РАДИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ МЕЛАНОМЫ И ЕЕ МЕТАСТАЗОВ Российский патент 2012 года по МПК A61K51/08 

Описание патента на изобретение RU2465011C1

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается создания радиофармацевтических препаратов (РФП) на основе пептидных аналогов нейрорегуляторных пептидов, меченных радиоизотопами, с целью диагностики и терапии раковых опухолей.

В последние годы наиболее перспективными для диагностики и терапии опухолей считаются РФП на основе таргетных селективных пептидов, имеющих высокое сродство к гиперэкспрессированным рецепторам опухолевых клеток. Применение таких РФП позволяет осуществлять раннее выявление первичных очагов и метастазов опухолей и начинать эффективную терапию, в том числе радиоизотопами, что существенно повышает выживаемость онкологических больных [Jean Claude Reubi; Helmut R.Macke; and Eric P.Krenning. Candidates for Peptide Receptor Radiotherapy Today and in the Future. J Nucl Med 2005; 46: 67-75].

Меланома является одной из самых злокачественных опухолей, занимает 6 место по частоте встречаемости, отличается быстрым метастазированием, резистентностью к химиотерапии и высокой смертностью. Поэтому ранняя диагностика метастазов меланомы и срочное начало лечения являются необходимыми для достижения положительных результатов терапии.

Вырабатываемый в организме альфа-меланоцит стимулирующий гормон (αМСГ) представляет собой тридекапептид, высокоаффинный к меланокортиновым рецепторам, в частности к меланокортиновому рецептору 1 типа (MC1R), который гиперэкспрессируют клетки меланомы животных и человека. Однако αМСГ нестабилен и быстро разрушается в тканях организма. Поэтому для создания РФП, высокоаффинных и длительно связывающихся с MC1R, были синтезированы различные стабильные, устойчивые к распаду в организме пептидные аналоги αМСГ, в том числе сложные циклические соединения [Quinn Т, Zhang X, Miao Y. Targeted melanoma imaging and therapy with radiolabeled alpha-melanocyte stimulating hormone peptide analogues. G Ital Dermatol Venereol. 2010 Apr; 145(2): 245-58].

Однако в последние годы было показано, что РФП для диагностики меланомы на основе линейных пептидных аналогов αМСГ, меченных радиоизотопом через хелатирующую группу, ковалентно связанную с ε-аминогруппой концевого лизина, обладают улучшенными фармакокинетическими свойствами и качеством визуализации при диагностике, за счет увеличения специфического связывания меченого соединения клетками опухоли и уменьшения уровня неспецифического связывания выводимых из организма меченых соединений в почках и печени [Sylvie Froidevaux; Martine Calame-Christe; Heidi Tanner; Alex N.Eberle. Melanoma Targeting with DOTA-α-Melanocyte-Stimulating Hormone Analogs: Structural Parameters Affecting Tumor Uptake and Kidney Uptake. J Nucl Med. 2005, Vol.46, No.5].

Кроме того, были получены новые данные, показывающие, что уменьшение длины пептидного аналога αМСГ в составе РФП увеличивает уровень и длительность накопления меченого соединения в клетках опухоли [Haixun Guo, Jianquan Yang, Fabio Gallazzi, Yubin Miao. Reduction of the Ring Size of Radiolabeled Lactam Bridge-Cyclized a-MSH Peptide, Resulting in Enhanced Melanoma Uptake. J Nucl Med. 2010; 51: 418-426].

Важным является существенно меньшая стоимость коротких линейных пептидов и технологичность их синтеза, по сравнению со сложными многозвенными циклическими соединениями.

В настоящее время радиоизотоп технеция (99mTc), получаемый непосредственно в клиниках из генератора 99Мо/99mTc, является наиболее приемлемым по цене и идеальным по физико-химическим характеристикам для создания РФП с целью проведения СПЕКТ диагностики с использованием доступных γ-камер в медицинской практике.

Однако разработанные линейные пептидные аналоги αМСГ, меченные 99mTc, крайне ограничены. Известен линейный пептид (NDP-MSH), меченный 99mTc через пептидную хелатирующую группу:

99mTc-Cys-Gly-Cys-Gly-NDP-MSH

Его недостатками являются: большая длина основного пептида (последовательность из 13 аминокислот) и то, что пептидная хелатирующая группа (Cys-Gly-Cys-Gly) соединена с N-концевой частью основного пептида. Поэтому в экспериментальных исследованиях не были получены удовлетворительная фармакокинетика и достаточное накопление соединения в опухоли [Chen J, Cheng Z, Hoffman TJ, Jurisson SS, Quinn TP. Melanoma-targeting properties of (99m)technetium-labeled cyclic alpha-melanocyte-stimulating hormone peptide analogues. Cancer Res. 2000 Oct 15; 60(20): 5649-58].

