СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДНОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ПЕЧЕНИ РЫБ ТРЕСКОВЫХ ПОРОД Российский патент 2013 года по МПК A61K35/60 A61K38/02 

Описание патента на изобретение RU2472517C1

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к способам получения биологически активных веществ из субпродуктов животного происхождения, в частности к получению биологически активных комплексов на основе водорастворимых белков печени рыб семейства Gadidae, обладающих сбалансированным аминокислотным составом, повышенным содержанием пептидов и высокой антиоксидантной активностью.

Одним из основных компонентов системы внутренних органов, богатых высококачественными протеинами, является печень. Содержание протеинов в печени, в зависимости от вида рыб, может достигать 20% (Bechtel et al. Chemical characterization of liver lipid and protein from cold-water fish species. J. Food Sci. 2006. 71(6): 480-485). Наиболее изученными пептидами из внутренних органов являются пептиды, выделенные из гидролизатов кишечника и печени рыбы бонито Gymnosarda unicolor (Ahn et al. Enzymatic production of bioactive protein hydrolysates from tuna liver: effects of enzymes and molecular weight on bioactivity. Int. J. Food Sci. Technol. 2010. 45: 562-568; Karaki et al. Oral administration of peptides derived from bonito bowels decreases blood pressure in spontaneously hypertensive rats by inhibiting angiotensin converting enzyme. Comp. Biochem. Physiol. C. 1993. 104(2): 351-353). В печени и других органах японской камбалы Paralichtys olivaceus был обнаружен богатый цистеином пептид гепсидин, проявляющий высокую антимикробную активность (Hirono et al. Two different types of hepcidins from the Japanese flounder Paralichthys olivaceus. FEBS J. 2005. 272(20): 5257-5264). В печени атлантического лосося Salmo salar найдены и локализованы клетки, вырабатывающие эстроген и ксеноэстроген (Arukwe et al. Fish model for assessing the in vivo estrogenic potency of the mycotoxin zearalenone and its metabolites. Sci. Total Environ. 1999. 236(1-3): 153-161), из этого же объекта был выделен белок, обладающий антимикробным действием (Richards et al. Histone H1: an antimicrobial protein of Atlantic salmon (Salmo salar). Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. 284(3): 549-555). Таким образом, печень различных рыб может служить источником большого количества как низкомолекулярных веществ, так и целого набора пептидов, которые можно применять для приготовления лекарственных средств.

Описан способ получения водорастворимого комплекса полипептидов из печени рыб, а именно из печени акулы, применяемого в качестве иммуностимулятора, включающий охлаждение печени акулы до 0°С; распыление охлажденной печени акулы для получения тщательно измельченного материала; смешивание тщательно измельченного материала с равным количеством воды при условии поддерживания в смеси температуры 0°С в течение 20 мин; центрифугирование смеси при 0-4°С в течение 4-6 ч для разделения смеси на три различных слоя, представляющих собой клеточный слой, водный слой и масляный слой; отделение водного слоя от других слоев; фильтрование водного слоя с целью получения профильтрованного раствора; и распыление профильтрованного раствора в вакуумной камере при 0-4°С с целью получения сухого порошкообразного вещества (Pat. US 5840342 (A), опубл. 24.11.1998).

Применение оборудования для распыления охлажденной печени, а также низкотемпературного высокоскоростного центрифугирования в течение нескольких часов является дорогостоящим. Его использование для производства продукции в промышленных масштабах ведет к высоким материальным затратам и удорожанию продукции.

Известен способ получения лекарственного препарата «Скваакан» - комплекса полипептидов из печени рыб, а именно из печени акулы, заключающийся в том, что печень акулы катран гомогенизируют, обезжиривают путем холодного отстоя при 1 - +5°С в течение 20-24 часов, затем обезжиренный гомогенат направляют на термическую и химическую коагуляцию белков при рН 1,0-6,0, оттаивают при комнатной температуре в течение 5-6 ч с получением стабилизированного экстракта, который после центрифугирования и мембранной фильтрации ампулируют и автоклавируют (Pat. RU 2211700 (C2), опубл. 10.09.2003).

