животным аутологичных и аллогенных сывороток.

Поставленная цель достигается тем, что белым беспородным крысам массой 150-200 г перевивают под кожу спины опухоль С-45, через 7-10 дней животным начинают введение сывороток; крысам-опухоносителям С-45 внутримышечно вводят сыворотки в возрастающих дозах: в 1-й день по 0,1 мл, во 2-й день - по 0,2 мл, в 3-й и 4-й дни - по 0,5 мл; 1-я группа крыс получает введение аутологичной сыворотки, 2-я - аллогенной сыворотки от крысы-опухоленосителя, 3-я - аллогенной сыворотки от интактной крысы, 4-я - аллогенной сыворотки от интактной крысы, прогретой при 56°С в течение 30 минут, 5-я - аллогенной сыворотки от интактной крысы после пятикратного замораживания и оттаивания, 6-я группа - контрольная получает введение физиологического раствора; по окончании введения сывороток в течение 2-х месяцев оценивают динамику роста опухолей и устанавливают, что курсовое введение сывороток вызывает полную или частичную регрессию опухоли.

Изобретение «Способ иммунотерапии опухолей в эксперименте» является новым, так как оно неизвестно из уровня медицины при исследовании роли сывороточных факторов в обеспечении контроля опухолевого роста.

Новизна изобретения заключается в исследовании роли сывороточных факторов в обеспечении контроля опухолевого роста. Повышение эффективности лечения аутогемо- и аутоплазмохимиотерапии онкологических заболеваний связано не только с химиопрепаратом, как действующим началом, но и с модификацией сывороточных белков при инкубации с ними. В известной работе (прототипе) показано связывание цитостатиков альбумином, являющимся основным транспортным белком. Однако в работе не изучалось влияние аутологичной сыворотки, не связанной с химиопрепаратами, на опухолевый рост.Тем не менее, ее введение может играть определенную самостоятельную роль в противоопухолевой защите за счет антител и других содержащихся в ней факторов.

Исследование влияния введения сыворотки опухоленосителям на опухолевый рост уточняет механизмы действия АПХТ и служит для дальнейшего развития этого способа лечения злокачественных опухолей. В связи с этим изучение роли сывороточных факторов в обеспечении контроля опухолевого роста является важным для научных и практических разработок в области аутогемо- и аутоплазмохимиотерапии опухолевых заболеваний.

Изобретение является промышленно применимым, так как может быть использовано в медицине, при экспериментальных исследованиях в онкологии, научно-исследовательских онкологических институтах и других медицинских учреждениях здравоохранения.

Пример конкретного выполнения «Способа иммунотерапии опухолевых заболеваний в эксперименте»

Материалы и методы

Опыты были поставлены на 33 белых беспородных крысах массой 150-200 г, которым под кожу спины перевивали опухоль С45. Через 7-10 дней животным начинали введение сывороток. Схема эксперимента представлена в табл.1.

Таблица 1 Схема эксперимента по оценке влияния введения сывороток на опухолевый рост Группы крыс Сыворотки n Сроки введения, объем сывороток 1-й день 2-й день 3-й день 4-й день 1 Аутологичная 5 По 0,1 мл в/м По 0,2 мл в/м По 0,5 мл в/м По 0,5 мл в/м 2 Аллогенная от опухоленосителя 5 3 Аллогенная от интактной крысы 5 4 Аллогенная от интактной крысы, 56°С, 30 мин* 5 5 Аллогенная от интактной крысы, 5-кратно размороженная* 5 6 Физраствор (контроль) 8 * Прогревание сыворотки при указанной температуре приводит к денатурации термолабильных белков, а пятикратное размораживание - к разрушению иммуноглобулинов.

По окончании введения сывороток в течение 2-х месяцев еженедельно измеряли объем опухоли; проводили оценку динамики по критериям полной и частичной регрессии, торможения и прогрессирования С45. Кроме того, определяли продолжительность жизни животных исследуемых групп. Статистическую обработку проводили с вычислением t-критерия Стьюдента и по Уилкоксону.

Результаты представлены в табл.2-4.

