СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПЕПТИДОВ, ОБЛАДАЮЩИХ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2023 года по МПК A23J1/04 A23J3/04 A23J3/32 A23L17/20 

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к способам получения биологически активных добавок (БАД) из отхода рыбоперерабатывающей промышленности, в частности к получению БАД на основе водорастворимых пептидов эпидермальной слизи африканского сома Clarias gariepinus, содержащих все незаменимые аминокислоты и обладающих высокой антиоксидантной активностью.

Применение рыбного сырья, в частности сома Clarias gariepinus, для получения эффективных пептидных препаратов на сегодняшний день недостаточно разработано, несмотря на потенциальную привлекательность данного объекта исследования в связи с ростом производства и расширением возможностей рыбоперерабатывающей промышленности

Африканский сом интересен тем, что это бесчешуйчатая рыба, у которой защитную функцию выполняет эпидермальная слизь. Именно этот факт обуславливает многочисленные жизненно важные свойства слизи. По нашему мнению, пептидный комплекс, выделенный из кожного секрета сома, будет обладать в первую очередь регенерирующим и бактериостатическим действием.

Известен способ получения иммуностимулятора из молок лососевых рыб (патент РФ 2091073,1997), представляющий собой замораживание сырья, измельчение, экстрагирование 3%-ным раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка, центрифугирование, ультра- и диафильтрацию экстракта в растворе 0,9% хлорида натрия с рН 6,0-6,5 через пористый материал с пределом разделения 5000 Да, стерилизацию и лиофильное высушивание.

Известен способ получения иммуностимулятора из ганглий кальмара и каракатицы (патент РФ 2091072, 1997), включающий гомогенизацию сырья в воде, подкисленной уксусной кислотой до рН 3,5-4,5 и содержащей 0,1% хлористого цинка, отделение надосадочной жидкости, стерилизующую фильтрацию через мембранные фильтры с размером пор 0,8; 0,45; 0,22 мкм, концентрирование стерильного фильтрата в 5,5 раз на ультрафильтрационной установке через пористый материал с пределом разделения 1000-5000 Да с последующей очисткой в подщелоченной до рН 9-10 воде, повторное концентрирование на том же пористом материале и стерилизацию, лиофильное высушивание.

Недостатками этих способов являются:

- применение дорогостоящего ультрафильтрационного оборудования;

- отсутствие технологической операции по отделению веществ с молекулярной массой более 10000-15000 Да, что приводит к присутствию в препарате высокомолекулярных примесей, снижающих активность препарата и проявляющих аллергический эффект.

Известен способ получения водорастворимого полипептидного комплекса из печени рыб лососевых пород (Патент РФ №2409291, 2011) включающий экстракцию 5-30-ти кратным избытком дистиллированной воды с последующим подщелачиванием суспензии до рН 8-9 и последующей очисткой жидкой фракции, содержащей целевой продукт, 0,3%-ным раствором хитозана в 3%-ном растворе пищевой органической кислоты при рН 2,5-3,0 в соотношении 1:20 и с последующим инкубированием смеси в течение 2-3 ч, двойным разделением на твердую и жидкую фракции с последующим объединением жидких фракций. Недостатком этого способа является низкий выход целевого продукта и большой объем экстрагента.

Известен способ получения пептидного комплекса из печени рыб тресковых пород (Патент РФ №2472517, 2013), включающий экстракцию 5-20-ти кратным избытком смеси вода-масло, инкубирование, разделение на промышленном сепараторе или проточной центрифуге непрерывного действия, с последующим высушиванием жидкой фракции и очисткой сухого продукта органическим растворителем. Недостатком способа является применение растительного масла для экстракции и органического растворителя для высушивания, что значительно удорожает процесс.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому является способ получения иммуностимулятора пептидной природы из нервной ткани морских гидробионтов и БАД на его основе (Патент РФ №2635625, 2017), включающий экстрагирование сырья 3%-ным раствором уксусной кислоты в течение 35-48 ч с последующим добавлением раствора бикарбоната натрия до рН=8,0-8,5 и 0,3% раствора хитозана в 3% уксусной кислоте, отделение надосадочной жидкости на центрифуге при 5000 об/мин, добавление к фугату сульфата аммония до 30% концентрации раствора и повторное центрифугирование и диафильтрацию фугата. В результате получают раствор конечного вещества с Mw от 1000 до 15000 Да. Недостатком способа является сложность процесса и большое количество химических реагентов.