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является радиофармацевтический препарат для диагностики меланомы и ее метастазов, содержащий линейный октапептид (последовательность из восьми аминокислот), меченый 99mTc через хелатирующую карбонильную группу (pz), ковалентно связанную с ε-аминогруппой С-концевого лизина:

Недостатком РФП на основе I является повышенная гидрофобность, вносимая карбонильной составляющей, что существенно ухудшило его связывание с клетками меланомы и фармакокинетические свойства [Raposinho PD, Correia JD, Alves S, Botelho MF, Santos AC, Santos I. A (99m)Tc(CO)(3)-labeled pyrazolyl-alpha-melanocyte-stimulating hormone analog conjugate for melanoma targeting. Nucl Med Biol. 2008 Jan; 35(1): 91-9].

Задачей настоящего изобретения является получение нового РФП для диагностики меланомы и ее метастазов с улучшенными радиофармацевтическими свойствами на основе линейного аналога αМСГ, меченного 99mTc, позволяющего достигнуть высокого уровня накопления и длительности удержания меченого препарата клетками и тем самым улучшить качество визуализации меланомы при диагностике.

Поставленная задача достигается использованием линейного пептида - аналога альфа-меланоцит - стимулирующего гормона:

содержащего гидрофильную пептидную хелатирующую группу для мечения радионуклидом, с целью получения радиофармацевтического препарата общей формулы:

где X - хелатирующая группа в виде Gly-Cys-Gly-Cys-Н.

Содинение III отличается от прототипа тем, что входящий в него основной пептид II имеет меньшую длину (последовательность из 7 аминокислот), а также тем, что с ε-аминогруппой С-концевого лизина ковалентно связана гидрофильная пептидная хелатирующая группа (Gly-Cys-Gly-Cys-H).

Представленное в изобретении соединение III может быть также использовано в качестве таргетной пептидной составляющей для терапевтического РФП в случае его комплекса с β-излучающим радионуклидом, например, с 188Re, характеризующимся близкими к 99mTc физико-химическими характеристиками.

Примеры, иллюстрирующие предлагаемые изобретения

Список использованных сокращений:

АсОН - уксусная кислота

Asp - аспарагиновая кислота

Arg - аргинин

Cys - цистеин

Gly - глицин

His - гистидин

Nle - норлейцин

Lys - лизин

Ser - серин

Тгр - триптофан

Phe - фенилаланин

But - трет-бутил

Bz - бензоил

DCC - N,N'-дициклогексилкарбодиимид

DMF - диметилформамид

DIPEA - диизопропилэтиламин

EDT - этандитиол

НОВТ - 1-гидроксибензотриазол

HONB - ONp - n-нитрофениловый эфир

ONSu - N-гидроксисукцинимидный эфир

TFA - трифторуксусная кислота

TFMSA - трифторметансульфокислота

Z - бензилоксикарбонил

ВОР - гексафторфосфат-бензотриазол-1-ил-окси-трис-(диметиламино)фосфоний.

ONB-N-гидрокси-3-норборнен-2,3-дикарбоксиимидный эфир

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

Синтез пептидных продуктов проводился методами классической пептидной химии в жидкой фазе [Synthetic Peptides. A User's Guide. Second Edition / Ed. G.A.Grant. Oxford Univ. Press. Oxford, N.Y.: 2002].

Пример 1. Синтез целевого линейного пептида:

Схема синтеза целевого линейного пептида приведена на рис.1.

Синтез целевого линейного пептида изложен ниже в соответствии со схемами, представленными на рис.1 и 2

Z-Nle-Asp(OBu)-His-OH

К 8.5 г (0.055 моль) гистидина добавляли 27.5 мл Тритона В, упаривали, к остатку добавляли раствор 21.02 г (0.050 моль) Z-Asp-ONSu в 100 мл DMF. Реакционную смесь выдерживали 12 ч при 20°С, упаривали, к остатку добавляли 150 мл этилацетата, промывали 5% АсОН (2×50 мл) и водой до нейтральной реакции, упаривали. Остаток растворяли в 200 мл этанола, гидрировали над 5% Pd/C до исчезновения исходного Z-Asp-His-OH (контроль методом ТСХ в системе А). Катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали досуха. Полученное масло растворяли в 22.5 мл Тритона В, упаривали, к остатку добавляли раствор 16.3 г (0.045 моль) Z-Nle-ONSu в 100 мл DMF. Реакционную смесь перемешивали 12 ч при 20°С, упаривали, к остатку добавляли 150 мл этилацетата, промывали 5% АсОН (2×50 мл) и водой до нейтральной реакции, упаривали. Кристаллизовали из диэтилового эфира, отфильтровывали, сушили на воздухе. Выход 21.5 г (67%) в расчете на Z-Asp-ONSu. Rf 0.745 (Б).

Ac-Nle-Asp(OBu)-His-OH

К 21.5 г (0.037 моль) соединения (1) добавляли 37 мл 1N NaOH, растворяли в 150.0 мл этанола, гидрировали над 5% Pd/C до исчезновения исходного (1). Катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали досуха. Остаток растворяли в 150 мл DMF, добавляли 7.2 г (0.040 моль) AcONp. Реакционную смесь перемешивали 12 ч при 20°С, упаривали, к остатку добавляли 150 мл этилацетата, промывали 5% АсОН (2×50 мл) и водой до нейтральной реакции, упаривали. Кристаллизовали из диэтилового эфира, отфильтровывали, сушили на воздухе. Выход 12.69 г (79%). Rf 0.68 (В).