Таблице 2 Динамика изменения объема С45 у животных исследуемых групп Группы животных Объем опухоли (см³) До воздействий Через 1 мес Через 2 мес 1 0,42±0,16 0,26±0,17*↓ 0,0974±0,088*↓**↓ 2 1,32±0,2 0,52±0,2**↓ - 3 1,31±0,14 0,44±0,16**↓ - 4 0,68±0,17 3,2±1,2**↑ 10,4±4,62**↑ 5 0,69±0,13 2,52±0,83**↑ 13,5±4,6*↑**↑ 6 0,59±0,15 1,09±0,3↑ 3,19±1,1**↑ * Статистически достоверные отличия от 6-й (контрольной) группы (t >2 или критерий Уилкоксона); ** - статистически достоверные отличия первоначального объема; ↑ - увеличение объема С45; ↓ - снижение объема С45.

Как видно из данных, представленных в табл.2, у крыс контрольной группы отмечено постепенное увеличение объема опухоли. У животных 1-й, 2-й и 3-й групп, получавших введение термически необработанных сывороток, напротив, наблюдалось его уменьшение. В 1-й группе оно становилось статистически достоверным через 2 мес, а во 2-й и 3-й группах - через 1 месяц; при этом через 2 мес наблюдения во 2-й и 3-й группах у 3 животных из 5 произошла полная регрессия, из-за чего подсчитать средние объемы опухоли не представляется возможным. Обращает на себя внимание выраженный рост С45 у крыс 4-й и 5-й групп, получавших сыворотку интактного животного, предварительно прогретую при 56°С или пятикратно размороженную. У крыс описываемых групп объем опухолей при измерении их через 2 мес в 2-3 раза превышал показатели контрольных животных; различия статистически значимы для 5-й группы.

Как следует из данных, представленных в табл.3, через 1 мес после воздействий у животных, получавших физраствор, наблюдалось прогрессирование С45 в 6 случаях из 8, у одной крысы отмечено торможение и у одной - частичная регрессия опухоли. Введение аутосыворотки привело к развитию частичной регрессии у 3 животных из 5, у одного наблюдалось торможение, у одного - прогрессирование С45. После введения сыворотки опухоленосителя у всех 5 животных развилась частичная регрессия, а при введении сыворотки интактной крысы - у 1 полная, а у 4 - частичная регрессия опухоли. Этот эффект отменялся при применении той же сыворотки (от интактной крысы) как после прогревания, так и после пятикратного размораживания: прогрессирование отмечалось у 4 и 5 животных из 5 соответственно (табл.3).

Таблица 3 Количество животных с регрессией, торможением и прогрессированием С45 через 1 и 2 мес после введения сывороток Группы животных Время наблюдения 1 мес 2 мес ПР ЧР Торм. Прогр. ПР ЧР Торм. Прогр. 1 0/5 3/5 1/5 1/5 3/5 1/5 1/5 0/5 2 0/5 5/5 0/5 0/5 3/5 1/5 0/5 1/5 3 1/5 4/5 0/5 0/5 3/5 1/5 0/5 1/5 4 0/5 1/5 0/5 4/5 0/5 1/5 0/5 4/5 5 0/5 0/5 0/5 5/5 0/5 0/5 0/5 5/5 6 0/8 1/8 1/8 6/8 1/8 2/8 0/8 5/8 Примечание. Числитель - количество животных с полной регрессией (ПР), частичной регрессией (ЧР), торможением и прогрессированием; знаменатель - общее количество животных в группе.

Подобные различия обнаружены и через 2 месяца после перевивки опухоли (табл.3). Хорошо известно и неоднократно наблюдалось, что С45 в некоторых случаях способна спонтанно регрессировать, и, по-видимому, регрессию у трех животных из 8 (у 1 - полная и у 2 - частичная) в группе, получавшей физраствор, можно отнести к таким случаям. При этом у 5 крыс из контрольной группы наблюдалось прогрессирование опухоли, тогда как у животных, получавших введение аутологичной сыворотки, оно не отмечалось ни в одном случае. После введения аллогенных сывороток, несмотря на достижение регрессии у всех животных через 1 мес, у некоторых из них через 2 мес снова обнаруживался рост, вследствие чего отмечено по 1 случаю позднего прогрессирования у крыс 2-й и 3-й групп (табл.3). Тем не менее, у животных этих групп введение сывороток приводило к полной регрессии в 3 случаях и частичной в 1 случае из 5. Прогревание и особенно пятикратное размораживание сыворотки нивелировало ее противоопухолевое действие.

