АНАЛИЗ ИММУНОДЕТЕКЦИИ КОМПЛЕКСА MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Российский патент 2013 года по МПК G01N33/569 G01N33/533 G01N33/543 

Настоящее изобретение относится к методу иммунодетекции с использованием антитела против специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка MPB64, и более конкретно, относится к сэндвич-иммуноанализу, и в частности, к иммунохроматографическому анализу и к иммунохроматографической тест-полоске. Настоящее изобретение относится к способу детекции, который можно использовать для быстрой, безопасной и высокоточной диагностики инфекции комплексом Mycobacterium tuberculosis посредством специфической детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis с высокой чувствительностью.

Уровень техники

MPB64 представляет собой белок микобактерий, продуцируемый Mycobacterium bovis BCG и секретируемый из бактериальных клеток. Известно также, что MPT64 является одним из белков микобактерий, специфически продуцируемых Mycobacterium tuberculosis и секретируемых из бактериальных клеток. Известно, что вещество MPT64 аналогично веществу МРВ64. Это означает, что антитело против MPB64 также является антителом против MPT64.

Таким образом, инфекцию комплексом Mycobacterium tuberculosis можно диагностировать, культивируя патогенетически безопасный Mycobacterium bovis BCG, выделяя и очищая MPB64, продуцированный в культуре, получая анти-MPB64 антитела с использованием MPB64 в качестве антигена и детектируя MPT64 в образце с помощью реакции антиген-антитело (иммунной реакции) с использованием этого антитела.

Способ детекции Mycobacterium tuberculosis иммунологическим методом с использованием антитела против MPB64 (далее в этом документе обозначает как «анти-MPB64 антитело») уже известен (см. Патентный документ 1). Кроме того, анализ с использованием иммунохроматографии также уже известен в качестве иммунологического способа (см. Патентный документ 2).

Однако для этих известных способов необходим комплекс Mycobacterium tuberculosis в образце для выращивания культивированием для секреции MPT64 перед тем, как подвергнуть его иммуноанализу, и культивирование занимает приблизительно неделю.

Кроме того, даже несмотря на то, что общепринятые иммунохроматографические способы не обладают реактивностью для большинства нетуберкулезных микобактерий (NTB), но обладают очень сильной реактивностью для комплекса Mycobacterium tuberculosis, опубликовано, что они еще обладают перекрестной реактивностью с двумя штаммами нетуберкулезных микобактерий, т.е. Mycobacterium marinum и Mycobacterium flavescens (непатентный документ 1).

Патентный документ 1: Japanese Patent Laid-open № Н07-110332

Патентный документ 2: Japanese Patent Laid-open № H11-108931

Непатентный документ 1: ABE C. et al., «Simple and Rapid Identification of the Mycobacterium tuberculosis Complex by Immunochromatographic Assay Using Anti-MPB64 Monoclonal Antibodies», Journal of Clinical Microbiology, Nov. 1999, pp.3693-3697.

Описание

Проблемы, решаемые настоящим изобретением

Целью настоящего изобретения является специфическая детекция антигена MPT64 в биологическом образце для возможности проведения диагностики инфекции комплексом Mycobacterium tuberculosis с большей точностью, чем ранее.

Кроме того, другой целью настоящего изобретения является детекция антигена MPT64 в биологическом образце с высокой чувствительностью для возможности подвергать биологический образец иммуноанализу без культивирования или после культивирования в течение времени до того, как бактерии комплекса Mycobacterium tuberculosis в образце начнут существенно расти, и иметь возможность проводить диагностику инфекции комплексом Mycobacterium tuberculosis более быстро и безопасно, чем ранее.

Средства для решения проблемы

Авторы настоящего изобретения успешно получили антитело к специфическому эпитопу MPB64 посредством иммунизации мышей MPB64 в качестве иммуногена и обнаружили, что комплекс Mycobacterium tuberculosis можно детектировать более специфически с большей чувствительностью, чем ранее, благодаря использованию вышеупомянутого антитела в иммуноанализе, в частности, в сэндвич-иммуноанализе, и конкретно, в иммунохроматографическом анализе. Таким образом, было осуществлено настоящее изобретение.

То есть, в одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, включающему иммуноанализ с использованием антитела против специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка MPB64, в котором указанное антитело включает антитело против эпитопа MPB64, локализованного в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-4.

Иммуноанализ, используемый в этом способе детекции, конкретно не ограничен, однако, сэндвич-иммуноанализ, в частности, способ ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), иммунохроматографический анализ, и тому подобное, являются предпочтительными.

Таким образом в другом аспекте изобретение относится к способу детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, включающему сэндвич-иммуноанализ с использованием первых и вторых антител против специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка MPB64, в котором по меньшей мере одно из первого антитела и вторых антител включает антитело против эпитопа MPB64, локализованного в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:2-4.

Кроме того, предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к иммунохроматографическому анализу детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, включающему:

наличие мембранного носителя, обладающего зоной связывания, сформированной в его заранее определенном положении посредством иммобилизации первого антитела против специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка MPB64; и

хроматографическое проявление смешанным раствором, содержащим второе антитело против MPB64 и заранее определенное количество тестируемого образца на мембранном носителе в зоне связывания,

в результате чего комплекс антигена, содержащегося в тестируемом образце, и второго антитела связывается в зоне связывания, и где по меньшей мере одно из первого и второго антител включает антитело против эпитопа MPB64, локализованного в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:2-4.

Кроме того, предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к иммунохроматографической тест-полоске для детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, которая по меньшей мере содержит первое и второе антитела против специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка MPB64 и мембранный носитель, где первое антитело предварительно иммобилизовано на мембранном носителе, так что формирует зону связывания, и второе антитело мечено подходящим средством для мечения и подготовлено в положении, удаленном от зоны связывания, для хроматографического проявления на мембранном носителе, где по меньшей мере одно из первого и второго антител включает антитело против эпитопа MPB64, локализованного в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:2-4.

Антитело против MPB64, которое обязательно используют по настоящему изобретению, представляет собой антитело против эпитопа для MPB64, локализованного в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:2-4, и может представлять собой поликлональное антитело, моноклональное антитело, и, предпочтительно, представляет собой моноклональное антитело с точки зрения специфичности реакции. При этом аминокислотные последовательности SEQ ID NO:2-4 составляют часть полной аминокислотной последовательности MPB64, представленной как SEQ ID NO:1, и представляют собой области, содержащие эпитопы MPB64.

В случае сэндвич-иммуноанализа, такого как иммунохроматографический анализ, соответствующие первые и вторые антитела, используемые по настоящему изобретению, могут являться поликлональными или моноклональными, и, как правило, предпочтительно, по меньшей мере одно из двух антител является моноклональным, и особенно предпочтительно, оба антитела являются моноклональными, с точки зрения специфичности реакции. Также поскольку MPB64 является мономерным белком, предпочтительно, первое и второе антитела представляют собой антитела к различным эпитопам MPB64.

Антитело, используемое по настоящему изобретению, представляет собой антитело против эпитопа, локализованного в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:2-4, содержащихся в полной аминокислотной последовательности MPB64, представленной как SEQ ID NO:1, и таким образом, специфически распознает MPB64 или MPT64. Также, эти антитела по настоящему изобретению не распознают нетуберкулезные микобактерии (NTB), и, кроме того, не распознают Mycobacterium marinum и Mycobacterium flavascens, и, таким образом, обладают отличной специфичностью. Аминокислотные последовательности из SEQ ID NO:2-4 представляют собой области, содержащие эпитопы MPB64. Другими словами, антитело, используемое по настоящему изобретению, может представлять собой антитело, вступающее в реакцию антиген-антитело с фрагментом MPB64, обладающим 12-15 аминокислотными остатками, включающими одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:2-4.

Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, распознающему эпитоп MPB64, локализованный в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:2-4.