Z-dPhe-Arg-OH

Растворяли 29.4 г (0.070 моль) Z-dPhe-ONp в 200 мл DMF, добавляли 13.4 г (0.077 моль) аргинина. Реакционную смесь перемешивали 12 ч при 20°С, упаривали. К остатку добавили 100 мл этилацетата, выпавший осадок отфильтровывали, промывали на фильтре этилацетатом и диэтиловым эфиром, сушили на воздухе. Выход 25.5 г (80%). Rf 0.70 (В).

Z-Trp-Lys(Boc)-NH2

Растворяли 29.2 г (0.077 моль) Z-Lys(Boc)-NH2 в 250 мл этанола, гидрировали над 5% Pd/C до исчезновения исходного по ТСХ в системе (Б). Катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали досуха. Остаток растворяли в 250 мл DMF, добавляли 35.4 г (0.077 моль) Z-Trp-ONp. Реакционную смесь перемешивали 12 ч при 20°С, упаривали, к остатку добавляли 250 мл этилацетата, промывали 5% раствором NH4OH (3×150 мл), водой до нейтральной реакции, 2% H2SO4 (2×150 мл), водой до нейтральной реакции, упаривали. Кристаллизовали из диэтилового эфира, отфильтровывали, сушили на воздухе. Выход 39.0 г (89%). Rf 0.81 (Б).

Z-dPhe-Arg-Trp-Lys(Boc)-NH2

Растворяли 39.0 г (0.069 моль) соединения (4) в 250.0 мл этанола, гидрировали над 5% Pd/C до исчезновения исходного по ТСХ в системе (Б). Катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали досуха, остаток кристаллизовали из диэтилового эфира, сушили на воздухе при 20°C. Полученные 24.1 г (0.056 моль) H-Trp-Lys(Boc)-NH2 растворяли в 300.0 мл DMF, добавляли 25.5 г (0.056 моль) соединения (III), 17.0 г (0.122 моль) НОВТ. Реакционную смесь охлаждали до -30°С, добавляли при перемешивании 14.0 г (0.067 моль) DCC, перемешивали 1 ч при -30°C, 12 ч при 20°C. Реакционную смесь упаривали, остаток растворяли в этилацетате, промывали 5% раствором NaHCO3 (3×150 мл), водой до нейтральной реакции, 2% H2SO4 (2×150 мл), водой до нейтральной реакции, упаривали, кристаллизовали из эфира, осадок отфильтровывали, сушили на воздухе. Выход 40.1 г (82%). Rf 0.62 (В).

Ac-Nle-Asp(OBut)-His-dPhe-Arg-Trp-Lys(Boc)-NH2

Растворяли 4.35 г (0.005 моль) соединения (5) в 80.0 мл этанола, гидрировали над 5% Pd/C до исчезновения исходного по ТСХ в системе (Б). Катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали досуха, остаток растворяли в 80.0 мл DMF. Полученный аминокомпонент конденсировали с 2.40 г (0.005 моль) соединения (IV) при помощи 4.2 г (0.0055 моль) комплекса F. Реакционную смесь перемешивали 12 ч при 20°C, упаривали, остаток растворяли в 100 мл смеси бутанола и этилацетата (1:1), промывали 5% раствором NaHCO3 (3×150 мл), водой до нейтральной реакции, 2% H2SO4 (2×150 мл), водой до нейтральной реакции, упаривали. К остатку добавляли смесь этилацетата и диэтилового эфира, выпавший осадок отфильтровывали, сушили на воздухе. Выход 5.4 г (90%). Rf 0.43 (Б).

Ac-Nle-Asp-His-dPhe-Arg-Trp-Lys-NH2

5.4 г (0.0045 моль) соединения (6) обрабатывали 80.0 мл смеси TFA и этандитиола (9.5:0.5) 1 ч при 20°C. Реакционную смесь упаривали, масло растирали с эфиром, осадок отфильтровывали, промывали эфиром, сушили в вакууме над NaOH. Продукт подвергали очистке на колонке (250×400 мм) с SP-сефадексом С-25, уравновешенным 0.05 М пиридин-ацетатным буфером. Элюцию проводили градиентом ионной силы пиридин-ацетата от 0.05 до 2.0 М раствора со скоростью 25 мл/ч. Детекцию осуществляли при 280 нм. Фракции, содержащие основной продукт, объединяли, упаривали, растворяли в воде, лиофилизировали. Выход 2.8 г (60%). Rf 0.46 (Г).

Пример 2. Синтез хелатирующей группы для присоединения к линейному пептиду

Схема синтеза хелатирующей группы приведена на рис.3.

Последовательность синтеза состоит из 4 стадий и включает синтез 4 соединений и наращивание цепи с замещением отдельных групп до получения хелатирующей группы для присоединению к целевому пептиду по следующей схеме, рис.3.

Синтез хелатирующей группы описывается в соответствии с представленной схемой.