Недостатком данного метода является большая длительность процесса и использование для осветления конечного экстракта центрифуг и мембранного оборудования, не позволяющего обрабатывать большие объемы экстракта. Процесс ведется при низком рН, что требует очистки сточных вод от кислот.

Известен способ получения водорастворимого полипептидного комплекса из печени рыб лососевых пород, включающий измельчение исходного сырья, экстракцию дистиллированной водой при соотношении сырье:экстрагент 1:5-1:30 с последующим подщелачиванием суспензии до рН 8-9 и настаиванием ее при комнатной температуре в течение 2-4 часов с перемешиванием, очистку целевого продукта путем обработки жидкой фракции 0.3% раствором хитозана в 3% растворе пищевой органической кислоты при рН 2,5-3,0 в соотношении 1:20 с перемешиванием в течение 1 часа и последующим инкубированием смеси в течение 2-3 часов и двойным разделением путем сепарирования на твердую и жидкую фракции с последующим соединением жидких фракций (Pat. RU 2409291 (C1), опубл. 20.01.2011).

Недостатком этого способа является большое количество рабочих стадий, применение кислот и щелочей, что ведет к большому количеству стоков, требующих очистки, использование дорогостоящего хитозана, обладающего собственной биологической активность.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ комплексной переработки печени рыб семейства тресковых и получения липидного комплекса, гидрофильного комплекса и кормового продукта (Pat. RU 2420213 (C1), опубл. 10.06.2011), выбранный авторами за прототип. Печень рыб семейства тресковых измельчают, массу переносят в реактор с мешалкой и добавляют небольшими порциями при перемешивании растительное масло при соотношении измельченной печени и масла 1:0,2÷5,0. После этого в реактор при перемешивании небольшими порциями вносят воду при соотношении измельченной печени и воды 1:0,2÷5,0. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1-15 мин. Процесс ведут до появления границы раздела фаз, определяемой визуально. Образовавшуюся суспензию центрифугируют для выделения отдельных фракций, различающихся по плотности: гидрофильной, липофильной и плотного остатка. Гидрофильную фракцию, представляющую собой водный раствор биологически активных соединений, содержащую в том числе пептиды, и липофильную фракцию направляют на сепарирование. Плотный остаток используют в качестве кормового продукта. Гидрофильную фракцию после сепарирования направляют на коагуляцию. Полученную липофильную фракцию очищают от примесей нежирового характера. После этого очищают липофильную фракцию от стеринов и восков выдерживанием при температуре от -15 до +5°С (6) в течение 1-24 часов до осаждения балластных веществ и последующим фильтрованием липофильной фракции. Содержание пептидов в гидрофильной фракции составляет около 1-1,15%.

Недостатком данной технологии является затрудненное разделение фракций и необходимости использования центрифугирования, низкое содержание пептидов в гидрофильной фракции, присутствие значительного количества липидов. Данное обстоятельство ограничивает растворимость целевого продукта, что может приводить к снижению активности, более быстрой его порче. Кроме того, данный комплекс не растворим в воде, что ограничивает его биодоступность.

Задачей изобретения является промышленная переработка печени рыб тресковых пород с получением водорастворимого комплекса пептидов, обладающего сбалансированным аминокислотным составом, повышенным содержанием пептидов и высокой антиоксидантной активностью.

Задача изобретения решается тем, что в известном способе, включающем измельчение печени, смешивание с маслом при соотношении печени и масла 1:0,2÷5,0 и водой при соотношении печени и воды 1:0,2÷5,0, расслаивание при комнатной температуре в течение 1-15 мин, центрифугирование, сепарирование, выдерживание липидного комплекса при температуре от -15 до +5°С в течение 1-24 ч и фильтрование, согласно изобретению экстракцию проводят смесью масла и воды при соотношении сырье: экстрагент 1:5-1:30 при комнатной температуре в течение 2-4 часов с перемешиванием, целевой продукт очищают путем обработки органическим растворителем в соотношении 1:0,5÷2 с последующим разделением и высушиванием водного остатка.

