ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОЦЕНКИ ДИСБИОТИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ РОТОГЛОТКИ У ДЕТЕЙ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/487 

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к области микроэкологии, оценке дисбиотических состояний и микроэкологических нарушений в ротоглотке у детей.

Известны методы диагностики дисбактериозов кишечника человека, ротоглотки и др., основанные на бактериологическом анализе кала, слюны и др. ["Приложение 1" к Приказу №535 МЗ СССР от 22 апреля 1985 г.; Беюл Е.А., Куваева И.Б. Дисбактериоз кишечника и его клиническое значение. Клиническая медицина. 1986 (11): 37-44].

Недостатками этих методов являются их большая трудоемкость, низкая воспроизводимость, невозможность работать в реальном масштабе времени, низкая разрешающая способность метода, необходимость использовать дорогостоящие среды, сложные методики анаэробного культивирования. Основным недостатком является невозможность оценки метаболической активности той или иной популяции.

Это положение может быть до известной степени исправлено, посредством дополнительного применения методов оценки метаболической активности микрофлоры соответствующих биотопов организма. Оценка метаболической активности микрофлоры часто основывается на измерении концентрации низкомолекулярных метаболитов, в норме продуцируемых микрофлорой тех или иных биотопов [Митрохин С.Д., Ардатская М.Д., Никушин Е.В. и др. Комплексная диагностика, лечение и профилактика дисбактериоза кишечника в клинике внутренних болезней (методические рекомендации). МЦ УДПРФ под ред. Минушкина О.Н., Минаева В.И., М., 1997, 45 с.].

Наиболее развиты в настоящее время методы оценки содержания, так называемых, летучих жирных кислот (ЛЖК). К летучим жирным кислотам обычно относят уксусную, пропионовую, изо-масляную, масляную, изо-валериановую, валериановую, изо-капроновую, капроновую кислоты. Их образуют, преимущественно, анаэробные микроорганизмы в процессе своего метаболизма.

Известно, что ЛЖК в различных биотопах организма выполняют ряд функций, главными из которых являются энергообеспечение эпителиоцитов, поддержание гомеостаза физико-химических параметров и колонизационной резистентности слизистой. Установлено, что эффекты ЛЖК носят дозазависимый характер и могут быть как физиологическими, так и негативными, в зависимости от сложившейся ситуации (биотопа, дозы, состояния микроокружения и т.д.) [Бабин В.Н., Домарадский И.В., Дубинин А.В., Кондракова О.А. Биохимические и молекулярные аспекты симбиоза человека и его микрофлоры, ЖРХО, 1994, т.38(6): 66-78]. В частности, показано, что ЛЖК способны ингибировать рост патогенной микрофлоры, особенно высокопатогенных вариантов [Кондракова О.А., Бабин В.Н., Вылегжанина Е.С., Дмитриева Н.Ф., Брико Н.И. Избирательность действия низкомолекулярных метаболитов нормальной микрофлоры человека. Эпидемиология и инфекционные болезни, 1998, (3): 30-35].

Поэтому контроль их содержания и особенно его динамики является весьма информативным параметром. В частности, разнонаправленные отклонения общего содержания и относительных количеств ЛЖК являются хорошим маркером дисбиоза в разных биотопах и при разных заболеваниях [Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Бабин В.Н., Дубинин А.В. Изучение содержания и профиля летучих жирных кислот у больных дисбактериозом толстой кишки. Материалы приложения N1 к Российскому журналу гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии, 1995(3), тез. 481].

В этой связи были развиты несколько подходов к их оценке, основывающихся на применении прямого химического метода с использованием перегонки с паром исследуемого субстрата и последующего титрования дистиллата, бумажной хроматографии, газожидкостной хроматографии (ГЖХ-метода), масс-спектрометрии, хроматомасс-спектрометрии, метода электроспрея и пр. [Тамм А.О. Какому методу диагностики дисбиоза кишечника отдать предпочтение. Матер, конф. "Психолого-деонтологические аспекты и новые направления в гастроэнтерологии. Поиски. Решения". М-С., 1991, с.109-110; Осипов Г.А. Хроматомасс-спектрометрическое исследование микроорганизмов и их сообществ. Автореф. дис. д.б.н., М., 1995, с.62].

