УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К РАЗМНОЖЕНИЮ МЛЕКОПИТАЮЩИХ Российский патент 2012 года по МПК A61D19/02 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к усовершенствованиям в и относящимся к размножению млекопитающих и в особенности к усовершенствованиям, которые задействуют катетеры для искусственного осеменения в сочетании с новыми продуктами и процессами для осеменения млекопитающих, таких как свиньи.

Уровень техники

У видов млекопитающих процесс размножения может быть просто описан как оплодотворение, происходящее посредством связывания и слияния мужской гаметы (сперматозоида) с женской гаметой (ооцитом), следующее за попаданием первого в половые пути самки. В природе это происходит посредством естественного спаривания. Однако в пределах интенсивных систем животноводческого производства, которые превалируют в развитых обществах, естественное спаривание в значительной степени замещается методиками принудительного размножения (искусственное осеменение, AI). Очевидно, что это имеет огромное значение для поддержания как генетического улучшения, так и экономически выгодного производства/конкурентоспособности.

С современным развитием широкомасштабных животноводческих программ, основанных на AI, потребность в транспортировке спермы из места взятия семени к месту осеменения и необходимость покрывать большие количества самок в течение неопределенных периодов в различное время года требует сохранения сперматозоидов в искусственных условиях в течение периодов, варьирующих от дней до недель. В результате, появились проблемы, касающиеся сохранения функции спермы и способности к оплодотворению в момент осеменения. Особой заботой, сопровождающей хранение спермы, является значительное уменьшение подвижности сперматозоидов, их продвижения вперед, и ослабление капацитации, то есть последующей способности сперматозоида сливаться с яйцеклеткой.

Все это является свойствами огромного значения для достижения адекватных уровней размножения. Особый интерес на сегодняшний день представляют основные механизмы, которые имеют способность "включать" данные первичные регулирующие свойства репродуктивной способности. Был идентифицирован ряд основных метаболитов, задействованных в размножении, но их эффективное применение при действительных условиях до сих пор не изучено. В этом случае возможности применения на практике сочетанных эффектов на подвижность и последующее оплодотворение могли бы быть огромными не только относительно "полевых" ситуаций, но также в условиях особого осеменения, при котором пригодность сперматозоидов и успешность осеменения пользуются большим спросом, например, при малом количестве особого генетического материала, половой предварительной селекции сперматозоидов.

Введение какого-либо метаболита в процесс осеменения всегда ставит особые проблемы. Уровни энергии и взаимозависимые механизмы внутри сперматозоидов имеют ограниченную природу, и, несмотря на то, что разработаны средства хранения, предназначенные для уменьшения силы сперматозоидов и сохранения метаболических свойств, неизбежно значительное разрушение доступной энергии и связанных метаболических процессов. Таким образом, введение какого-либо метаболита для стимулирования подвижности во время, не являющееся моментом осеменения, может противоречить какой-либо степени успеха. Подобным образом, введение какого-либо метаболита для стимулирования капацитации может приводить к преждевременной капацитации. Дополнительные наложения также должны быть приняты во внимание. Таким образом, какой-либо метаболит должен быть введен с постоянной скоростью в семенной инфузат, чтобы оказывать одинаковое воздействие на все сперматозоиды. Метаболит должен быть способным оказывать влияние на всем протяжении половых путей самки и совпадать как с физическими, так и биохимическими характеристиками сперматозоидов. Практически методика должна быть максимально одинаково "удобной для пользователя" для оператора и животного-реципиента, и в то же время должны учитываться конкретные видоспецифические проблемы, например, у свиней стимулирование как подвижности, так и капацитации должно покрывать продолжительный период высвобождения большого количества яйцеклеток.

Сущность изобретения

В соответствии с настоящим изобретением, предоставлена система доставки с управляемым/замедленным высвобождением, содержащая комбинацию метаболит/носитель, основанную на особых гелях, полимерах и/или других молекулярных комплексах, для доставки метаболита в место осеменения для того, чтобы способствовать аспектам функции сперматозоидов.

Настоящее изобретение имеет конкретное применение, если сперма хранится в течение продолжительного периода.

Был идентифицирован ряд метаболитов, которые обладают способностью стимулировать подвижность, их характеристики и капацитацию.