Причем в качестве сырья используют печень рыб тресковых пород в свежем, мороженом или сухом виде.

Органический растворитель выбирают из ряда диэтиловый эфир, этилацетат, бутанол, хлороформ.

Сущность способа заключается в следующем. Свежую или замороженную печень рыб тресковых пород (сем. Gadidae) (треска, пикша, минтай, путассу и т.п.) измельчают на куттере или электромясорубке. Как показали предварительные опыты, более тщательное измельчение с разрушением клеток не требуется. Высушенную печень измельчать нет необходимости, поскольку она измельчается перед сушкой. Фарш свежей или замороженной печени или раздробленные кусочки сушеной печени заливают смесью масла и воды при соотношении сырье:экстрагент 1:5-1:20 для свежей или замороженной печени и 1:30 в случае сублимированной печени.

Суспензию инкубируют при комнатной температуре с перемешиванием в течение 2-4 часов, затем отделяют осадок, что целесообразно проводить на промышленном сепараторе или проточной центрифуге непрерывного действия. Жидкую фракцию разделяют, высушивают водный остаток тем или иным способом, за исключением высокотемпературного выпаривания. Далее проводят очистку целевого продукта путем обработки бутанолом в соотношении 1:1 с последующим разделением и высушиванием.

Конечный продукт представляет собой субстанцию коричневого цвета, не гигроскопичный, с солоноватым привкусом и не обладающий неприятным запахом, не содержит токсичных элементов в количествах, превышающих ПДК, и патогенную микрофлору, т.е. является безопасным.

Продукт на 30 или более процентов состоит из пептидов. При проведении электрофореза в полиакриламидном геле выяснилось, что из большого спектра белков и полипептидов, присутствующих в водном экстракте печени рыб семейства Gadidae, в конечном продукте после обработки бутанолом остаются пептидные фракции с молекулярной массой 20-15 кДа, 15-3,5 кДа и низкомолекулярная фракция менее 3,5 кДа, куда входят олигопептиды, свободные аминокислоты и глицерофосфат. В пептидной субстанции отсутствуют высокомолекулярные белковые соединения (по качественной реакции на белок методом осаждения трихлоруксусной кислотой). Содержание свободных аминокислот составило 20-55%, среди которых основными являются: глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, пролин, серии, треонин, лизин, глутамин, валин, тирозин, лейцин и метионин.

Пример 1

2 кг свежей печени трески (Gadus morrhua L.) измельчают с помощью электромясорубки, после чего фарш помещают в аппарат с мешалкой и заливают 20 л смеси растительного масла и воды в соотношении 1:1, перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Полученную суспензию разделяют на сепараторе. Твердую фракцию направляют на изготовление кормовой муки, жидкую фракцию - на дальнейшую очистку от жировых примесей и высокомолекулярных белковых примесей. Полученную водную фракцию лиофильно высушивают и полученный остаток диспергируют в воде и очищают от водонерастворимых примесей экстракцией диэтиловым эфиром в соотношении 1:1. Водную фракцию декантируют и высушивают. В результате получают 18 г сухого пептидного комплекса.

Конечный продукт представляет собой порошок светло-коричневого цвета, не гигроскопичный, с солоноватым привкусом и не обладающий неприятным запахом, не содержит токсичных элементов в количествах, превышающих ПДК, и патогенную микрофлору, т.е. соответствует показателям безопасности.

Пример 2

0,5 кг сублимированной печени пикши (Melanogrammus aeglefinus L.) загружают в реактор с мешалкой и заливают 25 л смеси растительного масла и воды в соотношении 1:1, перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч. Далее поступают аналогично примеру 1, но очищают от водонерастворимых примесей экстракцией бутанолом в соотношении 1:0,5.