Технической задачей изобретения является разработка способа получения комплекса водорастворимых пептидов с молекулярной массой от 350 до 9000 Да без примесей высокомолекулярных белков, содержащего все незаменимые аминокислоты и обладающего высокой антиоксидантной активностью, из эпидермальной слизи африканского сома Clarias gariepinus.

Способ заключается в том, что эпидермальную слизь африканского сома Clarias gariepinus, отобранную от свежей или предварительно замороженной рыбы, заливают 3÷4-х кратным объемом 3%-ного масс. раствора уксусной кислоты, содержащего 0,1-0,3% масс. неорганической соли, выбранной из CaCl₂, MgCl_2, FeC1₃, MgSO₄, FeSO₄, подвергают ультразвуковой кавитационной обработке в течение 15-20 мин при температуре +4°С. Экстракцию продолжают от 24 до 48 часов с регулярной кавитационной обработкой в течение 10 мин. каждые 10÷12 часов. По окончании экстракции надосадочную жидкость отделяют центрифугированием и обрабатывают активированным углем, который берут в количестве 0,5% масс. от массы экстракта. Сорбцию ведут в течение 5÷10 часов при температуре +4°С. Отработанный сорбент отделяют фильтрованием или центрифугированием, а полученный прозрачный фильтрат упаривают под вакуумом при температуре +4÷10°С до сокращения его объема вдвое, а затем обрабатывают 1,5÷2-х кратным избытком ацетона и оставляют еще на сутки при температуре +4°С для полного осаждения пептидов. Осадок пептидов выделяют фильтрованием с последующей лиофилизацией. Полученный продукт представляет собой порошок белого цвета хорошо растворимый в воде.

При этом в качестве целевого продукта получают пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной пептидной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 350 до 9000 Да, что достигается описываемой последовательностью технологических операций и условиями их осуществления, включая температурные, временные и технические характеристики, а также использованием предлагаемых реагентов, включая исходное сырье.

В качестве сырья для получения пептидного комплекса была выбрана эпидермальная слизь африканского сома Clarias gariepinus из-за биологической роли кожного секрета в жизнедеятельности рыбы данного вида, а также из-за того, что данная ткань по факту является отходом рыбоперерабатывающего производства. При этом она достаточно легко может быть собрана как с живой, так и с замороженной рыбы и не нуждается в предварительном измельчении перед процессом экстракции.

Выбор в качестве экстрагента растворов ряда солей в уксусной кислоте обусловлен тем, что в процессе технологических операций указанные соединения полностью удаляются и не загрязняют целевой продукт. Приведенные выше соли представляют собой соли биологически значимых металлов и в приведенных концентрациях способствуют осаждению высокомолекулярных белков и балластных веществ, содержащихся в слизи.

Применение в качестве сорбента активированного угля позволяет устранить неприятный запах выделенного экстракта и далее целевого продукта.

Предлагаемая технология мягкого упаривания под вакуумом позволяет значительно сконцентрировать экстракт, что впоследствии приводит к существенному (в 3-5 раз) снижению количества применяемого в качестве осадителя пептидов - ацетона.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлен ИК-спектр комплекса пептидов, на фиг. 2 - 2-D масс-спектрограмма комплекса пептидов, где каждая точка соответствует пептиду в координатах «молекулярная масса» - «время удерживания». Способ осуществляется следующим образом.