Изобретение описывает, в одном аспекте, инновационный подход для доставки таких стимулирующих метаболитов, отдельно или в комбинации.

Предпочтительно, изобретение содержит полутвердый вкладыш, размещенный внутри дистального конца катетера для AI.

Предпочтительно, полутвердый вкладыш содержит гель, состоящий из комбинации пектинов сложного метилового эфира.

Изобретение задействует включение/связывание метаболитов известной стимулирующей активности, чтобы стимулировать основные параметры функции сперматозоидов, в частности подвижность, их характеристики подвижности и капацитации.

Изобретение описывает задействованную доставку комбинации кофеина и CaCl₂ (Ca²⁺), чтобы стимулировать подвижность сперматозоидов и характеристики подвижности и капацитацию, соответственно.

Физические характеристики вкладыша были такими, чтобы обеспечить неподвижность внутри устройства для осеменения при хранении, но его немедленную мобилизацию и перенесение в качестве комплекта объект плюс метаболиты в половые пути самки (матку) в осеменительной среде в момент осеменения.

Химические свойства вкладыша были такими, чтобы сделать возможной постепенную, но регулируемую растворимость внутри половых путей самки (матки), чтобы облегчить модулированное постепенное высвобождение метаболитов на протяжении выбранного продолжительного периода времени.

Модулированное высвобождение может иметь по существу постоянную скорость высвобождения на протяжении заранее предопределенного времени. В дополнение, скорость высвобождения может быть изменена в любом заданном носителе посредством подбора более чем одного геля (каждый из которых имеет различные скорости растворения) для создания носителя. При этом гель приспособлен растворяться при нормальной температуре или около нормальной температуры тела млекопитающего. Предпочтительно, гель приспособлен растворяться при контакте с осеменительной средой. Согласно изобретению, вкладыш и осеменительная среда по существу гомогенно переносятся в половые пути самки (матку).

Высвобождение метаболита из вкладыша и последующие воздействия на характеристики сперматозоидов были тестированы in vitro на свиных сперматозоидах от хряков чистопородного разведения, а его эффективность - на фертильность посредством полевого осеменения.

Высвобождение метаболита продемонстрировало значительные положительные воздействия на подвижность сперматозоидов и взаимосвязанные характеристики по сравнению с контрольными.

Положительные воздействия высвобождения кофеина на характеристики сперматозоидов оставались очевидными в течение полного 24-часового периода культивирования.

Практическая эффективность модифицированного катетера для осеменения была установлена с помощью полевых испытаний (все еще продолжающихся) на свиноматках чистопородного разведения.

В условиях производства применение модифицированного катетера для осеменения привело к дополнительным поросятам, на 100 осеменений в диапазоне 44-387 по сравнению с применением стандартных катетеров, как результат сочетания повышенных коэффициента опороса и общей рождаемости.

Изобретение применимо для модулированной доставки сочетаний/комбинаций ряда метаболитов с установленной способностью стимулировать характеристики сперматозоидов в момент осеменения для улучшения оплодотворения.

Изобретение применимо в отношении ряда животных, помимо свиней, когда AI имеет большое значение и экономическую важность.

Изобретение применимо для повышения репродуктивной эффективности для ряда профильных методик AI, например, глубокого осеменения in utero, уменьшающего количество сперматозоидов, следующего за X/Y определением пола сперматозоидов.

Настоящее изобретение предоставляет устройство доставки с управляемым/замедленным высвобождением для искусственного осеменения млекопитающих, как дополнительно определено в прилагаемой формуле изобретения.

Краткое описание чертежа

Фиг.1 представляет собой вид сбоку катетера для AI, содержащего устройство в соответствии с настоящим изобретением.

В соответствии с настоящим изобретением был проведен ряд экспериментальных работ. Основные задачи работы были взяты, как описано далее.

(i) Исследование как теоретически, так и практически пригодной системы для модулированной доставки (a) метаболита с целью стимулирования подвижности и продвижения вперед сперматозоидов, следующих за продолжительным периодом хранения спермы, и (b) метаболита для индуцирования капацитации.

(ii) Оценка опций для совместимости с устройствами для стандартного осеменения и в полевом применении, чтобы доставить метаболит к моменту осеменения.