Эффект изобретения

В соответствии с настоящим изобретением антитело против эпитопа, локализованного в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:2-4, содержащихся в полной аминокислотной последовательности MPB64, представленной как SEQ ID NO:1, используют в способе детекции с помощью иммуноанализа, и таким образом, диагностику инфекции комплексом Mycobacterium tuberculosis можно проводить с большей точностью, чем ранее, а также биологический образец можно подвергать иммуноанализу как есть, без культивирования или после культивирования в течение времени до того, как бактерии комплекса Mycobacterium tuberculosis в образце начнут существенно расти, так что диагностику инфекции комплексом Mycobacterium tuberculosis можно проводить более быстро и безопасно, чем ранее.

Кроме того, в соответствии с иммунохроматографическим анализом и иммунохроматографической тест-полоской по настоящему изобретению, диагностику инфекции комплексом Mycobacterium tuberculosis можно проводить быстро и безопасно, с большей точностью, чем ранее, без необходимости в специальных устройствах и требующих высокой квалификации способах, и риск вторичной инфекции уменьшен.

Наилучший способ осуществления изобретения

В соответствии с настоящим изобретением получение антитела и каждую стадию способа детекции и анализа с использованием антитела, соответственно, проводят в соответствии с известными иммунологическими способами.

По настоящему изобретению, поликлональное антитело можно получать, например, клонированием фрагмента ДНК, соответствующего аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2-4 последовательности ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:1, обеспечением экспрессии клонированного гена в хозяине, таком как Escherichia coli, способом генной инженерии и очисткой экспрессированного белка, и иммунизацией животного с помощью очищенного белка, используемого в качестве антигена согласно обычному способу, и получением затем поликлонального антитела из антисыворотки иммунизированного животного.

В соответствии с настоящим изобретением моноклональное антитело можно получать, например, иммунизацией животного, такого как мышь, вышеуказанным очищенным белком, используемым в качестве антигена, слиянием клеток селезенки иммунизированного животного с клетками миеломы для получения слитых клеток, отбором слитых таким образом клеток в содержащей HAT среде и обеспечением их роста, и затем отбором выросших штаммов с использованием вышеуказанного очищенного белка посредством иммуноанализа с ферментативной меткой или тому подобное.

Альтернативно, моноклональное антитело можно получать, например, иммунизацией животного, такого как мышь, с помощью MPB64, очищенного из культурального супернатанта Mycobacterium bovis BCG, используемого в качестве антигена, слиянием клеток селезенки иммунизированного животного с клетками миеломы для получения слитых клеток, отбором слитых таким образом клеток в содержащей HAT среде и обеспечением их роста, и затем отбором штамма, распознающего полипептид SEQ ID NO:2-4, из выросших штаммов.

Иммунохроматографический анализ по настоящему изобретению для детекции присутствия комплекса Mycobacterium tuberculosis в тестируемом образце можно проводить просто в соответствии с конструкцией известной иммунохроматографической тест-полоски.

Как правило, такая иммунохроматографическая тест-полоска состоит по меньшей мере из первого антитела, способного вступать в реакцию антитело-антиген с первой антигенной детерминантой антигена, второго антитела, которое является меченым и способным вступать в реакцию антитело-антиген со второй антигенной детерминантой антигена, и мембранного носителя, где первое антитело предварительно иммобилизовано в заранее определенном положении на носителе, так чтобы сформировать зону связывания, и второе антитело подготовлено в положении, удаленном от зоны связывания, для хроматографического проявления на мембранном носителе. Каждое из вышеупомянутых первого и второго антител может представлять собой либо поликлональное антитело, либо моноклональное антитело, но предпочтительным является, чтобы по меньшей мере одно из них представляло собой моноклональное антитело. Поскольку MPB64 является мономерным белком, первое и второе антитела используют в сочетании «гетеро», то есть первое и второе антитела, распознающие соответствующие антигенные детерминанты, отличающиеся как по положению, так и по структуре антигена, используют в сочетании. Например, когда моноклональное антитело против эпитопа MPB64, локализованного в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, используют в качестве первого антитела, моноклональное антитело против эпитопа MPB64 локализованного в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3 или 4, используют в качестве второго антитела.

В качестве конкретного примера иммунохроматографической тест-полоски можно упомянуть, например, тест-полоску, как показано на фиг.1. На фиг.1 цифра 1 обозначает адгезивный лист, 2 обозначает пропитанную часть, 3 обозначает мембранный носитель, 31 обозначает зону связывания, 4 обозначает абсорбирующую часть, и 5 обозначает часть для введения образца.

В примере, показанном на фигуре, мембранный носитель 3 состоит из удлиненного фильтра из нитроцеллюлозной мембраны в форме полоски, имеющей ширину 5 мм и длину 36 мм.

Мембранный носитель 3 содержит первое антитело, иммобилизованное в положении 7,5 мм от конца на стороне старта хроматографического проявления, так чтобы сформировать зону связывания аналита 31.

В примере, показанном на фигуре, фильтр из нитроцеллюлозной мембраны используют в качестве мембранного носителя 3. Однако любой тип мембранного носителя можно применять по настоящему изобретению, при условии, что он способен хроматографически проявлять аналит, содержащийся в тестируемом образце, и иммобилизовать антитело, формирующее зону связывания 31. Таким образом, другие типы целлюлозных мембран, нейлоновых мембран, мембран из стекловолокна, или тому подобное, также можно использовать.

Пропитанная часть 2 представляет собой часть, в которой второе антитело, способное вступать в реакцию антитело-антиген с антигеном на второй антигенной детерминанте, расположенной в участке, отличном от первой антигенной детерминанты, с которой связывается первое антитело, закреплено посредством пропитывания или тому подобное. Второе антитело является предварительно меченным подходящим средством для мечения.

В примере, как показано на фигуре, нетканый материал из стекловолокна в форме полоски, имеющей размер 5 мм × 15 мм, используют в качестве пропитанной части 2. Однако пропитанная часть 2 не является ограниченной этим, а включает, например, целлюлозный материал (фильтр, нитроцеллюлозную мембрану и т.д.), пористые ткани из синтетического волокна, такого как полиэтилен и полипропилен, и другие.

В качестве средства для мечения, которым метят второе антитело, можно использовать любое вещество, при условии, что оно применимо по настоящему изобретению. Примеры такого средства для мечения включают окрашивающее средство для мечения, ферментативное средство для мечения и радиоактивное средство для мечения.

Из них предпочтительно используют окрашивающее средство для мечения, поскольку наблюдение изменения окраски в зоне связывания 31 невооруженным глазом позволяет быстрое и простое определение. Также, с точки зрения улучшения чувствительности, является предпочтительным, чтобы исследование зоны связывания 31 можно было проводить с использованием флуоресцентного иммунохроматографического считывателя с помощью флуоресцентного средства для мечения.

Примеры такого окрашивающего средства для мечения включают коллоидные частицы металлов, такие как коллоидные частицы золота, коллоидные частицы платины и коллоидные частицы комплекса платина-золото, частицы синтетического латекса, такие как полистирольный латекс, окрашенный красным или синим пигментом, и частицы латекса, такие как латекс натурального каучука. Из них коллоидные частицы металлов, такие как коллоидные частицы золота, являются особенно предпочтительными.

Примеры флуоресцентного средства для мечения включают средства для прямого мечения, такие как FITC и родамин, так же как флуоресцентные латексные частицы, содержащие флуоресцентное соединение, и такое соединение, как квантовая точка. Из них флуоресцентная латексная частица, содержащая флуоресцентное соединение, является предпочтительной. Также, длина волны возбуждения и длина волны флуоресценции флуоресцентного соединения не являются конкретно ограниченными, однако, флуоресцентное соединение с большим так называемым сдвигом Стокса, для которого длина волны возбуждения находится далеко от измеряемой длины волны, предпочтительно используют с точки зрения установки измерительного прибора.