Эпидермальную слизь африканского сома Clarias gariepinus, отобранную от свежей или предварительно замороженной рыбы, заливают 3÷4-х кратным объемом 3%-ного масс, раствора уксусной кислоты, содержащего 0,1-0,3% масс, неорганической соли, выбранной из CaCl₂, MgC1₂, FeCl₃, MgSO₄, FeSO₄. Полученный раствор подвергают ультразвуковой кавитационной обработке на ультразвуковом диспергаторе «ULTRASONIK GENERATOR IL10 - 0,63» в течение 15-20 мин при температуре +4°С. Экстракцию продолжают от 24 до 48 часов с регулярной кавитационной обработкой в течение 10 мин. каждые 10÷12 часов. По окончании экстракции надосадочную жидкость отделяют центрифугированием и обрабатывают неорганическим сорбентом, в качестве которого используют активированный уголь, который берут в количестве 0,5% масс. от массы экстракта. Сорбцию ведут в течение 5÷10 часов при температуре +4°С. Отработанный сорбент отделяют фильтрованием или центрифугированием, а полученный прозрачный фильтрат упаривают под вакуумом при температуре +4÷10°С до сокращения его объема вдвое, а затем обрабатывают 1,2÷2-х кратным избытком ацетона и оставляют еще на сутки при температуре +4°С для полного осаждения пептидов. Осадок пептидов выделяют фильтрованием с последующей лиофилизацией на лиофильной сушилке Alpha 1-2 LD plus, производства MartinChrist (Германия).

Пептидная природа выделенного продукта подтверждается методом ИК-спектроскопии с помощью ИК-фурье спектрометра Perkin Elmer Frontier в диапазоне волновых чисел 400-4000 см^-1, с разрешением 1 см_-¹, (сканов-20). ИК-спектры снимают в таблетке с KBr. Находят следующие характеристические полосы поглощения: амид А - ок. 3300, амид В - ок. 3100, амид -1650; амид II - 1537 см^-1. Приведенные полосы однозначно указывают на белковую природу полученного продукта, что дополнительно подтверждается сравнением полученного спектра с библиотечными аналогами.

Хроматографическое исследование пептидных комплексов. Разделение пептидов полученных экстрактов проводят с использованием хроматографической системы Ultimate 3000 RS system (производство Dionex). Исследуемые образцы экстрактов растворяют в воде, содержащей 5% муравьиной кислоты и 5% ацетонитрила, и разделяют на хроматографической колонке HypersilGold (100×1 мм, С18, 3 μm, производство ThermoScientific) со скоростью 0,1 мл/мин. Элюирование пептидов проводят с использованием смеси растворителей «А» (0,1% (об) раствор муравьиной кислоты в деионизированной воде) и «В» (0,1% (об) раствор муравьиной кислоты в 95% (об) растворе ацетонитрила в воде) в следующем режиме: 5% В в течение 10 мин, далее с применением линейного градиента растворителя В (от 5 до 60%) в течение 45 мин с последующей стадией промывки (промывка 10 мин 100% растворителем В) и стадией уравновешивания (промывка 10 мин 5% растворителем В). Полученные серии многозарядных ионов для анализируемых пиков также подтверждают пептидную природу анализируемых веществ. В частности, в исследованных экстрактах обнаруживается «пептидный шум» с диапазоном масс порядка 300-9000 Да

Антиоксидантную активность выделенных комплексов оценивают по их способности ингибировать аутоокисление адреналина in vitro и тем самым предотвращать образование активных форм кислорода (Патент РФ №2144674, 2000).

Определение проводилось на спектрометре УФ/видимой области спектра UV - 1800 (фирмы «Shimadzu») в режиме «Photometric» при длине волны 347 нм в кювете с длинной светопоглощающего слоя 1 см.

В спектрофотометрическую кювету к 2 мл карбонатного буфера, рН 10,65, при комнатной температуре (не ниже 15°С), добавляют 100 мкл 0.1% раствора адреналина (230 мкМ) и определенное количество водного раствора исследуемого пептида. Происходит аутоокисление адреналина, которое регистрируют не по образованию адренохрома, а по ранее появляющемуся продукту окисления адреналина, поглощающему при длине волны 347 нм.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение пептидного комплекса из эпидермальной слизи замороженной рыбы Clarias gariepinus.

