СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВОЗБУДИТЕЛЮ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2010 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к иммунологии и медицинской диагностике и представляет собой способ определения антител к возбудителю туберкулеза, основанный на проведении иммунохроматографического анализа.

Одной из важных задач, для которых востребовано определение специфических антител, является диагностика туберкулеза (Cegielski J.P., Chin D.P., Espinal M.A., Frieden T.R., Rodriquez Cruz R., Talbot E.A., Weil D.E., Zaieskis R., Raviglione M.C. Infect. Dis. Clin. North. Am. 2002; 16 (I): 1-58; Brewer T.F., Heymann S.J. Arch. Med. Res. 2005; 36 (6): 617-621; Tripathi R.P., Tewari N., Dwivedi N., Tiwari V.K. Med. Res. Rev. 2005; 25 (1):. 93-131; Nair N., Cooreman E.J. Commun. Dis. 2006; 38 (3):. 185-190). По уровню смертности взрослого населения туберкулез занимает первое место среди инфекционных заболеваний. Поскольку туберкулез часто впервые выявляется в запущенных и остро прогрессирующих формах, весьма распространены случаи некурабильных форм болезни, приводящих к смертельному исходу. В условиях интенсивного распространения туберкулеза возрастает значение выявления больных, представляющих эпидемиологическую опасность для окружающих. Правильная и оперативная диагностика позволяет выявить больных на ранних этапах заболевания, а вовремя начатая химиотерапия предотвращает развитие прогрессирующих форм с интенсивной продукцией микобактерий.

Наличие в сыворотке крови антител, специфичных к возбудителю определенного заболевания, является эффективным критерием, позволяющим с высокой достоверностью диагностировать соответствующее инфекционное заболевание. Преимуществами данного подхода по сравнению с непосредственным выявлением и идентификацией возбудителя является определенность при выборе тестируемой пробы (сыворотка крови, тогда как возбудитель может на данной стадии инфекции преимущественно локализоваться в самых разных органах и тканях), а также возможность быстрой детекции достаточно высокого уровня антител, индуцированного контактом с антигеном, в то время как для выявления антигена могут потребоваться довольно продолжительные стадии доращивания до достижения им регистрируемой концентрации. Хотя в настоящее время активно используются как микробиологические, так и иммунологические способы диагностики инфекционных заболеваний, для проведения массового первичного скрининга оптимально иммунологическое определение наличия в сыворотке крови специфических антител (серодиагностика), которое может быть реализовано с высокой экспрессностью и производительностью. Особенный интерес вызывают серодиагностические подходы в тех случаях, когда в силу особенностей роста микроорганизмов получение результатов микробиологического тестирования может потребовать значительного времени.

Поскольку возбудитель заболевания, Mycobacterium tuberculosis, характеризуется крайне медленной скоростью роста, микробиологическая диагностика может потребовать до 30-40 дней для получения достоверных результатов, тогда как симптоматическая диагностика, особенно на ранних стадиях, крайне затруднена из-за высокой степени вариабельности этиологии заболевания. Эти причины определяют значительный интерес к серодиагностике туберкулеза.

Благодаря экспрессности, достаточно высокой чувствительности и специфичности серологические тесты незаменимы при массовых обследованиях. Кроме того, гуморальный иммунный ответ отражает активный инфекционный процесс, и поэтому результаты иммунохимического тестирования достоверно отражают именно случаи заболевания, дискриминируя их от бактерионосительства.

Иммунохимический анализ может быть реализован в различных форматах. Однако, поскольку для массовых обследований первоочередное значение имеют скорость и производительность тестирования, в данной ситуации несомненными преимуществами обладает иммунохроматографический анализ, для которого все необходимые реагенты предварительно нанесены на мембранные компоненты тест-полоски и ее контакт с тестируемой пробой непосредственно инициирует движение фронта жидкости по мембранам, протекание специфических реакций и формирование иммунных комплексов, которые благодаря включению в их состав окрашенного маркера могут детектироваться визуально или с помощью оптического детектора.

Применительно к серодиагностике (определению антител, специфичных к определенному антигену или группе антигенов) общая схема иммунохроматографии заключается в следующем.