Пропитанную часть 2 можно получать абсорбцией суспензии меченого второго антитела на этой части, такой как вышеупомянутый нетканый материал из стекловолокна, и затем ее высушиванием.

Как показано на фиг.1, иммунохроматографическую тест-полоску по настоящему изобретению можно получать следующим образом. Мембранный носитель 3 прикрепляют в середине адгезивного листа 1. На конце на стороне старта хроматографического проявления (то есть на левой стороне на фиг.1, которую далее в настоящем документе обозначают «верхняя сторона», тогда как противоположную сторону, то есть правую сторону на фиг.1 в настоящем документе обозначают «нижняя сторона») мембранного носителя 3, располагают конец нижней стороны пропитанной части 2, так чтобы они соединялись. Зону верхней стороны пропитанной части 2 прикрепляют к адгезивному листу 1.

Более того, если необходимо, зону нижней стороны части для введения образца 5 можно помещать на верхнюю поверхность пропитанной части 2, в то время как зону верхней стороны части для введения образца 5 также можно прикреплять к адгезивному листу 1. Более того, зону верхней стороны адсорбирующей части 4 можно помещать на верхнюю поверхность зоны нижней стороны мембранного носителя, в то время как зону нижней стороны адсорбирующей части можно прикреплять к адгезивному листу 1.

В качестве части для введения образца 5, можно использовать, например, лист или пленку из синтетической смолы, такой как пористый полиэтилен и пористый полипропилен, или целлюлозную бумагу или тканый или нетканый материал, такой как фильтр и хлопковый материал.

Адсорбирующую часть 4 можно изготавливать из любого материала, при условии, что он является способным быстро абсорбировать и задерживать жидкости. Примеры такого материала включают хлопковые материалы, фильтровальную бумагу и нетканые материалы из пористого пластика, изготовленные из полиэтилена, полипропилена и т.д. В частности, фильтровальная бумага является оптимальной.

Кроме того, в случае коммерчески доступных продуктов, иммунохроматографическую тест-полоску, как показано на фиг.1, поставляют так, что тест-полоска помещена в подходящий пластиковый футляр, обладающий зоной для ввода образца и зоной для определения, открытыми над частью для введения образца 5 и зоной захвата 31, соответственно.

Таким образом, тестируемый образец, содержащий биологический образец или тому подобное, при необходимости, смешивают с подходящим проявляющим растворителем, так чтобы получить смешанный раствор, который можно проявлять хроматографически. После этого смешанный раствор вводят на часть для введения образца 5 иммунохроматографической тест-полоски, как показано на фиг.1, так что он проходит через часть для введения образца 5 и смешивается с меченым вторым антителом на пропитанной части 2.

В этом случае, если аналит существует в вышеупомянутом смешанном растворе, комплекс аналита и второго антитела формируется в результате реакции антиген-антитело.

Этот комплекс проявляется хроматографически на мембранном носителе 3, и затем достигает зоны связывания 31. Таким образом, комплекс связывается с первым антителом, иммобилизованным там, в результате реакции антиген-антитело.

В этом случае, если окрашивающее средство для мечения, такое как коллоидные частицы золота, используют в качестве средства для мечения, аналит можно немедленно определять качественно или количественно на основании окрашивания, вызванного накоплением окрашивающего средства для мечения в зоне связывания 31. Когда флуоресцентное средство для мечения используют в качестве средства для мечения, количество флуоресценции флуоресцентного средства, накопленного в зоне связывания 31, считывают посредством измерительного устройства, так что это можно измерять количественно.

При этом, по настоящему изобретению, можно подготавливать второе антитело для хроматографического проявления на мембранном носителе посредством сохранения второго антитела или пропитанной части, содержащей второе антитело, в подходящем контейнере, так чтобы вводить на мембранный носитель после смешивания тестируемого образца и второго антитела в контейнере вместо расположения второго антитела или пропитанной части на мембранном носителе.

Биологический образец, используемый для получения тестируемого образца, не является конкретно ограниченным, но включает, например, жидкость организма, собранную из живого организма, такую как мокрота, плевральный выпот, секрет бронхов, желудочный сок, кровь, спинномозговая жидкость, моча и фекалии, и предпочтительно используют мокроту. А также, бронхиальные смывы, собранные при проведении исследования органов дыхания, и фрагменты тканей, собранные из бронхов или легкого, можно использовать в качестве биологического образца. Кроме того, можно применять культуру и бактерии, полученные культивированием биологического образца, собранного выше, в твердой среде для культивирования или в жидкой среде для культивирования. Более того, можно применять культуру, в которой биологический образец культивируют в течение времени до того, как бактерии комплекса Mycobacterium tuberculosis в образце начнут существенно расти, и в этом случае небольшое количество жидкой культуральной среды предпочтительно используют в качестве культуральной среды. Биологический образец можно использовать в качестве тестируемого образца как есть, однако, можно разводить его в подходящем разбавителе, таком как проявляющий растворитель, для получения тестируемого образца.

Культивирование биологического образца можно осуществлять обычным способом как в жидкой культуре, так и в твердой культуре, причем жидкая культура является предпочтительной, поскольку культуру (то есть раствор культуры) можно подвергать различным иммуноанализам, таким как иммунохроматографический анализ.

Жидкая культуральная среда, используемая для жидкой культуры, конкретно не ограничена, при условии, что в ней можно культивировать вышеуказанный биологический образец, и например, можно использовать культуральную среду, описанную в Guideline for Mycobacterium Examination. Конкретные примеры включают среду Миддлбрука 7H9, жидкую среду Дюбо (продукт 20 Becton, Dickinson and Company), MGIT (продукт Becton, Dickinson and Company) и BactAlert (продукт bioMérieux).

Твердая культуральная среда для твердой культуры конкретно не ограничена, при условии, что на ней можно культивировать вышеуказанный биологический образец, и например, можно использовать культуральную среду, описанную в Guideline for Mycobacterium Examination. Конкретные примеры включают среду Огава и косяки среды Кудо PD в пробирке (продукт Kyowa Pharmaceutical CO., Ltd.). Культуру, полученную при культивировании на твердой среде, можно использовать для иммунологического анализа посредством разведения разбавителем, таким как физиологический солевой раствор и фосфатный буфер.

Температура инкубации предпочтительно составляет приблизительно 37°С как для жидкой культуры, так и для твердой культуры. Время инкубации может представлять собой время, достаточное для секреции поддающегося детекции количества специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка, который используют в качестве маркера Mycobacterium tuberculosis, и обычно составляет 2-10 суток и предпочтительно 2-7 суток.

Культивирование в жидкой культуре можно проводить, например, помещением 100 мкл - 5 мл жидкой культуральной среды в культуральный флакон 1 мл - 10 мл, и аэробным встряхиванием ее в течение вышеуказанного периода времени инкубации.

Кроме того, биологический образец и культуру можно подвергать предварительной обработке подходящим способом перед тем, как подвергать тестированию, чтобы подавить денатурацию специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка и привести его в состояние, подходящее для иммуноанализа. Предварительная обработка включает, например, обработку инактивацией или диспергированием, или обработку солюбилизацией комплекса Mycobacterium tuberculosis.

Обработка инактивацией комплекса Mycobacterium tuberculosis включает, например, обработку нагреванием и обработку фильтрацией, и предпочтительно, обработку нагреванием. Температура нагревания конкретно не ограничена, но обычно составляет 50°C-140°C и предпочтительно, 100°C. Время нагревания также конкретно не ограничено, однако обычно составляет 1-60 минут и предпочтительно, 15-30 минут. Обработку нагреванием можно проводить подверганием целого флакона, содержащего биологический образец, обработке автоклавированием. Обработка инактивацией Mycobacterium tuberculosis обеспечивает возможность проводить обследование без использования ламинарного шкафа.