1 кг эпидермальной слизи, снятой с замороженной рыбы Clarias gariepinus, заливают 3 кг раствора 3% масс. уксусной кислоты с предварительно растворенными в ней 3 кг хлорида кальция, тщательно перемешивают и полученную смесь обрабатывают на ультразвуковой установке «ULTRASONIK GENERATOR IL10 - 0,63» в течение 15 мин при температуре +4°С. Смесь выдерживают в течение 48 час при температуре +4°С и постоянном перемешивании. Через каждые 10 часов смесь подвергают ультразвуковой обработке в течение 10 мин при температуре +4°С. По окончании экстракции смесь центрифугируют, а к полученному фугату добавляют активированный уголь в количестве 18 г. Сорбцию ведут 5 час при температуре +4°С и постоянном перемешивании. По окончании процесса отработанный уголь также отделяют центрифугированием, а надосадочную жидкость упаривают под вакуумом при температуре +10°С до достижения объема в 1,5 литра. К полученному таким образом концентрату добавляют 2 кг холодного ацетона и оставляют на 24 часа при температуре +4°С для достижения полноты осаждения пептидной фракции. Выпавший осадок пептидной фракции отделяют фильтрованием, а затем подвергают лиофильной сушке. Выход пептидного препарата 31 г (3,1%).

Пример 2. Получение пептидного комплекса из эпидермальной слизи свежей рыбы Clarias gariepinus.

Способ осуществляется как в примере 1. Выход пептидного препарата 21 г (2,1%).

Пример 3. Получение пептидного комплекса из эпидермальной слизи свежей или замороженной рыбы Clarias gariepinus.

Способ осуществляется как в примерах 1 и 2, в качестве раствора экстрагента используют 3% масс, водный раствор уксусной кислоты в количестве 3 кг с предварительно растворенной в ней 3 г одной из следующих солей: MgCl₂, FeCl₃, MgSO₄, FeSO₄ Выходы пептидного препарата составили соответственно: 22 г (2,2%), 19 г (1,9%), 25 г, (2,5%), 28 г (2,8%).

Пример 4. Определение состава пептидного комплекса методом хромато-масс-спектрометрии

Масс-спектрометрический (МС) анализ осуществляют с использованием масс-спектрометра Q-Exactive (ThermoScientific, Германия) с. аэрозольным источником ионов «HESI» с напряжением ионизации 3.5 kV и температурой капилляра 256°С. Предварительное сканирование проводят при разрешении 70000, диапазон сканирования - 200-1500 m/z, целевые значения AGC - 1×10⁶, максимальное время впрыскивания - 50 мс. Фрагментацию пептидных квазимолекулярных ионов в режиме HCD (high-energycollisiondissociation) с последующей регистрацией первичных фрагментов в режиме тандемного сканирования (MS/MS) выполняют для 10 наиболее часто встречающихся ионов при нормированной энергии столкновения - 30, динамическом исключении - 10 с. Сканирование MS/MS образующихся ионов проводят с разрешением 17.500, целевые значения составили 10⁵, максимальное время впрыска - 100 мс, окно изоляции - 2.0. Последовательности пептидов определяют программным обеспечением Proteome Discoverer 1.4 с использованием базы данных аминокислотных последовательностей UniProt. В составе комплекса были найдены пептидные фрагменты различных классов белков протеома Clarias gariepinus: бета-актины, семейство цитохрома, белки теплового шока, миостатин, нейропептид и др., факторы элонгации, Фуши-Таразу и др.

В составе пептидов, обнаруженных в комплексе, были найдены все незаменимые аминокислоты (Phe, Val, Thr, Trp, Met, Leu, He, Lys, His) и условно незаменимые (Arg, Cys, Gly, Gin, Pro, Tyr).

Пример 5. Определение антиоксидантной активности пептидных комплексов.

Определение проводят на спектрометре УФ/видимой области спектра UV - 1800 (фирмы «Shimadzu») в режиме «Photometric» при длине волны 347 нм в кювете с длинной светопоглощающего слоя 1 см.