Boc-Cys(Acm)-Gly-OH

Растворяли 4.13 г (0.010 моль) Boc-Cys(Acm)-ONp в 80.0 мл DMF, добавляли 0.90 г (0.012 моль) глицина в 12.0 мл 1N NaOH. Реакционную смесь перемешивали 12 ч при 20°С, упаривали, остаток растворяли в воде, экстрагировали выделившийся HONp эфиром, подкисляли водный раствор 20% H2SO4, экстрагировали целевой продукт 100 мл смеси бутанола и этилацетата (1:1), промывали водой до нейтральной реакции, упаривали. Маслообразный остаток растирали с эфиром и гексаном, осадок отфильтровывали, промывали гексином, сушили на воздухе при 20°С. Выход 2.1 г (60.0%). Rf 0.44 (Б).

TFA×H-Cys(Acm)-Gly-OH

Обрабатывали 4.0 г (0.011 моль) соединения (7) 50.0 мл TFA 1 ч при 20°С. Реакционную смесь упаривали, масло растирали с эфиром, осадок отфильтровывали, промывали эфиром, сушили в вакууме над NaOH. Выход 3.6 г (91%). Rf 0.63 (Г).

Boc-Cys(Acm)-Gly-Cys(Acm)-Gly-OH

Растворяли 4.0 г (0.011 моль) соединения (8) в 80 мл DMF, добавляли 1.60 г (0.011 моль) HONp. Реакционную смесь охлаждали до - 30°C, добавляли при перемешивании 3.0 г (0.014 моль) DCC, перемешивали 1 ч при -30°C, 12 ч при 20°C, упаривали, растирали с гексаном, гексан декантировали. Полученный маслообразный остаток растворяли в 40 мл DMF, добавляли раствор 3.6 г (0.010 моль) соединения (X) и 2.2 мл N-метилморфолина в 40 мл DMF. Реакционную смесь перемешивали 12 ч при 20°С, упаривали, остаток растворяли в воде, экстрагировали выделившийся HONp эфиром, подкисляли водный раствор 20% H2SO4, экстрагировали целевой продукт 100 мл смеси бутанола и этилацетата (1:1), промывали водой до нейтральной реакции, упаривали. Маслообразный остаток растирали с эфиром, осадок отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром, сушили на воздухе при 20°С. Выход 3.77 г (65%).

Boc-Cys(Acm)-Gly-Cys(Acm)-Gly-ONp

Растворяли 0.77 г (0.0013 моль) соединения (9) в 20 мл DMF, добавляли 0.19 г (0.0013 моль) HONp. Реакционную смесь охлаждали до -30°C, добавляли при перемешивании 0.34 г (0.0016 моль) DCC, перемешивали 1 ч при -30°C, 12 ч при 20°C, упаривали, растирали с гексаном, гексан декантировали. Маслообразный остаток растирали с эфиром, осадок отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром, сушили на воздухе при 20°C. Выход 0.80 г (87%). Rf 0.71 (Г).

Пример 3. Синтез целевого линейного пептидного с хелатирующей группой

Последовательность синтеза состоит из 3 этапов и включает синтез 2 промежуточных соединений и наращивание цепи с замещением отдельных групп до получения целевого пептида 2 по следующей схеме, рис.4.

Синтез целевого линейного пептида с хелатирующей группой изложен в соответствии с представленной схемой.

Растворяли 0.3 г (0.00026 моль) соединения (III) растворяли в 30.0 мл DMF, добавляли при перемешивании 0.100 мл DIPEA, 0.22 г (0.0003 моль) соединения (XI1). Реакционную смесь перемешивали 12 ч при 20°C, упаривали, добавляли 50.0 мл этилацетата, выпавший осадок отфильтровывали, промывали на фильтре этилацетатом. Выход 0.40 г (92%). Rf 0.64 (Г).

Обрабатывали 0.4 г (0.00025 моль) соединения (11) в 20.0 мл смеси TFA и этандитиола (9.5:0.5) 1 ч при 20°C. Реакционную смесь упаривали, масло растирали с эфиром, осадок отфильтровывали, промывали эфиром, сушили в вакууме над NaOH. Выход 0.4 г (98%). Rf 0.3 (Г).

К раствору 1.13 г (0.0007 моль) соединения (12) в 80.0 мл 30% СН3СООН прибавляли раствор 1.80 г ацетата ртути в 20.0 мл 30% СН3СООН. Перемешивали реакционную смесь 1.5 ч при 20°С, пропускали H2S в течение 20 мин. Образовавшийся осадок отфильтровывали, промывали на фильтре дважды 30% СН3СООН, фильтрат упаривали досуха, остаток растворяли в воде, подвергали очистке с помощью ВЭЖХ на колонке (25×250 мл) Диасорб С-16-130Т, 10 мкм, при длине волны 226 нм. В качестве элюентов использовали буфер А 0.01% трифторуксусную кислоту, Б - 80% ацетонитрила в буфере А. Градиент 0.5% буфера Б в минуту. Выход 0.30 г (32%). Чистота целевого пептида 98.3% (колонка Ultropac TSK ODS-120T, 4.6×45 мм, 5 мкм; буфер А: 0.05М KH2PO4, pH 3.0, буфер Б: 70% ацетонитрил + 30% H2O; градиент Б от 20 до 80% за 30 мин, Rt - 13.87 мин). MALDI - MS: расчетная масса - 1362.636, найдено 1362.809.