Обработку солюбилизацией проводят в основном с целью снижения вязкости биологического образца, такого как мокрота, и например, ее проводят добавлением к биологическому образцу реагента, способного солюбилизировать составляющее биологического образца. Такой реагент включает, например, щелочное вещество, восстанавливающее вещество, протеазу и поверхностно-активное вещество и предпочтительно, щелочное вещество, восстанавливающее вещество и протеазу.

Щелочное вещество включает гидроксид натрия, и его концентрация конкретно не ограничена, но с точки зрения денатурации специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка, его предпочтительно используют в концентрации 0,5н - 2н.

Восстанавливающее вещество включает, например, N-ацетил-L-цистеин (NALC) и дитиотреитол, и его концентрация конкретно не ограничена, но его предпочтительно используют при 0,05%-1%. Является более эффективным также использовать щелочное вещество и восстанавливающее вещество в сочетании.

Протеаза включает, например, полущелочную протеазу (наименование продукта: SPUTAZYME, изготовленный KYOKUTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO., LTD.).

Обработка диспергированием включает известные способы физической обработки, например, операцию перемешивания с использованием встряхивающей мешалки или тому подобное, предпочтительно, перемешивание с использованием встряхивающей мешалки или тому подобное с добавлением стеклянных бусин к биологическому образцу.

Обработку диспергированием и обработку солюбилизацией можно проводить отдельно или в сочетании.

Когда цельную кровь используют в качестве тестируемого образца, является предпочтительным, чтобы связывающую гематоциты мембранную часть размещали в вышеупомянутой части для введения образца, если окрашивающее средство для мечения, такое как коллоидные частицы золота, конкретно используют в качестве средства для мечения для меченого антитела. Такую связывающую гематоциты мембранную часть предпочтительно наслаивают между вышеупомянутой пропитанной частью и вышеупомянутой частью для введения образца. Это ингибирует проявление эритроцитов на мембранном носителе, и таким образом, облегчает подтверждение накопления окрашивающих средств для мечения в зоне связывания мембранного носителя. В качестве такой связывающей гематоциты мембранной части используют карбоксиметилцеллюлозную мембрану. Конкретно, можно использовать ионообменный фильтр CM (торговое наименование), доступный из Advantec Toyo K.K., ионообменную целлюлозную бумагу, доступную из Whatman Japan К.К., и т.д.

Пример

Настоящее изобретение более конкретно описано в следующих примерах. Однако эти примеры не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

Пример 1

Получение моноклонального анти-MPB64 антитела

MPB64 очищали из культурального супернатанта, который получали культивированием Mycobacterium bovis BCG штамма Токио в среде Миддлбрука 7H11. Моноклональные антитела против белка получали с использованием полученного MPB64 в качестве антигена. Такие моноклональные антитела получали обычным способом.

То есть, 100 мкг очищенного MPB64 смешивали с таким же количеством полного адъюванта Фрейнда (Difco). Затем мышь (BALB/c, в возрасте 5 недель, Japan SLC, Inc.) иммунизировали смесью 3 раза, и клетки ее селезенки затем использовали для слияния клеток. Для такого слияния клеток использовали клетки Sp2/0-Ag14 (Shulman et al., 1978), которые представляли собой клетки миеломы мыши.

Полученные слитые клетки выращивали после отбора на содержащей HAT среде, и наконец, 3 клона клеток, продуцирующих моноклональное антитело, разпознающее MPB64, получили из выращенных слитых клеток. Далее в настоящем документе антитела, полученные из соответствующих клонов, обозначены как моноклональные антитела TB001, TB002 и TB003.

Пример 2

Анализ эпитопов анти-MPB64 антитела

Всего пептидным синтезом SPOT получили 73 полипептида, каждый из которых состоял из единицы из 12 аминокислот со сдвигом рамки на 3 аминокислоты от N-конца аминокислотной последовательности MPB64 из SEQ ID NO:1, полученной из Mycobacterium tuberculosis штамма H37RV. При этом каждую аминокислотную последовательность выбирали так, чтобы не выбирать пролин в качестве начальной аминокислоты из-за пептидного синтеза SPOT. Затем получали лист SPOT (изготовленный JST и Sigma Aldrich), на котором вышеупомянутые 73 полипептида иммобилизованы на целлюлозной мембране. Лист SPOT инкубировали на качающейся платформе в течение 2 часов, и затем в течение часа с блокирующим буфером (50 мМ Трис HCl, 140 мМ NaCl, 5 мМ NaEDTA, 0,05% NP40 (Fluka), 0,25% желатин (Sigma), 1% бычий сывороточный альбумин (Sigma), pH 7,4), содержащим 2 мкг/мл моноклональных антител, полученных в примере 1, для инкубации и реакции. После завершения реакции лист SPOT промывали PBS (10 мМ фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, pH 7,5) три раза по 3 минуты на качающейся платформе. К этому добавляли меченное HRP антитело против иммуноглобулина мыши в разведении 1:1000 и реакционную смесь инкубировали в течение часа. Это промывали PBS (10 мМ фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, pH 7,5) три раза по 3 минуты. Затем то, что получилось в результате, погружали в раствор, содержащий окрашивающий субстрат TMBZ, чтобы вызвать окрашивание. Окрашенные пятна идентифицировали визуально, чтобы определить полипептидные последовательности, распознаваемые антителами. При этом вышеупомянутые 73 полипептида обозначали как полипептид NO: 1-73 по порядку от N-конца.

Для моноклонального антитела ТВ001 идентифицировали окрашивание на полипептидах NO: 22-25. По окрашенным пятнам подтвердили, что оно распознает последовательность IAQTRDKFL (SEQ ID NO: 2), соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 между остатками 70 и 78 от N-конца.

Для моноклонального антитела ТВ002 идентифицировали окрашивание на полипептидах NO: 32-35. По окрашенным пятнам подтвердили, что оно распознает последовательность AIPPRGTQAVVL (SEQ ID NO: 3), соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 между остатками 103 и 114 от N-конца.

Для моноклонального антитела ТВ003 идентифицировали окрашивание на полипептидах NO: 59-64. По окрашенным пятнам подтвердили, что оно распознает последовательность PVNYQNFAV (SEQ ID NO: 4), соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 между остатками 184 и 192 от N-конца.

Пример 3

Получение иммунохроматографического набора с использованием антитела типа анти-МРВ64

(1) Получение анти-МРВ64 антитела

Каждый клон, полученный в примере 1, инокулировали в брюшную полость мыши для получения асцитов, содержащих анти-MPB64 антитело. Далее, очистку IgG проводили согласно обычному способу с использованием адсорбента с белком G для получения анти-MPB64 антитела.

(2) Получение раствора коллоидных частиц золота

1 мл 1% (масс./об.) водного раствора золотохлористоводородной кислоты добавляли к 99 мл особо чистой воды, доведенной до кипения нагреванием. Через одну минуту к этому дополнительно добавляли 1,5 мл 1% (масс./об.) водного раствора цитрата натрия, и смесь нагревали и кипятили в течение 5 минут. Затем раствор оставляли при комнатной температуре, так чтобы он охладился. Затем к раствору добавляли раствор 200 мМ карбоната калия, так чтобы довести pH до 9,0. Затем к этому добавляли особо чистую воду для доведения общего количества до 100 мл, таким образом получая раствор коллоидных частиц золота.

(3) Получение раствора анти-MPB64 антитела, меченного коллоидными частицами золота

Анти-MPB64 антитело, полученное выше в (1), метили коллоидными частицами золота посредством следующих процедур.