Проба, потенциально содержащая специфические антитела, под действием капиллярных сил перемещается вдоль тест-полоски. При этом она вначале взаимодействует с окрашенными частицами (коллоидное золото или иной маркер), на поверхности которых адсорбирован компонент, предназначенный для связывания с антителами. Часто в качестве такового компонента выбирают антивидовые антитела (иммуноглобулины, выделенные из сыворотки животного, иммунизированного препаратом иммуноглобулинов человека или другого организма, для которого проводится серодиагностика). Затем фронт жидкости преодолевает аналитическую (тестовую) зону, которая представляет собой участок мембраны с иммобилизованным антигеном (нативным или специально модифицированным для эффективной сорбции). Степень связывания маркера с иммобилизованным антигеном и, соответственно, интенсивность окрашивания мембраны определяются концентрацией специфических антител в пробе.

Для проверки качества реагентов и сохранения функциональности тест-системы используется расположенная далее контрольная зона, в которой компонент, сорбированный на окрашенной частице, связывается с соответствующим иммобилизованным на мембране реагентом.

Эффективность иммунохроматографической тест-системы как диагностического средства в значительной степени зависит от того, какие иммунореагенты в ней используются и какие комплексы они образуют. Это относится к выбору как антигена, так и формата анализа.

Известно, что применительно к диагностике туберкулеза не существует универсального антигена, наличие в пробе антител к которому позволяло бы делать вывод о заболевании практически во всех случаях. Используемые для серодиагностики туберкулеза антигены обеспечивают выявление заболевания в 50-90% случаев, и достоверная характеристика требует сочетания результатов тестирования с применением нескольких антигенов (Abebe F., Holm-Hansen С., Wiker H.G., Bjune G. Scand. J. Immunol. 2007; 66 (2-3): 176-191; Demkow U., Filewska M., Michalowska-Mitozuk D., Kus J., Jagodzinski J., Zielonka Т., Zwolska Z., Wasik M., Rowinska-Zakrzewska E. J. Physiol. Pharmacol. 2007; 58 Suppl. 5 (Pt. 1): 117-127; Steingart K.R., Henry M., Laal S., Hopewell P.C., Ramsay A., Menzies D., Cunningham J., Weldingh K., Pai M. PLoS Med. 2007; 4 (6): e202; Steingart K.R., Henry M., Laal S., Hopewell P.C., Ramsay A., Menzies D., Cunningham J., Weldingh K., Pai M. Postgrad. Med. J. 2007; 83 (985): 705-712; Steingart K.R., Henry M., Laal S., Hopewell P.C., Ramsay A., Menzies D., Cunningham J., Weldingh K., Pai M. Thorax. 2007; 62 (10): 911-918; Teixeira H.C., Abramo C., Munk M.E. J. Bras. Pneumol. 2007; 33 (3): 323-334).

Традиционная комплектация иммунохроматографических серодиагностических систем предполагает использование конъюгатов коллоидного золота с антивидовыми антителами. Ниже представлена информация о методике, реализуемой в тест-системе «TB-Check-1» фирмы «Vedalab» (Франция) - см. http://www.sanitamedikal.com/Assets/MD_220002_m3_TB_1408_c.pdf. Данная методика определения антител к возбудителю туберкулеза рассматривается в настоящей заявке в качестве прототипной:

Метод основан на комбинации антител к иммуноглобулинам человека, конъюгированных с хромогеном, и высокоочищенного БЦЖ-белка… При прохождении исследуемого образца через адсорбционную зону тестового устройства конъюгат, содержащий меченые антитела, связывается с IgG, образуя комплекс «антиген-антитело». Этот комплекс взаимодействует с высокоочищенным БЦЖ-белком в тестовой зоне устройства и если концентрация специфического IgG к возбудителю туберкулеза превышает 350 Е/мл, образует окрашенную полосу. При низкой концентрации антител окрашенная полоса в тестовой зоне не образуется. Несвязавшийся конъюгат взаимодействует с реагентом в контрольной зоне тестового устройства, образуя окрашенную полосу, что указывает на правильное проведение теста.