Пример 4. Получение радиофармацевтического средства на основе линейного пептида с хелатирующей группой, меченного радионуклидом 99mTc

Данный пример описывает проведение реакции мечения радионуклидом 99mTc (технеций-99m) линейного пептида с хелатирующей группой (III) и полученного при этом радиофармацевтического препарата (РФП) для диагностики меланомы. В результате данной реакции был получен линейный пептидный аналог αМСГ, меченный 99mTc (99mTc-αМСГлп), структурная формула которого представлена ниже (IV):

Образец (1 мг) лиофилизата пептидного фрагмента растворяли в 1 мл дистиллированной воды, фасовали по 30 мкл в пробирки Эппендорф и замораживали. Хранили в замороженном виде при -18°C. Образец пептида размораживали при комнатной температуре 5-10 мин. К размороженному пептиду в ту же пробирку дозатором добавляли цитратный буферный раствор и раствор дихлорида олова. Полученный раствор смеси переносили в защитный контейнер и затем к нему прибавляли элюат 99мTcO4- в изотоническом растворе хлорида натрия из генератора 99Мо/99mTc. Соотношения компонентов в смеси обеспечивали pH в диапазоне 4,5-7,0. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре. По истечении 30 мин инкубации реакция мечения была завершена.

Полученный в указанных условиях состав РФП, обеспечивающий высокий выход меченого пептида, соответствующего формуле (IV), представлен в таблице 1.

Таблица 1 Состав РФП на основе линейного пептида, меченого 99mTc Компоненты состава Ед. измерения РФП 1 Хелатированный пептид Мкг/мл 20-30 2 Дихлорид олова Мкг/мл 30-80 3 Активность 99mTc МБк/мл 37-750 Примечание: содержание буфера подбирается для обеспечения оптимального pH.

Пример 5. Определение радиохимической чистоты линейного пептида с хелатирующей группой, меченного радионуклидом 99mTc

Выход реакции мечения - радиохимическую чистоту полученного препарата (РХЧ) определяли методом тонкослойной хроматографии (радио-ТСХ). Для этого раздельно определяли содержание в препарате пертехнетата натрия, 99мTc, и гидролизованного восстановленного 99mTc. Затем РХЧ препарата рассчитывалась по формуле:

РХЧРФП(%)=100(%)-ПТ(%)-ГВТ(%),

где РХЧРФП - радиохимическая чистота пептидного РФП на основе 99mTc, в %;

ПТ - процентное содержание несвязанного пертехнетата;

ГВТ - процентное содержание несвязанного гидролизованного восстановленного 99mTc.

Определение ПТ

Для определения ПТ приготавливают пластины для ТСХ (силикагель на алюминиевой подложке, Merck №5553) длиной 100 мм и шириной 15 мм. Пробу исследуемого раствора (2-4 мкл) наносят на линию старта. Объем пробы подбирают в таком количестве, чтобы можно было статистически достоверно зарегистрировать активность пиков на радиометрической установке. Пластину высушивают на воздухе до полного испарения нанесенной жидкости. Пластину помещают в хроматографическую камеру и проводят хроматографирование до достижения подвижной фазой линии финиша, используя в качестве подвижной фазы ацетон. Проводят количественное определение распределения активности с помощью сканера для радио - ТСХ или прямой радиометрией частей пластины. В этих условиях ПТ имеет значение Rf 0,95±0,05, остальные продукты реакции находятся на линии старта.

Содержание ПТ (%) рассчитывают по формуле:

,

где Афр - активность финишной части хроматограммы, содержащей ПТ;

Аст - активность остальной части хроматограммы.

Определение ГВТ:

Для определения ГВТ приготавливают пластины для ТСХ (целлюлоза Ф на алюминиевой подложке, Merck №5754) длиной 100 мм шириной 15 мм. Пробу исследуемого раствора (2-4 мкл) наносят на линию старта. Объем пробы подбирают в таком количестве, чтобы можно было статистически достоверно зарегистрировать активность пиков на радиометрической установке. Пластину высушивают на воздухе до полного испарения нанесенной жидкости. Пластину помещают в хроматографическую камеру и проводят хроматографирование восходящим методом, используя в качестве подвижной фазы смесь ацетонитрил-вода в соотношении 1:1 (по объему), до достижения подвижной фазой линии финиша. Проводят количественное определение распределения активности с помощью сканера для радио - ТСХ или прямой радиометрией частей пластины. В этих условиях ГВТ имеет значение Rf 0,05±0,05, остальные продукты реакции двигаются вместе с фронтом элюента. Содержание ГВТ (%) рассчитывают по формуле:

,

где Аст - активность стартовой части хроматограммы, содержащей ГВТ;

Аост - активность остальной части хроматограммы.

Для всех образцов меченого пептида, полученного в соответствии с методикой и условиями примера 4, РХЧ составила 94-98%.

Пример 6. Изучение связывания линейного пептида, меченного 99mTc, опухолевыми клетками in vitro.