1 мкг, эквивалентный массе по белку анти-MPB64 антитела (далее в настоящем документе, когда показана масса по белку антитела, она просто показана как величина массы, полученная гравиметрическим анализом его очищенного белка), смешивали с 1 мл раствора коллоидных частиц золота, описанного выше в (2), и затем смесь оставляли в состоянии покоя при комнатной температуре на 2 минуты, так что всем антителам позволяли связываться с поверхностью коллоидных частиц золота. Затем 10% водный раствор бычьего сывороточного альбумина (далее в настоящем документе обозначенного как «BSA») добавляли к раствору коллоидных частиц золота для доведения конечной концентрации до 1%, и остаток поверхности коллоидных частиц золота весь блокировали BSA для получения раствора меченного коллоидными частицами золота анти-МРВ64 антитела (далее в настоящем документе обозначенного как «меченное коллоидными частицами золота антитело»). Этот раствор центрифугировали (5600×G, 30 минут) для преципитации меченного коллоидными частицами золота антитела. Раствор супернатанта удаляли для получения меченного коллоидными частицами золота антитела. Это меченное коллоидными частицами золота антитело суспендировали в 50 мМ Трис-HCl буфере (pH 7, 4), содержащем 10% сахарозу, 1% BSA и 0,5% Triton-X100, для получения раствора меченного коллоидными частицами золота антитела.

(4) Получение иммунохроматографической тест-полоски для анализа МРВ64

Иммунохроматографическую тест-полоску, показанную на фиг.1, получали посредством следующих процедур.

(4-1) Зона связывания комплекса МРВ64 и меченного коллоидными частицами золота антитела

Удлиненную нитроцеллюлозную мембрану в форме полоски размером 5 мм в ширину и 36 мм в длину подготавливали в качестве мембранного носителя 3 для хроматографического проявления хроматографической среды.

0,5 мкл раствора, содержащего 1,0 мг/мл анти-МРВ64 антитела, наносили в форме полоски в положении 7,5 мм от конца со стороны точки начала хроматографического проявления мембранного носителя 3 для хроматографического проявления. Его сушили при комнатной температуре для формирования зоны связывания 31 для связывания комплекса белка MPB64 и меченного коллоидными частицами золота антитела. Моноклональное антитело TB003 использовали в качестве анти-MPB64 антитела.

(4-2) Получение пропитанной части, пропитанной меченным коллоидными частицами золота антителом.

Нетканый материал из стекловолокна в форме полоски размером 5 мм × 15 мм пропитывали 37,5 мкл раствора меченного коллоидными частицами золота антитела, и затем сушили при комнатной температуре для получения пропитанной меченным коллоидными частицами золота антителом части 2. Моноклональные антитела TB001 и TB002, меченные коллоидными частицами золота, использовали в качестве меченного коллоидными частицами золота антитела.

(4-3) Получение иммунохроматографической тест-полоски

В дополнение к вышеупомянутому мембранному носителю 3 для хроматографического проявления и вышеупомянутой пропитанной части 2, содержащей меченое антитело, подготавливали хлопковый материал в качестве части для введения образца 5 и фильтровальную бумагу в качестве абсорбирующей части 4. Затем хроматографическую тест-полоску, которая являлась такой же, как на фиг.1, получали с использованием этих частей.

Пример 4

(Сравнение чувствительности с CAPILIA ТВ (торговое наименование; изготовленной в TAUNS LABORATORIES INC.))

Предоставляли иммунохроматографическую тест-полоску, полученную в примере 3 (в которой моноклональное антитело TB003 использовали в качестве анти-MPB64 антитела, иммобилизованного в зоне связывания, и моноклональное антитело TB001 использовали в качестве анти-MPB64 антитела как меченного коллоидными частицами золота антитела).

Штамм Mycobacterium bovis BCG Токио культивировали на среде Миддлбрука 7H11, и полученный культуральный супернатант (соответствующий № 1 по стандарту Макфарланда, концентрация 1,1×10⁸ КОЕ/мл) разводили разбавителем для образцов для получения тестируемого образца. Затем с использованием микропипетки 100 мкл тестируемого образца наносили по каплям на часть для введения образца 5 вышеупомянутой тест-полоски, так чтобы хроматографически проявлять его там. Это оставляли при комнатной температуре на 15 минут. Затем количество комплекса белка MPB64 и меченного коллоидными частицами золота антитела, связанного в вышеупомянутой зоне связывания 31, наблюдали невооруженным глазом. Количество связанного комплекса определяли по классификации невооруженным глазом уровня красно-фиолетового окрашивания, который увеличивается или уменьшается в зависимости от связанного количества, на следующие 4 ступени: - (отсутствие окрашивания); ± (слабое окрашивание); + (явное окрашивание); и ++ (более явное окрашивание). Среду Миддлбрука 7H11 использовали в качестве отрицательного контроля. В качестве контрольной иммунохроматографической тест-полоски использовали коммерчески доступный набор для иммунохроматографического тестирования “CAPILIA ТВ (торговое наименование; TAUNS LABORATORIES INC.)”, и проводили такой же тест. Результаты показаны в таблице 1.

Таблица 1 Кратность разведения образца CAPILIA TB Настоящий способ НОЛЬ - - Х 12800 - + Х 6400 ± + Х3200 + + Х 1600 + ++ Х 800 ++ ++

Как ясно из таблицы 1, обнаружили, что тест-полоска, полученная в примере 3, обладала приблизительно в четыре раза более высокой чувствительностью, чем контрольная CAPILIA ТВ.

Пример 5

Тестирование перекрестной реактивности

С использованием иммунохроматографической тест-полоски, полученной в примере 3 (моноклональное антитело TB003 использовали в качестве анти-MPB64 антитела, иммобилизованного в зоне связывания, и моноклональное антитело TB002 использовали в качестве анти-MPB64 антитела как меченного коллоидными частицами золота антитела), проводили тестирование реактивности против комплекса Mycobacterium tuberculosis и различных нетуберкулезных микобактерий. Каждый из культивированных штаммов разводили в разбавителе для образцов для получения тестируемого образца. Затем 100 мкл тестируемого образца наносили по каплям, так чтобы проявлять его хроматографически. После того, как это оставляли при комнатной температуре на 15 минут, проводили визуальное определение. С использованием коммерчески доступного набора для иммунохроматографического тестирования «CAPILIA ТВ (торговое наименование; изготовлен в TAUNS LABORATORIES INC.)» в качестве контроля, проводили такой же тест. Результаты показаны в таблице 2.

Таблица 2 Вид Тест-полоска из примера 3 CAPILIA ТВ M. tuberculosis + + M. bovis + + M. bovis BCG-Токио + + M. marinum (ATCC 11565) - + M. marinum (ATCC 11564) - + M. marinum (ATCC 927) - - M. marinum (ATCC BAA-535) - -

Как ясно из таблицы 2, для тест-полоски из примера 3 показали реактивность только против комплекса Mycobacterium tuberculosis, т.е. штаммов M. tuberculosis, M. bovis и M. bovis BCG-Токио, но не показали какой-либо перекрестной реактивности против M. marinum JATA22-01, 351-2 и 329, которую подтверждали на контрольной CAPILIA ТВ. Таким образом, показали, что тест-полоска обладает специфичностью против комплекса Mycobacterium tuberculosis, продуцирующего МРВ64.

Такие же результаты показали также для иммунохроматографической тест-полоски, в которой моноклональное антитело TB003 использовали в качестве анти-MPB64 антитела, иммобилизованного в зоне связывания, и моноклональное антитело TB001 использовали в качестве анти-MPB64 антитела как меченного коллоидными частицами золота антитела.

Пример 6

Получение флуоресцентной иммунохроматографической тест-полоски с использованием анти-MPB64 антитела

(1) Получение анти-MPB64 антитела

Каждый клон, полученный в примере 1, инокулировали в брюшную полость мыши для получения асцитов, содержащих анти-MPB 64 антитело. Далее, очистку IgG проводили согласно обычному способу с использованием адсорбента с белком G для получения анти-MPB 64 антитела.

(2) Получение раствора анти-MPB64 антитела, меченного флуоресцентными латексными частицами

Анти-MPB64 антитела, полученные выше в (1), соответственно, метили флуоресцентными латексными частицами, посредством следующих процедур.