Однако существенным недостатком данной методики является связывание маркера со всеми иммуноглобулинами, присутствующими в пробе, тогда как взаимодействие с антигеном в аналитической зоне и формирование детектируемой окрашенной полосы обеспечивают лишь антитела против иммобилизованного антигена М. tuberculosis. Таким образом, с точки зрения формирования детектируемого комплекса связывание с окрашенным маркером основного числа (более чем 90%) молекул иммуноглобулинов является паразитным процессом. Лишь небольшая часть иммобилизованных на коллоиде антител из тестируемой пробы способна взаимодействовать с иммобилизованным антигеном, что в проточном неравновесном режиме иммунохимических взаимодействий обуславливает слабую яркость образующихся окрашенных полос и снижение достоверности диагностики.

Для преодоления указанного ограничения в настоящей заявке предложен иммунохроматографический анализ антител к возбудителю туберкулеза, в котором исключено связывание с окрашенной меткой иммуноглобулинов, не способных взаимодействовать с иммобилизованным в аналитической зоне антигеном. Достижение этой цели обеспечивает использование конъюгатов коллоидного золота с тем же антигеном (или антигенами) М. tuberculosis, которые иммобилизуются в аналитической зоне. Благодаря наличию у антител нескольких (не менее двух) валентностей с идентичной специфичностью возможно формирование иммунных комплексов, включающих и иммобилизованный, и конъюгированный с коллоидным золотом антиген. Использование конъюгата коллоидного золота с антигеном, а не с антителами является отличием предлагаемого метода от остальных известных на данный момент систем иммунохроматографической серодиагностики туберкулеза.

Отметим, что данная комплектация тест-системы позволяет выявлять специфические иммуноглобулины всех классов, что приводит к дополнительному снижению порога детекции. Кроме того, содержащиеся в пробе специфические антитела при взаимодействии с коллоидным конъюгатом потенциально могут формировать агрегаты, включающие несколько коллоидных частиц. Связывание в аналитической зоне таких агрегатов увеличивает чувствительность детекции с помощью данной тест-системы. Указанные эффекты успешно используются для целей иммунодиагностики, в частности, в иммуноагглютинационной системе определения С-реактивного белка «CRP Direct Latex» фирмы "Orgenics" (Франция), иммунохроматографических системах серодиагностики лихорадки Денге «Dengucheck-WB» фирмы "Zephyr Biomedicals" (Индия) и бычьего бабезиоза (С.Kim, A.Alhassan, R.A.Verdida, N.Yokoyama, X.Xuan, K.Fujisaki, S.-I.Kawazu, I.Igarashi. Vet. Parasitol. 2007; 148: 137-143)).

Предложенный подход для серодиагностики туберкулеза был реализован заявителями с использованием двух антигенов М. tuberculosis: антигена 16 кДа (Hsp16.3, Rv2031c) и антигена 38 кДа (Ag78, antigen 5, PhoS, Rv0934). Ниже представлено описание способа получения тест-полосок и проведения иммунохроматографического анализа, а также полученные результаты.

Пример 1. Создание иммунохроматографической тест-системы для серодиагностики туберкулеза с использованием антигена 16 кДа

Для формирования тест-системы использовали набор мембран «mdi Easypack» фирмы «Advanced Microdevices» (Индия), включающий рабочую мембрану CNPC-SN12 L2-P25 (размер пор 15 мкм), подложку под конъюгат PT-R5, мембрану для нанесения образца GFB-R4, адсорбирующую мембрану АР 045 и ламинирующую защитную пленку МТ-1.

На мембраны были нанесены следующие реагенты.

1. Рекомбинантный антиген 16 кДа М. tuberculosis (Rv2031c), фирма «Arista Biologicals Inc.» (США), кат. №AGMTB-0210.

2. Конъюгат коллоидного золота со средним диаметром частиц 30 нм и рекомбинантного антигена 16 кДа М. tuberculosis.

3. Моноклональные антитела НТМ61 против рекомбинантного антигена 16 кДа М. tuberculosis. Центр молекулярной диагностики и терапии, Москва (Россия).

Для формирования аналитической зоны использовали антиген 16 кДа, контрольной зоны - антитела против антигена 16 кДа. На 1 см полосы наносили 2 мкл раствора антигена (1,0 мг/мл в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4) и 2 мкл раствора антител (0,5 мг/мл в том же буфере). Конъюгат коллоидного золота с антигеном 16 кДа наносили в разведении, соответствующем D₅₂₀=2,0, в объеме 8 мкл на 1 см полосы. Для нанесения реагентов использовали диспенсер «IsoFlow» фирмы «Imagene Technology» (США). Листы мембран с нанесенными иммунореагентами нарезали на индивидуальные тест-полоски шириной 4 мм.