В экспериментах in vitro была использована культура мышиной меланомы B16F1 из коллекции Российского Научного Центра им. И.Н.Блохина. Использованная культура - фибробластоподобная, жизнеспособность: 98% (окраска трипановым синим на нулевом пассаже).

Клетки культивировали в пластиковых культуральных флаконах (Coming-Costar) с площадью поверхности 25 см2 в среде следующего состава: среда RPMI-1640 и среда Eagla (из полнокомпонентной смеси фирмы Gibco) в соотношении 3:1 с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки - 5%, L-глутамина - 200 мМ и гентамицина 10 ед/мл в CO2-инкубаторе при 37°C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2. Клетки инкубировали до получения полноценного монослоя, количество клеток в котором составляло 2*106 клеток/флакон. Перед началом эксперимента клетки инкубировали в течение 2-х часов в среде без добавления сыворотки. Далее клетки снимали с пластика при помощи раствора трипсин/этилендиамитетраацетат (ЭДТА) (0,05% трипсина, 0,02% ЭДТА), центрифугировали, отмывали раствором Хэнкса и расфасовывали по 5·105 клеток в 1 мл среды в пробирки типа "Эппендорф".

Вначале определяли концентрацию 99mTc-αМСГлп, при которой наблюдается его максимальное связывание с рецепторами клеток меланомы. В суспезию клеток вносили 100 мкл раствора 99mTc-аМСГлп в диапазоне концентраций 30-0,003 мкг/мл с активностью элюата 99мTcO4-, равной 1 мКи/мл.

Клетки инкубировали при 37°C в CO2-инкубаторе в течение двух часов. Затем клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин 2500 об/мин (центрифуга Heidolph), дважды промывали холодным (+4°C) раствором Хэнкса, ресуспендировали в 1 мл среды. Отдельно готовили эталон, представляющий собой 1 мл среды, содержащий 100 мкл исходного раствора 99mTc-αМСГлп в диапазоне концентраций 30-0,003 мкг/мл с активностью элюата 99мTcO4-, равной 1 мКи/мл.

По окончании инкубирования радиоактивный раствор удаляли с помощью процедуры последовательно повторяемых трижды - осаждения центрифугированием и промывания раствором Хэнкса. Измеряли радиоактивность каждой пробы и эталона в гамма-счетчике Wizard 2480 («PerkinElmer LAS /Wallac», Финляндия). Уровень связывания оценивали по формуле:

,

где Ai - счет пробы в импульсах,

Ae - счет эталона в импульсах.

Каждая точка была взята в триплетах.

На рис.5 приведены полученные данные об уровне связывания 99mTc-αМСГлп клетками меланомы в зависимости от концентрации меченого соединения в инкубационной среде.

При внесении в инкубационную среду 99mTc-аМСГлп максимальное накопление в клетках меланомы В16 достигается в диапазоне концентраций 3·10-4-3·10-3 мкг/мл.

Для определения максимального уровня связывания исследовали динамику накопления 99mTc-аМСГлп клетками меланомы. Клетки готовили аналогичным способом, но в отдельных опытах инкубировали в течение 30, 60, 90 и 120 минут с внесенным в инкубационную среду 99mTc-аМСГлп в оптимальной концентрации 3·10-4 мкг/мл. Радиоактивный раствор удаляли троекратно путем осаждения центрифугированием и промыванием раствором Хэнкса. Радиоактивность проб и уровень связывания оценивали как в предыдущем эксперименте. Каждая точка была взята в триплетах.

На рис.6 приведены данные о зависимости уровня накопления 99mTc-αМСГлп клетками меланомы В16 от времени инкубации.

Инкубирование в течение двух часов клеток меланомы В16 с 99mTc-αМСГлп, внесенным в инкубационную среду в оптимальной концентрации, обеспечивает уровень связывания более 4% от внесенной дозы уже к 60 мин инкубации, достигая 4,4% к 120 мин, что принято оценивать как высокий результат. Для сравнения, уровень связывания клетками меланомы В16 меченного 99mTc прототипа (I), на 120 мин инкубации был несколько меньше - до 4,1%.

Пример 7. Исследование интернализации линейного пептида, меченного 99mTc, опухолевыми клетками

Интернализация была определена как включение меченого соединения в клеточные структуры путем их поглощения. Клетки меланомы В16, находящиеся в монослое, промывали охлажденной средой, содержащей 1% бычьей сыворотки. Затем из монослоя получали суспензию клеток. В каждую пробирку, содержащую 1·106 клеток, вносили радиоактивный раствор 99mTc-αМСГлп в концентрации, указанной ранее. Клетки в триплетах для каждой временной точки, инкубировали при 37°C в течение 15, 30, 60, 90 и 120 мин. Инкубирование прерывали путем охлаждения пробирок, центрифугирования и промывания суспензии клеток охлажденной до 4°С средой. Затем, в суспензию клеток вносили глициновый буферный раствор (50 мМ, pH 2,8, 0,1 М NaCl). В течение 5 мин клетки инкубировали в буферном растворе при комнатной температуре. При инкубировании в таких условиях, с поверхности мембран удаляется связанное соединение, не затрагивая при этом цитоплазматические структуры клеток. Клетки осаждали центрифугированием, супернатант удаляли и подвергали радиометрии. Осадок клеток лизировали раствором 1н. NaOH и также подвергали прямой радиометрии. Интернализацию определяли как отношение интернализованной активности к общей активности, связанной клетками (т.е. интернализованной активности и фракции, связанной с рецепторами, расположенными на мембранах). Динамика процесса интернализации 99mTc-αМСГлп показана на рисунке 7.