1 мкг, эквивалентный массе по белку анти-MPB64 антитела (далее в настоящем документе, когда показана масса по белку антитела, она просто показана как величина массы, полученная гравиметрическим анализом его очищенного белка) смешивали с 1 мл 0,0002% (г/об.) суспензии флуоресцентных латексных частиц, и затем смесь оставляли в состоянии покоя при комнатной температуре на 2 минуты, так что антителам позволяли связываться с поверхностью флуоресцентных латексных частиц. Затем 10% водный раствор бычьего сывороточного альбумина (далее в настоящем документе обозначенного как «BSA») добавляли к суспензии флуоресцентных латексных частиц для доведения конечной концентрации до 1%, и остаток поверхности флуоресцентных латексных частиц весь блокировали BSA для получения раствора меченного флуоресцентными латексными частицами анти-MPB64 антитела (далее в настоящем документе обозначенного как «меченное флуоресцентными латексными частицами антитело»). Этот раствор центрифугировали (5600×G, 30 минут) для преципитации меченного флуоресцентными латексными частицами антитела. Раствор супернатанта удаляли для получения меченного флуоресцентными латексными частицами антитела. Это меченное флуоресцентными латексными частицами антитело суспендировали в 50 мМ Трис-HCl буфере (pH 7,4), содержащем 10% сахарозу, 1% BSA и 0,5% Triton-X100, для получения раствора меченного флуоресцентными латексными частицами антитела.

(3) Получение иммунохроматографической тест-полоски для анализа MPB64

Иммунохроматографическую тест-полоску, показанную на фиг.1, получали посредством следующих процедур.

(3-1) Зона связывания комплекса анти-MPB64 антитела и меченного флуоресцентными латексными частицами антитела

Удлиненную нитроцеллюлозную мембрану в форме полоски размером 5 мм в ширину и 36 мм в длину подготавливали в качестве мембранного носителя 3 для хроматографического проявления хроматографической среды.

0,5 мкл раствора, содержащего 1,0 мг/мл анти-MPB64 антитела, наносили в форме полоски в положении 7,5 мм от конца со стороны точки начала хроматографического проявления мембранного носителя 3 для хроматографического проявления. Его сушили при комнатной температуре для формирования зоны связывания 31 для связывания комплекса белка MPB64 и меченного флуоресцентными латексными частицами антитела. Моноклональное антитело TB003 использовали в качестве анти-MPB64 антитела.

(3-2) Получение пропитанной части, пропитанной меченным флуоресцентными латексными частицами антителом

Нетканый материал из стекловолокна в форме полоски размером 5 мм×15 мм пропитывали 37,5 мкл раствора меченного флуоресцентными латексными частицами антитела, и затем сушили при комнатной температуре для получения пропитанной меченным флуоресцентными латексными частицами антителом части 2. Моноклональное антитело TB001 использовали в качестве меченного флуоресцентными латексными частицами антитела.

(3-3) Получение иммунохроматографической тест-полоски

В дополнение к вышеупомянутому мембранному носителю 3 для хроматографического проявления и вышеупомянутой пропитанной части 2, содержащей меченое антитело, подготавливали хлопковый материал в качестве части для введения образца 5 и фильтровальную бумагу в качестве абсорбирующей части 4. Затем хроматографическую тест-полоску, которая являлась такой же, как на фиг.1, получали с использованием этих частей.

Пример 7

Сравнение чувствительности с CAPILIA ТВ (торговое наименование; изготовленной в TAUNS LABORATORIES INC.)

Предоставляли иммунохроматографическую тест-полоску, полученную в примере 6 (в которой моноклональное TB003 использовали в качестве анти-MPB64 антитела, иммобилизованного в зоне связывания, и моноклональное антитело TB001 использовали в качестве анти-MPB64 как меченного флуоресцентными латексными частицами антитела).

Штамм Mycobacterium bovis BCG Токио культивировали на среде Миддлбрука 7H11, и полученный культуральный супернатант (соответствующий № 1 по стандарту Макфарланда, концентрация 1×10⁸ КОЕ/мл) разводили разбавителем для образцов для получения тестируемого образца. Затем с использованием микропипетки 100 мкл тестируемого образца наносили по каплям на часть для введения образца 5 вышеупомянутой тест-полоски, так чтобы хроматографически проявлять его там. Это оставляли при комнатной температуре на 15 минут. Затем количество комплекса белка MPB64 и меченного флуоресцентными латексными частицами антитела, связанного в вышеупомянутой зоне связывания 31, измеряли посредством флуоресцентного иммунохроматографического считывателя (изготовленного в Hamamatsu Photonics K.K.). Среду Миддлбрука 7H11 использовали в качестве отрицательного контроля. В качестве контрольной иммунохроматографической тест-полоски использовали коммерчески доступный набор для иммунохроматографического тестирования «CAPILIA ТВ (торговое наименование; TAUNS LABORATORIES INC.)», и проводили такой же тест, и количество связавшегося комплекса с меченным флуоресцентными латексными частицами антителом измеряли посредством флуоресцентного иммунохроматографического считывателя (изготовленного в Hamamatsu Photonics K.K.). Сравнивали чувствительность детекции в районе кратности разведения образца, при которой показан минимум чувствительности детекции. Результаты показаны в таблице 3.

Таблица 3   CAPILIA® ТВ Тест-полоска из примера 6 Кратность разведения образца Поглощение Интенсивность флуоресценции Ноль 0 0,0 Х 204800 0,1 5,6 Х 102400 0,3 11,1 Х 51200 0,6 22,2 Х 25600 1,2 44,3 Х 12800 1,5 88,6 Х 6400 5,4 177,1

Из таблицы 3, предел детекции составлял разведение образца в 6400 раз, в то время как предел детекции флуоресцентной иммунохроматографической тест-полоски, полученной в примере 6, составлял 204800 раз. Таким образом, обнаружили, что флуоресцентная иммунохроматографическая тест-полоска, полученная в примере 6, обладает приблизительно в 32 раза более высокой чувствительностью, чем контрольная CAPILIA ТВ.

Пример 8

Анализ МРТ64 в мокроте, полученной от пациента с туберкулезом

Мокроту собирали от пациентов с клиническим диагнозом туберкулез для получения образцов. Собранные образцы мокроты подвергали обработке протеазой и обработке гидрохлоридом N-ацетил-L-цистеина/натрия (далее в настоящем документе обозначено способ NALC-NaOH), чтобы сделать их однородными. Каждый из предварительно обработанных образцов наносили на предметное стекло для получения препарата-мазка. Препарат-мазок окрашивали по Цилю-Нильсену и наблюдали с помощью микроскопа. Определения выполняли по Guideline for Mycobacterial Examination 2007. По отношению к числу детектированных бактерий, 1-9 КУБ/100 полей зрения микроскопа представляли как +, ≥10 КУБ/100 полей зрения микроскопа представляли как 2+, и ≥10 КУБ/1 поле зрения микроскопа представляли как 3+. К 1 мл образца мокроты, определенного по обследованию мазка, добавляли раствор полущелочной протеазы (торговое наименование; SPUTAZYME, изготовленный в KYOKUTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO., LTD.) и обрабатывали при комнатной температуре. После центрифугирования раствор NALC-NaOH добавляли к осадку, смесь перемешивали в течение нескольких секунд на смесителе с встряхиванием, и к этому добавляли фосфатный буфер (pH 7,0) для нейтрализации. После центрифугирования осадок ресуспендировали в PBS, содержащем 0,1% Tween 80, и физически обрабатывали добавлением стеклянных бусин и перемешиванием, для получения тестируемого образца. С использованием микропипетки 100 мкл тестируемого образца наносили по каплям на часть для введения образца 5 тест-полоски, полученной в примере 6, так чтобы проявлять его здесь хроматографически. Это оставляли при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем количество комплекса белка MPB64 и меченного флуоресцентными латексными частицами антитела, связавшегося в вышеупомянутой зоне связывания 31, измеряли посредством флуоресцентного иммунохроматографического считывателя (изготовленного в Hamamatsu Photonics K.K.). Мокроту, собранную у нормального индивида без туберкулезной инфекции, обрабатывали таким же способом, как указано выше, и использовали в качестве отрицательного контроля. В качестве контрольной иммунохроматографической тест-полоски использовали коммерчески доступную тест-полоску «CAPILIA ТВ (торговое наименование; TAUNS LABORATORIES INC.)», и проводили такой же тест. Результаты показаны в таблице 4 и на фиг.2.