(iii) Оценка/количественное определение выбранной системы с точки зрения совместимости со спермой инфузата для AI и модулированного высвобождения/доставки метаболитов в инфузат семенной жидкости.

(iv) Модулированное высвобождение/доставка метаболитов в жидкостную среду in utero.

(v) Количественное определение высвобождения метаболита на протяжении последующих периодов времени.

(vi) Оценка воздействия такого модулированного высвобождения метаболита на основные свойства сперматозоидов.

(vii) Полевые испытания системы доставки и оценка с точки зрения фертильности и репродуктивной способности.

(viii) Техническая и коммерческая оценка системы с точки зрения рыночной приемлемости.

Технологии проведения эксперимента, описания и результаты

инструкции

Исследования были выполнены на сперме свиней, полученной от племенных хряков крупных белых/ландрасов, помещенных в комплексы промышленной селекции и создания пород. Выбор свиньи для экспериментальных работ был основан на том факте, что в интенсивном стаде наибольшая проблема со сперматозоидами от хряка присутствует в связи с негативными воздействиями, обусловленными хранением с точки зрения ухудшения качества, подвижности и последующей способности к оплодотворению, чтобы покрывать протяженную мультиовуляторную половую систему самки.

Качественные и количественные аналитические данные задействовали широкое применение стандартных и существующих на современном уровне техники лабораторных методик, например, спектрофотометрию, капиллярную газожидкостную хроматографию, высокоэффективную жидкостную хроматографию, оценку количества клеток и сохранности с помощью дифференциального окрашивания и параметров подвижности с помощью компьютерного анализа подвижности сперматозоидов (CASA).

Сообщенные полевые данные о параметрах оплодотворения (успешность осеменения, живо- и мертворождаемость и т.д.) были получены на результатах осеменения, стандартных контрольных и экспериментальных, выполненного в селекционных комплексах осеменением, растянувшимся на период от двух до трех месяцев (июль-сентябрь) во всех случаях, и последующего рождения потомства в октябре-декабре. Свиноматки, распределенные в опытную либо контрольную группу, были сбалансированы для равенства количества (количество опоросов) и размножались. Все свиноматки были осеменены дважды (при нулевом времени и 24 часах) в соответствии с устоявшейся практикой с использованием дозы спермы 75 мл, которая была собрана от одного и того же хряка и распределена поровну на две группы. Сравнительные данные, полученные на основании полевых исследований, были такими:

(a) Процентное значение коэффициента опороса, т.е. количество свиноматок, которые действительно произвели помет поросят после AI.

(b) Общее количество родившихся поросят, т.е. количество поросят, родившихся живыми и умершими при опоросе.

(c) Интерполяция таких данных в показателях коммерческой выгоды от воздействия.

Описание и результаты

Система (основная)

Фиг.1 показывает стандартный универсальный катетер 1 для осеменения свиней, который содержит удлиненную цилиндрическую трубку 9 длиной 0,5 м с проксимальным концом 4 и дистальным концом 6. Проксимальный конец 4 содержит пластмассовую крышку 11, которая имеет заглушку 15, приспособленную для вставления в конец трубки 9. Дистальный конец 6 катетера 1 содержит луковицеобразную головку 5, имеющую заглушку 3, приспособленную для вставления в конец трубки. Устройство настоящего изобретения 7, содержащее носитель и метаболит (также названное вкладышем/пробкой с регулируемым высвобождением), размещено в трубке 9 в или около его дистального конца и занимает пространство внутри луковицеобразной головки катетера для осеменения приблизительно в 2-3 см от конца пластмассовой трубки. Вкладыш с регулируемым высвобождением может быть залит в трубку 9 в виде заранее предопределенного количества жидкости, которую охлаждают для образования геля, или вкладыш с регулируемым высвобождением может быть заранее сформирован и вставлен в трубку 9.

При использовании, приблизительно 75 мл инсемината (сперматозоиды плюс разбавитель) доставляется через трубку 9. Разбавитель может охватывать полный ассортимент стандартных коммерческих продуктов. В дополнение, катетер для AI может быть стандартного типа и любой модификации стандартного катетера для целей настоящего изобретения, которые не могут препятствовать или осложнять установленные процедуры осеменения.