Выход пептидного комплекса 5,3 г.

Пример 3

5 кг замороженной печени путассу (Micromesistius poutassou) измельчают, помещают в аппарат с мешалкой и заливают 3,5 л смеси растительного масла и воды в соотношении 1:1, перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч. Далее поступают аналогично примеру 1, но очищают от водонерастворимых примесей экстракцией этилацетатом в соотношении 1:2.

Выход сухого полипептидного продукта 43 г.

Пример 4

Антиоксидантная активность в отношении радикала DPPH.

Антиоксидантную активность композиции по примеру 1 исследовали в отношении радикала DPPH спектрофотометрическим методом. В качестве препарата сравнения использовали Алфлутоп - препарат, получаемый из мелких морских рыб.

Установили, что IC50 для водорастворимых полипептидов, выделенных из печени рыб тресковых пород, составляет около 4,3 мг/мл, что сопоставимо с препаратом сравнения Алфлутоп, для которого IC50 было (4,6 мг/мл).

Похожие патенты RU2472517C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ ПЕЧЕНИ РЫБ ТРЕСКОВЫХ ПОРОД 2012
  • Забозлаев Александр Александрович
  • Пожарицкая Ольга Николаевна
  • Шиков Александр Николаевич
  • Демченко Дмитрий Валентинович
  • Макаров Валерий Геннадьевич
RU2495672C1
КОМПЛЕКСНАЯ ПЕРЕРАБОТКА ПЕЧЕНИ РЫБ СЕМЕЙСТВА ТРЕСКОВЫХ 2009
  • Пожарицкая Ольга Николаевна
  • Демченко Дмитрий Валентинович
  • Шиков Александр Николаевич
  • Макаров Валерий Геннадьевич
  • Фомичев Юрий Сергеевич
RU2420213C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМОГО ПОЛИПЕПТИДНОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ПЕЧЕНИ РЫБ ЛОСОСЕВЫХ ПОРОД 2009
  • Чепкасова Анна Ивановна
  • Аюшин Николай Буданович
  • Ковалев Николай Николаевич
RU2409291C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПЕПТИДОВ, ОБЛАДАЮЩИХ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ 2022
  • Грехнева Елена Владимировна
  • Меркулова Наталья Леонидовна
  • Чуйкова Светлана Владимировна
  • Малышев Владимир Николаевич
  • Ефанов Сергей Анатольевич
RU2809011C1
СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ГЛАЗ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ, ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РЕПАРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ И ЭПИТЕЛИЗАЦИИ 2011
  • Забозлаев Александр Александрович
  • Ковалев Василий Петрович
  • Пация Мераби Георгиевич
RU2470630C1
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ КОМПЛЕКС, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВОАЛЛЕРГИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ 2012
  • Пожарицкая Ольга Николаевна
  • Демченко Дмитрий Валентинович
  • Шиков Александр Николаевич
  • Макарова Марина Николаевна
  • Макаров Валерий Геннадьевич
RU2493861C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТА ИЗ ЦИСТ, ИЛИ НАУПЛИЙ, ИЛИ ВЗРОСЛЫХ ОСОБЕЙ РАЧКА Artemia salina ДЛЯ НАРУЖНОГО ИЛИ ВНУТРЕННЕГО ПРИМЕНЕНИЯ 2008
  • Шишляков Константин Николаевич
  • Иванков Александр Иванович
  • Таранов Анатолий Григорьевич
RU2404786C2
ГЕЛЬ, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫМ, ИММУНОТРОПНЫМ, ПРОТИВОАЛЛЕРГИЧЕСКИМ И РАНОЗАЖИВЛЯЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ 2011
  • Забозлаев Александр Александрович
  • Карлина Марина Валерьевна
  • Макаров Валерий Геннадьевич
  • Макарова Марина Николаевна
  • Пожарицкая Ольга Николаевна
  • Романов Михаил Геннадьевич
  • Шиков Александр Николаевич
RU2457864C1
СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ ЛИПИДОВ (ВАРИАНТЫ), ЭКСТРАКТ ЛИПИДОВ КРИЛЯ И ПОЛНАЯ ЛИПИДНАЯ ФРАКЦИЯ (ВАРИАНТЫ) 1999
  • Бодуан Адриен
  • Мартэн Женевьев
RU2236441C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ЛИПОФИЛЬНОЙ И ГИДРОФИЛЬНОЙ ФРАКЦИЙ ПЛАЦЕНТЫ СВИНОЙ 2003
  • Шабунин С.В.
  • Востроилова Г.А.
  • Мещеряков Н.П.
  • Курило Николай Федорович
  • Конев Владимир Федорович
  • Гребенщиков Виктор Ефимович
  • Бондарь Лариса Александровна
  • Филатов Владимир Антонович
  • Осецкий Александр Иванович
  • Федченко Юрий Григорьевич
  • Осецкая Мария Александровна
  • Лысенко Татьяна Михайловна
RU2237486C1