В настоящее время, в качестве наиболее практичного и «быстрого» метода оценки концентраций этого класса метаболитов в различных биосубстратах, широко применяется метод ГЖХ [Кондракова О.А., Чен Н.В., Бабин В.Н., Ляховецкий Ю.И., Дмитриева Н.Ф., Брико Н.И., Добрякова И.В. Лехатинова Т.Ч., Кондракова О.А., Дубинин А.В. и др. Определение спектров летучих жирных кислот в слюне и фекалиях как экспресс - метод биохимической оценки функциональной активности микробиоценоза кишечника и ротоглотки. Сборник МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского "Медицинские аспекты микробной экологии". М., 1999, т.2, с.66-71].

В ротоглотке, особенно в ее приэпителиальной зоне и лакунах небных миндалин, в микробиоценозе которых преобладает анаэробная микрофлора, имеет место небольшое, но вполне измеримое методом ГЖХ, содержание летучих жирных кислот. Продукция и утилизация ЛЖК при дисбиотических состояниях ротовой полости меняются, что отражается на содержании этих метаболитов в ротовой жидкости, а уровни и спектры, определяемые методом ГЖХ, при этом специфически изменяются. Как показали наши исследования, существует определенная связь между патогенезом ангин, фарингитов, хронических тонзиллитов и уровнем метаболитов бактериального происхождения в слюне [Бабин В.Н., Чен Н.В., Ляховецкий Ю.И., Кондракова О.А., Добрякова И.В., Дмитриева Н.Ф., Дубинин А.В. Уровень летучих жирных кислот в слюне как показатель состояния системы эпителий ротоглотки - нормальная микрофлора. Бюлл. экспер. биол. мед., 1994(5): 494-49].

Особенно важными и как маркеры, и как участники патогенетического процесса являются показатели концентрации «тяжелых» ЛЖК и их изо-форм [Грубова Е.А., Затевалов A.M., Лехатинова Т.И., Кондракова О.А., Воропаева Е.А., Иконников Н.С., Бабин В.Н. Критическая роль изо-форм ЛЖК в диагностике патологических состояний у мышей Balb/c в эксперименте. В сб. Медицинские аспекты микробной экологии, М., МНИИЭМ, 1999, с.43-45].

Известны два принципиально различных подхода к определению содержания ЛЖК: дериватизационный, когда кислоты, тем или иным способом, переводят в соответствующие эфиры. При этом не имеет особого значения, в какой форме пребывает исследуемая частица - солевой (анионной) и в форме нейтральной кислоты [Barcelona M.J., Liljestrand H.M., Morgan J.J. Determination of low molecular weight volatile fatty acids in aqueous samples. Anal. Chem., 52 (2). 1980. 321-325]; метод прямого определения самих кислот, когда пробу или полученный предварительно супернатант подкисляют, переводя, тем самым, соли ЛЖК в сами кислоты [Ардатская М.Д., Иконников Н.С., Минушкин О.Н. Способ разделения смеси жирных кислот фракции С2-С6 методом газожидкостной хроматографии RU 2220755 приор. от 23.07.2002]. Второй подход имеет существенные преимущества, заключающиеся в более высокой точности и простоте.

Наиболее близким по технической сущности является метод определения ЛЖК, также основанный на использовании капиллярной колонки (длина колонки 30±1 м; внутренний диаметр 0,25±0,02 мм; неподвижная фаза - пленка с 2-нитротерефталевой кислотой) [Иконников Н.С., Ардатская М.Д., Дубинин А.В., Бабин В.Н., Минушкин О.Н., Кондракова О.А., Алешкин В.А. Способ разделения смеси жирных кислот фракции С2-С7 методом газожидкостной хроматографии, Патент РФ №2145511, приор. от 09.04.1999, кл. B01D 15/08. 20.02.2000].

Общим недостатком этих методов, в т.ч. и последнего, является их низкая чувствительность в области С4-С6-кислот в субстратах с низкой общей концентрацией ЛЖК, таких как слюна, смывы с задней поверхности языка, крови и т.д., что особенно критично для детей, а также в синдромах острых состояний.