В одном предпочтительном примере настоящего изобретения применяли вкладыш с регулируемым высвобождением, состоящий из 6 процентного (об/об) водного геля высших сложных метиловых эфиров пектинов. Выбранными активными метаболитами во вкладыше являлись кофеин, чтобы способствовать подвижности сперматозоидов и продвижению вперед, и Ca²⁺ (предоставленный в виде CaCl₂), чтобы способствовать капацитации.

В соответствии с изобретением вкладыш с регулируемым высвобождением предназначен для того, чтобы предоставить необходимое сочетание физических свойств: неподвижность, соответствующую хранению при 15-20°C до применения, и немедленную мобилизацию как единое целое, когда осеменительная жидкость подвержена перенесению в половые пути самки (матку). В целом, вкладыш с регулируемым высвобождением был разработан таким образом, что его вязкость позволяет ему оставаться расположенным в заранее предопределенном месте (обычно дистальный конец трубки для AI), когда она не используется, а также легко перемещаться в матку млекопитающего, когда семенная жидкость вводится в трубку.

В дополнение, является предпочтительным, чтобы вкладыш с регулируемым высвобождением демонстрировал некоторую степень эластичности, чтобы он мог сохранить свою форму, когда он находится под воздействием нагрузки.

Вкладыш с регулируемым высвобождением может также включать в себя термореактивный гель. Это позволит использующему вводить гель в трубку для AI в качестве жидкости, которая будет превращаться в гель, когда жидкость охлаждается.

Вкладыш с регулируемым высвобождением разработан для того, чтобы предоставить немедленное постепенное высвобождение/доставку метаболитов однократно в половых путях (37°C) под сочетанным воздействием продолжающегося присутствия осеменительной жидкости и секреции природных тканей на протяжении продолжительного периода времени, значительного, чтобы покрыть период овуляции. Постепенное высвобождение обеспечивается, когда гель растворяется в матке, причем данный тип высвобождения обладает преимуществом перед гелями, из которых жидкость вымывается. Поскольку вымывание фактически обезвоживает гель, это может привести к гелю с крайне низким содержанием воды, оставшемуся в качестве остатка в матке. В дополнение, доля метаболита в геле будет при этом оставаться.

В случаях, когда были использованы пектиновые гели, было обнаружено, что присутствие метаболита изменяет свойства пектинового геля так, что, при отсутствии метаболитов, гель может быть вновь расплавлен (термообратимый). Однако, когда метаболиты присутствуют, гель не является термообратимым.

Таблица 1 показывает результаты, полученные на способности устройства высвобождать кофеин и Ca²⁺ на протяжении последующего 30-минутного периода воздействия стандартного разбавителя BTS при 37°C.

Воздействия высвобождения кофеина, улучшающего характеристики подвижности сперматозоидов, были последовательно измерены в течение 24-часового периода культивирования вкладыша при 37°C в 75 мл разбавителя BTS, содержащего 2 миллиарда сперматозоидов, т.е. эквивалента одного стандартного осеменения. Значительное воздействие на подвижность наблюдали на протяжении всех 24 часов. Таким образом, сравнительные результаты для подвижности сперматозоидов в течение 24 часов после высвобождения кофеина были такими: до воздействия кофеина, т.е. в нулевой момент времени, 70-75%; контрольные (без воздействия кофеина) 60-65%; после воздействия кофеина 85-90%.

Таблица 2 показывает данные продуктивности, полученные в результате сравнительных полевых исследований, задействующих производителей обычного скота и производителей племенного скота. Осеменение катетером, модифицированным, чтобы содержать устройство в соответствии с настоящим изобретением, повышает коэффициент опороса и выход поросят в обоих случаях, давая повышение до 112 дополнительных поросят на 100 свиноматок в случае производителей обычного скота и, несмотря на очень высокие уровни продуктивности, 44 дополнительных поросенка на 100 свиноматок в случае производителей племенного скота.