Реферат патента 2013 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДНОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ПЕЧЕНИ РЫБ ТРЕСКОВЫХ ПОРОД

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к способу получения биологически активного пептидного комплекса из печени рыб семейства Gadidae. Способ включает измельчение исходного сырья, экстракцию смесью масла и воды при соотношении сырье:экстрагент 1:5-1:30 при комнатной температуре в течение 2-4 часов с перемешиванием. Далее проводят очистку целевого продукта путем обработки органическим растворителем в соотношении 1:0,5-2 с последующим разделением и высушиванием водного остатка. В качестве исходного сырья используют печень рыб тресковых пород в свежем, мороженом или сухом виде, а органический растворитель выбирают из ряда диэтиловый эфир, этилацетат, бутанол, хлороформ. Изобретение позволяет получить пептидный комплекс из печени рыб тресковых пород, обладающий сбалансированным аминокислотным составом, повышенным содержанием пептидов и высокой антиоксидантной активностью. 2 з.п. ф-лы, 4 пр.

Формула изобретения RU 2 472 517 C1

1. Способ получения пептидного комплекса из печени рыб тресковых пород, включающий измельчение исходного сырья, экстракцию смесью масла и воды при соотношении сырье: экстрагент 1:5-1:30 при комнатной температуре в течение 2-4 ч с перемешиванием, очистку путем обработки органическим растворителем в соотношении 1:0,5-2 с последующим разделением и высушиванием водного остатка.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что печень рыб тресковых пород используют в качестве сырья в свежем, мороженом или сухом виде.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что органический растворитель выбирают из ряда диэтиловый эфир, этилацетат, бутанол, хлороформ.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2013 года RU2472517C1

КОМПЛЕКСНАЯ ПЕРЕРАБОТКА ПЕЧЕНИ РЫБ СЕМЕЙСТВА ТРЕСКОВЫХ 2009
  • Пожарицкая Ольга Николаевна
  • Демченко Дмитрий Валентинович
  • Шиков Александр Николаевич
  • Макаров Валерий Геннадьевич
  • Фомичев Юрий Сергеевич
RU2420213C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМОГО ПОЛИПЕПТИДНОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ПЕЧЕНИ РЫБ ЛОСОСЕВЫХ ПОРОД 2009
  • Чепкасова Анна Ивановна
  • Аюшин Николай Буданович
  • Ковалев Николай Николаевич
RU2409291C1
US 20090092737 A1, 09.04.2009
US 20110124570 A1, 26.05.2011
US 20110039768 A1, 17.02.2011.

RU 2 472 517 C1

Авторы

Демченко Дмитрий Валентинович

Пожарицкая Ольга Николаевна

Шиков Александр Николаевич

Макаров Валерий Геннадьевич

Фомичев Юрий Сергеевич

Даты

2013-01-20Публикация

2012-02-01Подача