Для определения антиоксидантной активности готовят 0,1% масс, водные растворы пептидных комплексов. К 2 мл карбонатного буфера с рН=10,65, при комнатной температуре добавляют 100 мкл 0.1% раствора адреналина (230 мкМ) и 5, 10, 15 или 20 мкл раствора пептидного комплекса. Раствор фотометрируют относительно карбонатного буфера в течение 30 мин с интервалом в 30 с. В качестве контрольного используют аналогичный раствор адреналина без добавления раствора пептида.

Антиоксидантную активность (АА) исследуемых пептидных комплексов выражают в процентах ингибирования аутоокисления адреналина и вычисляют по формуле:

где, D1 - оптическая плотность буферированного раствора адреналина, содержащего пептид,

D2 - оптическая плотность контрольного раствора адреналина в буфере.

Антиоксидантная активность пептидных комплексов, выделенных с помощью уксуснокислой экстракции с применением солей CaCl₂, MgCl₂, FeCl₃, MgSO₄, FeSO₄, составляет (в среднем) соответственно: 55, 58, 34, 39, 41%.

Изобретение относится к пищевой промышленности. Предложен способ получения комплекса водорастворимых пептидов путем уксуснокислой экстракции сырья. В качестве сырья используют эпидермальную слизь африканского сома Clarias gariepinus, отобранную от свежей или замороженной рыбы, а в качестве экстрагента - 3÷4-кратный объем 3%-ного масс. раствора уксусной кислоты, содержащий 0,1÷0,3% масс. неорганической соли, выбранной из CaCl₂, MgO₂, FeCl₃, MgSO₄, FeSO₄. Экстракцию ведут в режиме ультразвуковой кавитационной обработки в течение 15÷20 мин при температуре +4°С и продолжают при постоянном перемешивании от 24 до 48 часов с регулярной кавитационной обработкой в течение 10 мин каждые 10÷12 часов, далее надосадочную жидкость отделяют центрифугированием и обрабатывают в течение 5÷10 часов при температуре +4°С неорганическим сорбентом, в качестве которого используют активированный уголь, взятый в количестве 0,5% масс. от массы экстракта. Отработанный сорбент отделяют фильтрованием или центрифугированием, а полученный прозрачный фильтрат упаривают под вакуумом при температуре +4÷10°С до сокращения его объема вдвое и затем обрабатывают 1,2÷2-кратным избытком ацетона и оставляют еще на сутки при температуре +4°С для полного осаждения пептидов. Способ позволяет получить комплекс водорастворимых пептидов с молекулярной массой от 350 до 9000 Да без примесей высокомолекулярных белков, содержащий все незаменимые аминокислоты и обладающий высокой антиоксидантной активностью, из эпидермальной слизи африканского сома Clarias gariepinus. 2 ил., 5 пр.

Способ получения комплекса водорастворимых пептидов путем уксуснокислой экстракции сырья, отличающийся тем, что в качестве сырья используют эпидермальную слизь африканского сома Clarias gariepinus, отборанную от свежей или замороженной рыбы, а в качестве экстрагента - 3÷4-кратный объем 3%-ного масс. раствора уксусной кислоты, содержащий 0,1÷0,3% масс. неорганической соли, выбранной из СаСl₂, MgCl₂, FeCl₃, MgSO₄, FeSO₄, при этом экстракцию ведут в режиме ультразвуковой кавитационной обработки в течение 15÷20 мин при температуре +4°С и продолжают при постоянном перемешивании от 24 до 48 часов с регулярной кавитационной обработкой в течение 10 мин каждые 10÷12 часов, далее надосадочную жидкость отделяют центрифугированием и обрабатывают в течение 5÷10 часов при температуре +4°С неорганическим сорбентом, в качестве которого используют активированный уголь, взятый в количестве 0,5% масс. от массы экстракта, после чего отработанный сорбент отделяют фильтрованием или центрифугированием, а полученный прозрачный фильтрат упаривают под вакуумом при температуре +4÷10°С до сокращения его объема вдвое и затем обрабатывают 1,2÷2-кратным избытком ацетона и оставляют еще на сутки при температуре +4°С для полного осаждения водорастворимых пептидов с молекулярной массой от 350 до 9000 Да.