Таблица 4 Номер образца Обследование мазка CAPILIA ТВ Тест-полоска из примера 6 Поглощение Интенсивность флуоресценции 1 + 0 0 2 + 0 0 3 + 0 3,6 4 2+ 0 27,2 5 2+ 0 69,3 6 3+ 0 201,2 7 3+ 0 493,5 8 3+ 23 1071,7

Как ясно из таблицы 4 и фиг.2, обнаружили, что флуоресцентная иммунохроматографическая тест-полоска, полученная в примере 6, обладает более высокой чувствительностью, чем контрольная CAPILIA ТВ.

Пример 9

Получение меченной коллоидными частицами платины-золота иммунохроматографической тест-полоски с использованием анти-MPB64 антитела

(1) Получение анти-MPB64 антитела

Каждый клон, полученный в примере 1, инокулировали в брюшную полость мыши для получения асцитов, содержащих анти-MPB64 антитело. Далее, очистку IgG проводили согласно обычному способу с использованием адсорбента с белком G для получения анти-MPB64 антитела.

(2) Получение коллоидных частиц платины-золота

Всю лабораторную стеклянную посуду, подлежащую использованию, промывали царской водкой. 390 мл особо чистой воды помещали во флакон и кипятили, и 30 мл раствора золотохлористоводородной кислоты (соответствующего 1 г золота на 1 л раствора, изготовленного в KATAYAMA CHEMICAL INC.) добавляли в кипящую воду. Затем к этому добавляли 60 мл 1% масс./масс. раствора цитрата натрия, и через 6 минут и 45 секунд к этому добавляли 30 мл раствора платинохлористоводородной кислоты (соответствующего 1 г платины на 1 л раствора, изготовленного в Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Через 5 минут после добавления раствора платинохлористоводородной кислоты к этому добавляли 60 мл 1% масс./масс. водного раствора цитрата натрия, и восстанавливали в течение 4 часов для получения суспензии коллоидных частиц платины-золота.

(3) Получение раствора анти-MPB64 антитела, меченного коллоидными частицами платины-золота

Анти-MPB64 антитело, полученное выше в (1), метили коллоидными частицами платины-золота посредством следующих процедур.

1 мкг, эквивалентный массе по белку анти-MPB64 антитела (далее в настоящем документе, когда показана масса по белку антитела, она просто показана как величина массы, полученная гравиметрическим анализом его очищенного белка), смешивали с 1 мл раствора коллоидных частиц платины-золота, описанного выше в (2), и затем смесь оставляли в состоянии покоя при комнатной температуре на 2 минуты, так что всем антителам позволяли связываться с поверхностью коллоидных частиц платины-золота. Затем 10% водный раствор бычьего сывороточного альбумина (далее в настоящем документе обозначенного как «BSA») добавляли к раствору коллоидных частиц платины-золота для доведения конечной концентрации до 1%, и остаток поверхности коллоидных частиц платины-золота весь блокировали BSA для получения раствора меченного коллоидными частицами платины-золота анти-МРВ64 антитела (далее в настоящем документе обозначенного как «меченное коллоидными частицами платины-золота антитело»). Этот раствор центрифугировали (5600×G, 30 минут) для преципитации меченного коллоидными частицами платины-золота антитела. Раствор супернатанта удаляли для получения меченного коллоидными частицами платины-золота антитела. Это меченное коллоидными частицами платины-золота антитело суспендировали в 50 мМ Трис-HCl буфере (pH 7,4), содержащем 10% сахарозу, 1% BSA и 0,5% Triton-X100, для получения раствора меченного коллоидными частицами платины-золота антитела.

(4) Получение иммунохроматографической тест-полоски для анализа МРВ64

Иммунохроматографическую тест-полоску, показанную на фиг.1, получали посредством следующих процедур.

(4-1) Зона связывания комплекса МРВ64 и меченного коллоидными частицами платины-золота антитела

Удлиненную нитроцеллюлозную мембрану в форме полоски размером 5 мм в ширину и 36 мм в длину подготавливали в качестве мембранного носителя 3 для хроматографического проявления хроматографической среды.

0,5 мкл раствора, содержащего 1,0 мг/мл анти-MPB64 антитела, наносили в форме полоски в положении 7,5 мм от конца со стороны точки начала хроматографического проявления мембранного носителя 3 для хроматографического проявления. Его сушили при комнатной температуре для формирования зоны связывания 31 для связывания комплекса белка MPB64 и меченного коллоидными частицами платины-золота антитела. Моноклональное антитело TB003 использовали в качестве анти-MPB64 антитела.

(4-2) Получение пропитанной части, пропитанной меченным коллоидными частицами платины-золота антителом.

Нетканый материал из стекловолокна в форме полоски размером 5 мм × 15 мм пропитывали 37,5 мкл раствора меченного коллоидными частицами золота антитела и затем сушили при комнатной температуре для получения пропитанной меченным коллоидными частицами платины-золота антителом части 2. Моноклональные антитела TB001 и TB002, меченные коллоидными частицами платины-золота, использовали в качестве меченного коллоидными частицами платины-золота антитела.

(4-3) Получение иммунохроматографической тест-полоски

В дополнение к вышеупомянутому мембранному носителю 3 для хроматографического проявления и вышеупомянутой пропитанной части 2, содержащей меченое антитело, подготавливали хлопковый материал в качестве части для введения образца 5 и фильтровальную бумагу в качестве абсорбирующей части 4. Затем хроматографическую тест-полоску, которая являлась такой же, как на фиг.1, получали с использованием этих частей.

Пример 10

Сравнение чувствительности с CAPILIA ТВ (торговое наименование; изготовленной в TAUNS LABORATORIES INC.)

(1) Иммунохроматографическая тест-полоска

Предоставляли иммунохроматографическую тест-полоску, полученную в примере 9 (в которой моноклональное антитело TB003 использовали в качестве анти-MPB64 антитела, иммобилизованного в зоне связывания, и моноклональное антитело TB001 использовали в качестве анти-MPB64 антитела как меченного коллоидными частицами платины-золота антитела).

(2) Получение жидкой среды

4,7 г основной среды Миддлбрука 7H11 (изготовленной в Difco) растворяли в 900 мл дистиллированной воды, содержащей 0,5 г Tween 80. Это стерилизовали при 121°С в течение 10 минут в автоклаве.

После охлаждения к этому стерильно добавляли 100 мл обогащенного ADC (альбумин-декстроза-каталаза), и помещали аликвоты по 200 мкл каждая в 1,5 мл микропробирки. MGIT (изготовленную в Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.) использовали в качестве контрольной культуральной среды.

(3) Культивирование биологического образца

С использованием среды Миддлбрука 7H11, полученной таким же способом, как выше, штамм Mycobacterium bovis BCG Токио культивировали для получения бактериальных клеток. Бактериальные клетки доводили до эквивалента № 1 по стандарту Макфарланда (концентрация 1×10⁸ КОЕ/мл), для получения стандартной бактериальной культуры. Эту стандартную бактериальную культуру добавляли к мокроте, собранной у нормального индивида, для доведения конечной концентрации до 10⁴ КОЕ/мл, так что получали ложноположительный образец мокроты. Этот ложноположительный образец мокроты обрабатывали способом NALC-NaOH и центрифугировали для получения осадков. Фосфатно-солевой буфер (далее в настоящем документе обозначенный как PBS), содержащий Tween 80, добавляли к осадкам с последующей промывкой. Супернатант удаляли центрифугированием, и остаток ресуспендировали в PBS, содержащем Tween 80, и 100 мкл этого инокулировали в каждую культуральную среду.