Таблица 1
Коэффициенты высвобождения (% от начального общего включен) кофеина и кальция из пектинового вкладыша после культивирования в разбавителе BTS при 37°C Время (ч) 0,25 0,5 0,75 1,00 1,25 1,50 % высвобождения кофеина и кальция 5 25 53 65 74 81   Время (ч) 1,75 2,00 2,30 3,00 4,00 6,00 % высвобождения кофеина и кальция 84 85 87 90 94 100

Таблица 2
Данные продуктивности для устройства в соответствии с настоящим изобретением эффективность производства/производительности, использующим катетер для AI, показывающие для производителей обычного и племенного скота при использовании устройства в соответствии с настоящим изобретением   Производители обычного скота Производители племенного скота Контрольная Опытная Контрольная Опытная Коэффициент опороса, % 82 88 89 91 Поросята/свиноматки 12,8 13,2 12,8 13 Общее количество поросят/сто свиноматок 1050 1162 1139 1183 Дополнительные поросята/100 свиноматок 112 44 Средний эффект/сто свиноматок 78 Средний эффект/свиноматку 0,78

Таблицы 3 и 4 ниже показывают дополнительные испытания в 4 племенных хозяйствах обычного скота, где были зарегистрированы аналогичные, но улучшенные эффекты по отношению к тем, что были зарегистрированы в таблице 2.

Таблица 3   Хозяйство 1 Хозяйство 2 Контрольная Опытная Контрольная Опытная Коэффициент опороса, % 80 90 85 96 Поросята/свиноматки 11 12 9 12 Общее количество поросят/100 свиноматок 880 1080 765 1152 Дополнительные поросята/100 свиноматок 200 387

Таблица 4   Хозяйство 3 Хозяйство 4 Контрольная Опытная Контрольная Опытная Коэффициент опороса, % 80 83 83 89 Поросята/свиноматки 11 12 11 12 Общее количество поросят/100 свиноматок 880 996 913 1068 Дополнительные поросята/100 свиноматок 116 155

Средний эффект на 100 свиноматок для хозяйств 1-4 составляет 233 дополнительных поросенка.

Средний эффект на свиноматку для хозяйств 1-4 составляет 2,33 дополнительных поросенка.

Носитель должен обеспечить неподвижность внутри устройства для осеменения во время хранения, но его немедленную мобилизацию и перенесение в виде комплекта объект плюс метаболиты в половые пути самки (матку) в осеменительной среде в момент осеменения. В дополнение, носитель должен обеспечить возможность постепенного, но регулируемого растворения внутри половых путей самки (матки), чтобы облегчить модулированное постепенное высвобождение метаболитов на протяжении выбранного продолжительного периода времени.

Чтобы предоставить носитель в устройстве в соответствии с настоящим изобретением, может быть использован ряд полимеров, включая полисахариды. Был испытан большой набор сочетаний/комбинаций полисахаридов, каждый из которых продемонстрировал способности, чтобы удовлетворить этим требованиям.

Примерами типов носителей, которые могут быть применены, являются следующие гели и гелеобразующие вещества:

геллановые камеди;

альгинаты;

желатин/кукурузный крахмал; и

ксантан/камедь бобов рожкового дерева.

В целом, предпочтительный гель должен демонстрировать по меньшей мере несколько из следующих свойств в некоторой степени: эластичность; пластичность; термореактивность; быть растворимым, биологически разрушаемым; и биологически совместимым.

В еще одном варианте осуществления изобретения носитель содержит два геля, имеющие различные композиции и которые высвобождают метаболиты с различными скоростями.

В дополнение, выбор простого смешивания кофеина и Ca²⁺ в вышеуказанном примере настоящего изобретения был основан на полностью подтвержденных данных для их соответствующих стимулирующих способностей в отношении характеристик подвижности сперматозоидов и капацитации.

Однако носитель представляет собой вполне допускающий включение в себя и высвобождение управляемым способом ряда как органических, так и неорганических метаболитов со сходными стимулирующими способностями (например, стероиды, ацетилированные гликофосфолипиды, альбумин, производные ксантина, основанные на пептидах гормоны и различные полумикро-/микрокатионы).

Настоящее изобретение имеет способность запускать высвобождение любых стимулирующих метаболитов, чтобы быть пригодным для ряда особых условий, например в условиях:

1. дополнения к стандартным устройствам для осеменения,

2. временных и пространственных потребностей, например, соответствующих времени осеменения, размещению внутрь половых путей самки, моно-/мультиовуляторной системе,

3. соответствующего высвобождения метаболита, например, абсолютный уровень, прерывистый или постоянный,

4. однородности введения,

5. идеального варианта активирования высвобождения метаболита, например, физического, химического инициирования.