В данном примере показано связывание 99mTc-αМСГлп с рецепторами, расположенными на мембране клеток меланомы и проникновение его внутрь клетки. Уже через 60 минут после начала инкубирования во внутренние структуры опухолевых клеток включается до 60% от связанной клетками активности, соответственно менее 40% связанной активности остается фиксированными на мембранных рецепторах. К 90 мин достигается максимальный уровень интернализации (70%), который далее сохраняется неизменным в течение остального периода наблюдения. Такая динамика и уровень интернализации считаются оптимальными как критерии оценки степени аффинности пептидного аналога αМСГ к MC1R рецепторам клеток меланомы, что, в частности, определяет перспективность 99mTc-аМСГлп как основного компонента РФП для СПЭКТ диагностики меланомы. Для сравнения, уровень интернализации прототипа (I) на 120 мин инкубации с клетками меланомы В16 был существенно ниже и составил лишь 40%, что указывает на снижение связывания с рецепторами клеток меланомы исходно высокоаффинного аналога αМСГ при его мечении 99mTc через карбонильную хелатирующую группу.

Пример 8. Исследование прочности связывания РФП на основе линейного пептида, меченного 99mTc, с опухолевыми клетками.

Исследование прочности связывания 99mTc-αМСГлп с опухолевыми клетками было проведено с целью косвенной оценки функциональной пригодности РФП на его основе в качестве средства диагностики меланомы in vivo. Для этого были смоделированы условия живого организма: клетки инкубировали в среде, состав которой приближен к составу плазмы крови, температура инкубирования составляла 36,8°C. Прочность связывания была изучена методом вымывания. Для максимального исключения повреждения клеток во время манипулирования с ними, данный эксперимент был осуществлен с монослоями клеточной культуры. В культуральные флаконы, содержащие полноценный монослой клеток и 5 мл культуральной среды, вносили 200 мкл 99mTc-αМСГлп. Клетки инкубировали до достижения максимального накопления изучаемого соединения. Затем радиоактивный раствор удаляли, монослой трижды аккуратно промывали раствором Хэнкса и вносили 5 мл свежей среды. Методом прямой радиометрии определяли уровень накопленной клетками активности. Затем культуральные флаконы вновь помещали в инкубатор и начинали процедуру реинкубирования, во время которой через определенные промежутки времени отбирали пробу культуральной среды (аликвоту). Аликвоты среды также подвергались радиометрии. По окончании была определена динамика вымывания радиоактивных продуктов из клеток в окружающую среду.

Процедуру радиометрии полученных проб осуществляли на автоматическом γ-счетчике Wizard 2480 фирмы "PerkinElmer LAS/Wallac" (Финляндия).

Динамика вымывания радиоактивных продуктов из клеток меланомы В16 в культуральную среду представлена на рисунке 8.

В данном примере регистрировали появление радиоактивного изотопа 99mTc в культуральной среде, не идентифицируя тех соединений, с которыми он был связан.

Как видно из приведенных данных, процесс вымывания радиоактивных продуктов из клеточных структур клеток меланомы В16 в окружающую среду имеет двойственную природу. Вначале, в течение первых 30 мин доля связанной с клетками активности быстро снижалась, но далее снижение резко замедлялось, а связанная активность оставалась высокой - около 60%. Далее продолжалось медленное высвобождение связанной клетками активности за счет выделения меченого пептида или его метаболизированных фрагментов из клеток. При этом через 90 мин реинкубирования до 50% активности оставалось внутри клеток. Что указывает на высокую прочность и длительность связывания меченого пептида с внутренними структурами клеток меланомы и дает хороший прогноз для возможности использования РФП на основе предложенного по изобретению линейного пептида, меченного 99mTc, в качестве способа диагностики меланомы и ее метастазов.

Таким образом, представленные примеры показывают преимущества, высокую функциональную пригодность и перспективность использования предложенного линейного пептидного аналога α-MSH, меченного 99mTc:

Ac-Nle-Asp-His-dPhe-Arg-Trp-Lys-[(Gly-Cys-Gly-Cys)-99mTc]-NH2

в качестве селективной векторной молекулы в составе радиофармацевтического препарата для диагностики меланомы.