После культивирования в течение нескольких суток супернатант собирали из каждой культуральной среды для получения тестируемого образца. Затем с использованием микропипетки 100 мкл тестируемого образца наносили по каплям на часть для введения образца 5 вышеупомянутой тест-полоски, так чтобы хроматографически проявлять его там. Это оставляли при комнатной температуре на 15 минут. Затем количество комплекса белка MPB64 и меченного коллоидными частицами металла антитела, связанного в вышеупомянутой зоне связывания 31, наблюдали невооруженным глазом. Количество связанного комплекса определяли по определяемой визуально степени окрашивания, которая увеличивается или уменьшается в зависимости от связанного количества, и классифицировали на следующие 4 ступени: - (отсутствие окрашивания); ± (слабое окрашивание); + (явное окрашивание); и ++ (значительное явное окрашивание). Результаты показаны в таблице 5.

Таблица 5 Сутки инкубации Тест-полоска из примера 9 CAPILIA® ТВ Сутки 0 - - Сутки 1 - - Сутки 2 + - Сутки 5 ++ +

Даже на сутки 5 не детектировали флуоресценции в MGIT, которая представляла собой контрольную культуральную среду. Флуоресценцию детектировали здесь из-за роста бактерий на сутки 10.

Из вышеуказанных результатов, является возможным детектировать бактерии в более короткий период времени, чем по общепринятому способу, посредством тестирования в соответствии с настоящим способом детекции после культивирования в течение короткого времени до того, как бактерии начнут существенно расти.

Промышленная применимость

Настоящее изобретение относится к иммуноанализу с использованием антитела против специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка MPB64, и более конкретно, относится к сэндвич-иммуноанализу, и в частности, к иммунохроматографическому анализу и к иммунохроматографической тест-полоске. Настоящее изобретение позволяет детектировать комплекс Mycobacterium tuberculosis специфически с высокой чувствительностью, и таким образом, является применимым для быстрой, безопасной и высокоточной диагностики инфекции комплексом Mycobacterium tuberculosis.

Краткое описание чертежей

Фиг.1a представляет собой открытый вид иммунохроматографической тест-полоски, а фиг.1b представляет собой продольный вид в разрезе иммунохроматографической тест-полоски, показанной на фиг.1a; и

Фиг.2 представляет собой график, показывающий результаты примера 8.

Описание символов

1 - Адгезивный лист

2 - Пропитанная часть

3 - Мембранный носитель

31 - Зона связывания

4 - Абсорбирующая часть

5 - Часть для введения образца

Группа изобретений относится к способам специфической детекции антигена, специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка МРТ64, в биологическом образце. Получено антитело, распознающее эпитоп МРВ64, локализованный в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:2-4, в частности моноклональное антитело. Таким образом, представлены иммуноанализ с использованием антитела, в частности сэндвич-иммуноанализ с использованием первого и второго антител против МРВ64, иммунохроматографический анализ и иммунохроматографическая тест-полоска. Биологический образец можно быстро подвергать иммуноанализу без культивирования или после культивирования в течение времени до того, как бактерии комплекса Mycobacterium tuberculosis в образце начнут существенно расти. Биологический образец можно предварительно обрабатывать посредством обработки для инактивации Mycobacterium tuberculosis путем диспергирования или солюбилизацией. Группа изобретений позволяет проводить диагностику инфекции Mycobacterium tuberculosis быстро и безопасно, с большей точностью. 5 н. и 17 з.п. ф-лы, 10 пр., 5 табл. 2 ил.

1. Способ детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, включающий иммуноанализ с использованием антитела против специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка МРВ64, в котором указанное антитело включает антитело против эпитопа МРВ64, локализованного в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-4.

2. Способ детекции по п.1, где указанное антитело представляет собой моноклональное антитело.

3. Способ детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, включающий сэндвич-иммуноанализ с использованием первого и второго антител против специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка МРВ64, в котором по меньшей мере одно из первого и второго антител включает антитело против эпитопа МРВ64, локализованного в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-4.

4. Способ детекции по п.3, где по меньшей мере одно из указанных антител, первое или второе, представляет собой моноклональное антитело.

5. Способ детекции по п.4, где любое первое или второе антитело иммобилизовано на носителе.

6. Способ детекции по п.3, где биологический образец подвергают указанному иммуноанализу без культивирования или после культивирования в течение времени перед тем, как бактерии комплекса Mycobacterium tuberculosis в образце проявляют значительный рост.

7. Способ детекции по п.б, где указанный биологический образец подвергают обработке для инактивации Mycobacterium tuberculosis или предварительной обработке диспергированием или солюбилизацией перед тем, как подвергать иммуноанализу.

8. Способ детекции по п.7, где указанную обработку солюбилизацией или диспергированием проводят посредством операции перемешивания или посредством добавления к биологическому образцу по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из щелочного вещества, восстанавливающего вещества, протеазы и поверхностно-активного вещества.

9. Способ детекции по любому из пп.6-8, где указанный биологический образец представляет собой мокроту.

10. Иммунохроматографический анализ детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, включающий:
наличие мембранного носителя, обладающего зоной связывания, сформированной в его заранее определенном положении посредством иммобилизации первого антитела против специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка МРВ64,
хроматографическое проявление смешанного раствора, содержащего второе антитело против МРВ64 и заранее определенное количество тестируемого образца на мембранном носителе в зоне связывания, в результате чего комплекс антигена, содержащегося в тестируемом образце, и второго антитела связываются в зоне связывания, где по меньшей мере одно из первого и второго антител включает антитело против эпитопа МРВ64, локализованного в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-4.

11. Иммунохроматографический анализ по п.10, где по меньшей мере одно из указанных антител, первое или второе, представляет собой моноклональное антитело.

12. Иммунохроматографический анализ по п.10, где указанный тестируемый образец содержит биологический образец, который не культивировали или культивировали в течение времени перед тем, как бактерии комплекса Mycobacterium tuberculosis проявляют значительный рост.

13. Иммунохроматографический анализ по п.12, где указанный биологический образец подвергают предварительной обработке посредством обработки для инактивации Mycobacterium tuberculosis или обработки диспергированием или солюбилизацией.

14. Иммунохроматографический анализ по п.13, где диспергирование или солюбилизацию биологического образца проводят посредством операции перемешивания или посредством добавления к биологическому образцу по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из щелочного вещества, восстанавливающего вещества, протеазы и поверхностно-активного вещества.

15. Иммунохроматографический анализ по любому из пп.12-14, где указанный биологический образец представляет собой мокроту.

16. Иммунохроматографический анализ по п.10, где второе антитело является меченным коллоидными частицами металлов или частицами латекса.

17. Иммунохроматографический анализ по п.16, где мембранный носитель представляет собой нитроцеллюлозную мембрану.

18. Иммунохроматографическая тест-полоска для детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, которая по меньшей мере содержит первое и второе антитела против специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка МРВ64 и мембранный носитель, где первое антитело предварительно иммобилизовано в заранее определенном положении на мембранном носителе так, чтобы сформировать зону связывания, второе антитело мечено подходящим средством для мечения и подготовлено в положении, удаленном от зоны связывания, для хроматографического проявления на мембранном носителе, где по меньшей мере одно из первого и второго антител включает антитело против эпитопа МРВ64, локализованного в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-4.

19. Иммунохроматографическая тест-полоска по п.18, где по меньшей мере одно из первого и второго антител представляет собой моноклональные антитело.

20. Иммунохроматографическая тест-полоска по п.18, где второе антитело мечено коллоидными частицами металлов или частицами латекса.

21. Иммунохроматографическая тест-полоска по п.20, где мембранный носитель представляет собой нитроцеллюлозную мембрану.

22. Моноклональное антитело, распознающее эпитоп МРВ64, локализованный в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-4.