В табл.4 представлены данные, характеризующие количество выживших животных в исследуемых группах и продолжительность их жизни.

Таблица 4 Количество выживших крыс-опухоленосителей с С45 и продолжительность их жизни после введения сывороток Группы животных Время наблюдения (мес) Продолжительность жизни (нед) 1 1,5 2 2,5 3 3,5 1 5/5 5/5 4/5 3/5 3/5 3/5 11,2±2,64 2 5/5 5/5 5/5 5/5 4/5 4/5 13,4±1,32* ** 3 5/5 4/5 3/5 3/5 3/5 3/5 9,8±2,64 4 5/5 4/5 2/5 1/5 1/5 1/5 5,2±1,98 5 5/5 5/5 3/5 1/5 1/5 0/5 5,6±1,54 6 8/8 7/8 6/8 6/8 1/8 1/8 8,125±1,72 * Статистически достоверные отличия от 6-й (контрольной) группы (t >2); ** - статистически достоверные отличия от показателей животных 4-й и 5-й групп; числитель - количество живых животных; знаменатель - общее количество животных в группе.

Приведенные в табл.4 результаты свидетельствуют о том, что гибель животных-опухоленосителей начинается через 1,5 мес после окончания воздействий, а через 3,5 мес из животных контрольной группы в живых осталась только 1 крыса, у которой развилась спонтанная регрессия С45. Аналогичные данные отмечены в группах животных, получавших прогретую сыворотку, а введение пятикратно размороженной сыворотки вызывает гибель всех крыс в течение 3,5 мес. Введение аутологичной сыворотки и нативной сыворотки интактной крысы способствует выживанию 3-х крыс из 5 через 3,5 мес после перевивки. Максимальная выживаемость (4 крысы из 5 через 3,5 мес) была отмечена у животных, которым вводили сыворотку опухоленосителя, а их продолжительность жизни была статистически достоверно выше, чем у контрольных крыс, а также у получавших прогретую и пятикратно размороженную сыворотку (табл.4). У животных остальных групп продолжительность жизни не имела статистически достоверных различий, хотя тенденция к увеличению этого показателя наблюдалась в группах, получавших аутологичную сыворотку и нативную сыворотку интактной крысы.

Технико-экономическая эффективность «Способа иммунотерапии опухолей» заключается в том, что курсовое введение сывороток животным с перевивной опухолью С-45 способно вызвать полную или частичную регрессию опухоли, увеличение количества выживших крыс в группе и продолжительности жизни животных. Действие аутологичной и аллогенной сыворотки, а также взятой от опухоленосителей и от интактной крысы является однонаправленным, хотя и имеет некоторые различия. Однако эффект сыворотки интактной крысы полностью снимается и даже меняется на противоположный после ее прогревания или пятикратного размораживания, что свидетельствует о том, что противоопухолевое действие оказывают именно нативные белки, причем не только антительной, но и неиммуноглобулиновой природы.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальным исследованиям в онкологии, и может быть использовано при исследовании роли сывороточных факторов в обеспечении контроля опухолевого роста. Способ иммунотерапии опухолей заключается в том, что белым беспородным крысам массой 150-200 г перевивают под кожу спины опухоль С-45. Через 7-10 дней животным внутримышечно вводят аутологичную сыворотку крови, или аллогенную сыворотку от интактных животных, или сыворотку опухоленосителей. Введение сыворотки осуществляют в возрастающих дозах: в 1-й день - 0,1 мл, во 2-й день - 0,2 мл, в 3-й и 4-й дни - 0,5 мл. Способ обеспечивает эффективную индукцию торможения или регрессии перевивной опухоли за счет нативных белков сыворотки, вводимой в разработанных дозах и режиме введения. 4 табл.

Способ иммунотерапии опухолей в эксперименте, отличающийся тем, что белым беспородным крысам массой 150-200 г перевивают под кожу спины опухоль С-45, через 7-10 дней животным внутримышечно вводят аутологичную сыворотку крови, или аллогенную сыворотку от интактных животных, или сыворотку опухоленосителей и введение осуществляют в возрастающих дозах: в 1-й день 0,1 мл, во 2-й день - 0,2 мл, в 3-й и 4-й дни - 0,5 мл.