Одной из причин эффективного понижения чувствительности метода, является методика пробоподготовки, приводящая к образованию свободных кислот в форме гомо- или гетероассоциатов-димеров. Образование димеров хелатного типа за счет Н-связей (С=О…Н-О) характерно для монокарбоновых кислот. Эти димеры достаточно прочны, хотя и находятся в состоянии медленного динамического равновесия с мономерами. Однако их наличие снижает эффективную определяемую концентрацию кислот.

Задачей настоящего изобретения является повышение чувствительности способа за счет увеличения эффективной концентрации свободных кислот при пробоподготовке.

Поставленная задача решается путем дополнительного подкисления анализируемой пробы трифторметилсульфокислотой или фторсульфокислотой, или 40% водным раствором хлорной кислоты до рН 1,9-2,2. Способ осуществляется следующим образом: в одноразовой пластиковой пробирке взвешивают 1-2 грамма ротовой жидкости на аналитических весах с точностью до 3-го знака. К пробе приливают 1 мл 0,02N хлористоводородной кислоты, 1 мл дистиллированной воды и 1 мл стандартного вещества. Пробирку закрывают притертой пробкой и гомогенизируют смесь путем энергичного встряхивания. Пробирку с гомогенной смесью центрифугируют 10 минут при 4000-6000 об/мин. Полученный супернатант должен быть прозрачным, иметь кислую реакцию (рН 2,5-3). К отделенному супернатанту добавляют 0,1 мл трифторметилсульфокислоты или фторсульфокислоты, или 40% водный раствор хлорной кислоты. При этом рН супернатанта снижается до 1,9-2,2 рН, и именно такой образец вводится в датчик хроматографа.

Пример 1. Результаты ГЖХ-анализа ротовой жидкости ребенка А. 10 лет больного ангиной стрептококковой этиологии

В одноразовой пластиковой пробирке взвешивают 1,5 грамма ротовой жидкости на аналитических весах с точностью до 3-го знака. К пробе добавляют 1 мл 0,02N хлористоводородной кислоты, 1 мл дистиллированной воды и 1 мл стандартного вещества. Пробирку закрывают притертой пробкой и гомогенизируют смесь путем энергичного встряхивания. Пробирку с гомогенной смесью центрифугируют 10 минут при 4000-6000 об/мин. Полученный супернатант был прозрачным, имел кислую реакцию (рН 2,5). К отделенному супернатанту добавляют 0,1 мл трифторметилсульфокислоты, рН супернатанта снизился до 1,9. Образец пробы вводят в испаритель хроматографа. Разделение жирных кислот фракции С2-С6 проходит на кварцевой капиллярной колонке длиной 30 м с внутренним диаметром 0,25 мм. В качестве неподвижной фазы использовали пленку сополимера полиэтиленгликоля с 2-нитротерефталевой кислотой при толщине пленки 0,25 мкм.

  Концентрации ЛЖК мг/г Кислота Известный метод пробоподготовки Предлагаемый метод (0,1 мл трифторметилсульфокислоты) Индекс роста концентрации Уксусная 0,617 0,832 1,35 Пропионовая 0,056 0,077 1,38 Изо-масляная 0,052 0,071 1,37 Масляная 0,026 0,044 1,7 Изо-валериановая 0,002 0,007 3,5 Валериановая 0,001 0,004 4,0 Изо-капроновая 0,010 0,034 3,4 Капроновая 0,000 0,003 -

Пример 2. Результаты ГЖХ-анализа ротовой жидкости ребенка А. 10 лет больного ангиной стрептококковой этиологии

Хроматографическое разделение проводили аналогично Примеру 1. Пробоподготовка образца отличалась тем, что для подкисления в супернатант добавили 0,1 мл фторсульфокислоты (рН супернатанта стал 1,9).

  Концентрации ЛЖК мг/г Кислота Известный метод пробоподготовки Предлагаемый метод (0,1 мл фторсульфокислоты) Индекс роста концентрации Уксусная 0,617 0,801 1,30 Пропионовая 0,056 0,075 1,34 Изо-масляная 0,052 0,071 1,37 Масляная 0,026 0,040 1,54 Изо-валериановая 0,002 0,007 3,5 Валериановая 0,001 0,035 3,5 Изо-капроновая 0,010 0,033 3,3 Капроновая 0,000 0,003 -

Пример 3. Результаты ГЖХ-анализа ротовой жидкости ребенка А. 10 лет больного ангиной стрептококковой этиологии

Хроматографическое разделение кислот проводили аналогично Примерам 1 и 2. Пробоподготовка образца отличалась тем, что для подкисления в супернатант добавили 0,1 мл 40% хлорной кислоты (рН супернатанта стал 2,1).