Иммунохроматографический анализ проводили при комнатной температуре. Тест-полоску погружали в пробу на 1 мин в вертикальном положении, а затем извлекали и помещали на горизонтальную поверхность. Детекцию связывания коллоидного золота осуществляли через 10 мин визуально или получая цифровое изображение тест-полоски с помощью сканера. Положительным результатом считается достоверное наличие окрашенной полосы в аналитической зоне любой интенсивности.

Результаты тестирования выборки из 9 проб сывороток крови больных туберкулезом представлены на чертеже. У 8 из 9 охарактеризованных больных использование данного метода позволило выявить наличие специфических антител к возбудителю туберкулеза.

Пример 2. Создание иммунохроматографической тест-системы для серодиагностики туберкулеза с использованием антигена 38 кДа

Реализация по идентичной описанной в примере 1 методике иммунохроматографического анализа с использованием рекомбинантного антигена 38 кДа М. tuberculosis (Rv0934) фирмы «Arista Biologicals Inc.» (США), кат. №AGMTB-0220 и моноклональных антител НТМ81 против него Центра молекулярной диагностики и терапии, Москва (Россия), позволяет выявлять антитела в 2/3 (6 из 9) охарактеризованных проб сывороток крови больных.

Краткое описание чертежей.

На чертеже представлены: (а) - внешний вид иммунохроматографических тест-полосок для определения антител к возбудителю туберкулеза с использованием антигена 16 кДа М. tuberculosis (А - аналитическая зона, К - контрольная зона); (б) - диаграмма окрашивания аналитических зон тест-полосок после проведения анализа сывороток 9 человек, больных туберкулезом. Данные получены посредством анализа цифрового изображения тест-полосок с помощью программы TotalLab v2.01. По оси ординат отложена относительная интенсивность окрашивания в условных единицах.

Изобретение относится к иммунологии, а именно к иммунодиагностике. Предложен способ определения в жидких пробах антител к возбудителю туберкулеза Mycobacterium tuberculosis. Проба контактирует с мембранной тест-полоской и инициирует движение по мембранам тест-полоски реагентов, которые содержатся в пробе или нанесены на мембрану. Для детекции антител используют два антигенных реагента - иммобилизованный в аналитической зоне тест-полоски антиген Mycobacterium tuberculosis и антиген, конъюгированный с частицами коллоидного золота. Благодаря наличию у антител как минимум двух антигенсвязывающих сайтов при контакте тест-полоски с пробой в аналитической зоне происходит формирование иммунных комплексов, состоящих из иммобилизованных на мембране молекул антигена, содержащихся в пробе антител к антигену Mycobacterium tuberculosis и конъюгата антигена Mycobacterium tuberculosis с частицами коллоидного золота. Комплексы детектируют визуально или с использованием оптического детектора. Способ позволяет обеспечивать высокую поверхностную плотность сайтов связывания антител к антигенам Mycobacterium tuberculosis на частицах коллоидного золота и благодаря этому более интенсивное окрашивание аналитической зоны тест-полоски. 1 ил.

Способ определения антител к возбудителю туберкулеза, основанный на проведении иммунохроматографического анализа, при котором на мембранной тест-полоске формируются комплексы, в состав которых входят молекулы антигена или антигенов Mycobacterium tuberculosis, специфичные к ним антитела, содержащиеся в тестируемой жидкой пробе, и частицы коллоидного золота, связывание которых в аналитической зоне тест-полоски регистрируется визуально или с помощью оптического детектора, отличающийся тем, что для достижения более интенсивного окрашивания аналитической зоны тест-полоски и достоверной регистрации результатов анализа молекулы антигена или антигенов Mycobacterium tuberculosis иммобилизуются как в аналитической зоне тест-полоски, так и на поверхности коллоидной частицы, вследствие чего при контакте тест-полоски с жидкой пробой и последующем движении реагентов по мембранам тест-полоски в аналитической зоне происходит формирование регистрируемых комплексов, состоящих из иммобилизованных на мембране молекул антигена или антигенов, содержащихся в пробе антител, к антигену или антигенам Mycobacterium tuberculosis и конъюгата антигена или антигенов Mycobacterium tuberculosis с частицами коллоидного золота.