Похожие патенты RU2465011C1

название год авторы номер документа
ОКТАПЕПТИД ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РАДИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ, РАДИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОПУХОЛЕЙ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ СОМАТОСТАТИНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ 2011
  • Назаренко Анна Борисовна
  • Рабинович Эдуард Зиновьевич
  • Овчинников Михаил Владимирович
  • Кодина Галина Евгеньевна
  • Брусникин Александр Борисович
RU2457215C1
ЦИКЛИЧЕСКИЙ ОКТАПЕПТИД, РАДИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ РАДИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ (ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ) СРЕДСТВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НОВООБРАЗОВАНИЙ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ СОМАТОСТАТИНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ 2013
  • Назаренко Анна Борисовна
  • Волознев Лев Васильевич
  • Гринин Максим Геннадьевич
RU2528414C1
КОНЪЮГАТЫ АНТАГОНИСТА ПЕПТИДА АНАЛОГА БОМБЕЗИНА 2009
  • Хельмут Мэкке
  • Жан Клод Рёби
  • Розальба Манси
RU2523531C2
МЕЧЕНЫЕ РАДИОАКТИВНЫМ ИЗОТОПОМ ПЕПТИДЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ТЕРАПИИ 1996
  • Дин Ричард Т.
  • Пирсон Дэниел Э.
  • Листер-Джеймс Джон
  • Сивителло Эдгар Р.
RU2171117C2
ПЕПТИДНЫЕ ВЕКТОРЫ 2004
  • Донг Чжен Ксин
  • Шен Йилана
  • Комсток Джинн Мэри
  • Ким Сан Х.
RU2361876C2
УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЕ ПЕПТИДНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, ВЫСВОБОЖДАЮЩИЕ ГАСТРИН 2003
  • Каппеллетти Энрико
  • Латтуада Лучиано
  • Линдер Карен Э.
  • Маринелли Эдмунд
  • Наньджаппан Паланиаппа
  • Раджу Натарайан
  • Свенсон Рольф Э.
  • Твидл Майкл
RU2330859C2
ЛИОФИЛИЗАТ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ РАДИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА 2017
  • Брускин Александр Борисович
  • Рахимов Марат Галиевич
  • Клементьева Ольга Евгеньевна
  • Шимчук Григорий Геннадиевич
  • Лунева Кристина Андреевна
  • Лунев Александр Сергеевич
RU2702238C2
ЦИКЛОПЕПТИДЫ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ 1996
  • Альфред Йончик
  • Симон Гоодман
  • Беате Дифенбах
  • Арне Зуттер
  • Гюнтер Хельцеманн
  • Хорст Кесслер
  • Михель Дехантсрайтер
RU2157379C2
АНТАГОНИСТЫ GRPR ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ, ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ GRPR-ПОЗИТИВНОГО ОНКОЛОГИЧЕСКОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ 2013
  • Маина-Нок Теодосия
  • Нок Бертхольд Артур
  • Де Йонг Хендрикс Марион
RU2693465C2
АГЕНТЫ ДЛЯ ВИЗУАЛИЗАЦИИ 2004
  • Кутбертсон Алан
  • Солбаккен Магне
RU2355702C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 465 011 C1

Реферат патента 2012 года РАДИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ МЕЛАНОМЫ И ЕЕ МЕТАСТАЗОВ

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается создания радиофармацевтических препаратов (РФП) на основе пептидных аналогов нейрорегуляторных пептидов, меченных радиоизотопами, с целью диагностики раковых опухолей. Сущность изобретения: радиофармацевтический препарат для диагностики меланомы и ее метастазов, содержащий линейный гептапептид формулы: Ac-Nle-Asp-His-dPhe-Arg-Trp-Lys-NH2, меченный 99mTc через пептидную хелатирующую группу формулы: Gly-Cys-Gly-Cys-H, ковалентно связанную с ε-аминогруппой C-концевого лизина. Данное изобретение позволяет быстро и эффективно диагностировать раковые опухоли. 8 ил., 1 табл., 8 пр.

Формула изобретения RU 2 465 011 C1

Радиофармацевтический препарат для диагностики меланомы и ее метастазов, содержащий линейный пептид, меченный 99mTc через хелатирующую группу (X), ковалентно связанную с ε-аминогруппой С-концевого лизина, отличающийся тем, что, с целью повышения качества диагностики используют линейный гептапептид формулы:
Ac-Nle-Asp-His-dPhe-Arg-Trp-Lys-NH2,
а в качестве хелатирующей группы (X) используют пептидное соединение формулы:
Gly-Cys-Gly-Cys-H.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2012 года RU2465011C1

УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЕ КОНЪЮГАТЫ N4 ХЕЛАТООБРАЗУЮЩИХ АГЕНТОВ 2005
  • Стори Энтони Эймонн
  • Уодсворт Гарри
  • Пауэлл Найджел Энтони
  • Дункансон Филип
RU2360701C2
US 0005997844 A1, 07.12.1999 A1
КЛЕМЕНТЬЕВА О.Е
Прибор, замыкающий сигнальную цепь при повышении температуры 1918
  • Давыдов Р.И.
SU99A1
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
- М., 2001, с.7-19
Edited by K.E.GERMAN ET AL
Associate

RU 2 465 011 C1

Авторы

Арутюнов Роман Эдуардович

Афанасьев Андрей Анатольевич

Брускин Александр Борисович

Егоров Олег Борисович

Кодина Галина Евгеньевна

Корсунский Валентин Николаевич

Клементьева Ольга Евгеньевна

Кудрявцева Елена Витальевна

Овчинников Михаил Владимирович

Ощепков Василий Николаевич

Даты

2012-10-27Публикация

2011-04-27Подача