Успешные результаты такой системы доставки могли бы быть не только уникально инновационными и тем самым высококоммерциализированными, но также имеют потенциал для ответвления других важных направлений в секторе оплодотворения, таких как AI человека и выживание оплодотворенной яйцеклетки после оплодотворения in vitro.

Усовершенствования и модификации могут быть включены в данное изобретение без отклонения от объема правовых притязаний изобретения.

Группа изобретений относится к области искусственного осеменения млекопитающих. Устройство для осеменения включает вкладыш доставки с управляемым/замедленным высвобождением для искусственного осеменения млекопитающих, причем вкладыш включает носитель, содержащий метаболит, и приспособлен оставаться внутри устройства для осеменения во время хранения, но выполнен с возможностью его мобилизации и перенесения в половые пути самки (матку) в осеменительной среде в момент осеменения. Носитель содержит полимер, приспособленный доставлять метаболит в место осеменения для того, чтобы способствовать подвижности, продвижению вперед и капацитации сперматозоидов в сперме. Группа изобретений относится также к способу искусственного осеменения млекопитающих посредством вышеуказанного устройства. Группа изобретений обеспечивает повышение эффективности оплодотворения млекопитающих и общей рождаемости. 2 н. и 17 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл.

1. Устройство для осеменения, включающее вкладыш доставки с управляемым/замедленным высвобождением для искусственного осеменения млекопитающих, причем вкладыш включает носитель, содержащий метаболит, где носитель содержит полимер, приспособленный доставлять метаболит в место осеменения для того, чтобы способствовать подвижности, продвижению вперед и капацитации сперматозоидов в сперме, причем указанный вкладыш приспособлен оставаться внутри устройства для осеменения во время хранения, но делает возможными его мобилизацию и перенесение в половые пути самки (матку) в осеменительной среде в момент осеменения.

2. Устройство для осеменения по п.1 в форме катетера.

3. Устройство для осеменения по п.1, где вкладыш и осеменительная среда, по существу, гомогенно переносятся в половые пути самки (матку).

4. Устройство для осеменения по п.1, где носитель иммобилизирует метаболит во время хранения, но мобилизирует метаболиты при введении в половые пути самки (матку).

5. Устройство для осеменения по п.1, где носитель растворяется внутри половых путей самки (матки), чтобы облегчить высвобождение метаболитов на протяжении выбранного периода времени.

6. Устройство для осеменения по п.1, где носитель содержит два или более типов полимеров, которые включены в носитель и которые растворяются внутри половых путей самки с различной скоростью.

7. Устройство для осеменения по п.1, где вкладыш приспособлен для вставления в дистальный конец катетера для AI.

8. Устройство для осеменения по п.1, где носитель содержит гель.

9. Устройство для осеменения по п.8, где гель представляет собой термореактивный гель.

10. Устройство для осеменения по п.8, где гель приспособлен растворяться при или около нормальной температуры тела млекопитающего.

11. Устройство для осеменения по п.8, где гель приспособлен растворяться при контакте с осеменительной средой.

12. Устройство для осеменения по п.8, где гель содержит полисахарид.

13. Устройство для осеменения по п.12, где гель содержит комбинацию пектинов сложного метилового эфира.

14. Устройство для осеменения по п.1, где носитель содержит гелеобразующее вещество.

15. Устройство для осеменения по п.1, где метаболит стимулирует подвижность сперматозоидов.

16. Устройство для осеменения по п.1, где метаболит стимулирует капацитацию.

17. Устройство для осеменения по п.15, где метаболитом является кофеин, и/или Са²⁺, и/или стероиды, и/или ацетилированные гликофосфолипиды, и/или альбумин, и/или производные ксантина, и/или пептидные гормоны.

18. Устройство для осеменения по п.14, где метаболитом являются ионы Са²⁺.

19. Способ искусственного осеменения млекопитающих, включающий осеменение млекопитающего устройством для осеменения по любому из предшествующих пунктов.