  Концентрации ЛЖК мг/г Кислота Известный метод пробоподготовки Предлагаемый метод (0,1 мл 40% хлорной кислоты) Индекс роста концентрации Уксусная 0,617 0,720 1,17 Пропионовая 0,056 0,063 1,12 Изо-масляная 0,052 0,068 1,31 Масляная 0,026 0,038 1,46 Изо-валериановая 0,002 0,005 2,5 Валериановая 0,001 0,003 3,0 Изо-капроновая 0,010 0,022 2,2 Капроновая 0,000 0,003 -

Пример 4. Результаты ГЖХ-анализа ротовой жидкости ребенка 12 лет с хроническим тонзиллитом

Хроматографическое разделение проводили аналогично Примерам 1-3. Пробоподготовка образца отличалась тем, что для подкисления в супернатант добавили 0,1 мл трифторметилсульфокислоты (рН супернатанта стал 1,9).

  Концентрации ЛЖК мг/г Кислота Известный метод пробоподготовки Предлагаемый метод (0,1 мл трифторметисульфокислоты) Индекс роста концентрации Уксусная 0,358 0,483 1,32 Пропионовая 0,046 0,065 1,41 Изо-масляная 0,011 0,026 2,4 Масляная 0,005 0,008 1,6 Изо-валериановая 0,003 0,009 3,0 Валериановая 0,001 0,003 3,0 Изо-капроновая 0,000 0,003 - Капроновая 0,000 0,002 -

Пример 5. Результаты ГЖХ-анализа ротовой жидкости ребенка 12 лет с хроническим тонзиллитом

Хроматографическое разделение проводили аналогично Примерам 1-4. Пробоподготовка образца отличалась тем, что для подкисления в супернатант добавили 0,1 мл фторсульфокислоты (рН супернатанта стал 1,9).

  Концентрации ЛЖК мг/г Кислота Известный метод пробоподготовки Предлагаемый метод (0,1 мл фторсульфокислоты) Индекс роста концентрации Уксусная 0,358 0,479 1,34 Пропионовая 0,046 0,061 1,33 Изо-масляная 0,011 0,027 2,45 Масляная 0,005 0,008 1,6 Изо-валериановая 0,003 0,008 2,66 Валериановая 0,001 0,003 3,0 Изо-капроновая 0,000 0,003 3,0 Капроновая 0,000 0,002 2,0

Пример 6. Результаты ГЖХ-анализа ротовой жидкости ребенка 12 лет с хроническим тонзиллитом

Хроматографическое разделение кислот проводили аналогично Примерам 1-5. Пробоподготовка образца отличалась тем, что для подкисления в супернатант добавили 0,1 мл 40% хлорной кислоты (рН супернатанта стал 2,2).

  Концентрации ЛЖК мг/г Кислота Известный метод пробоподготовки Предлагаемый метод (0,1 мл 40% хлорной кислоты) Индекс роста концентрации Уксусная 0,358 0,483 1,35 Пропионовая 0,046 0,065 1,41 Изо-масляная 0,011 0,021 1,91 Масляная 0,005 0,008 1,6 Изо-валериановая 0,003 0,006 2,0 Валериановая 0,001 0,002 2,0 Изо-капроновая 0,000 0,003 - Капроновая 0,000 0,002 -

Из приведенных примеров видно, что дополнительное введение в образец (супернатант) фторсодержащих сульфокислот и водного раствора 40% хлорной кислоты приводит к заметному росту концентраций определяемых метаболитов. Это особенно важно в области наиболее активных С5-С6-кислот, поскольку они являются не только маркерами патофизиологического процесса, но и участниками его.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для газохроматографического анализа ротовой жидкости у детей. Для этого анализируемую пробу дополнительно подкисляют трифторметилсульфокислотой или фторсульфокислотой, или 40% водным раствором хлорной кислоты до рН 1,9-2,1. Изобретение обеспечивает определение концентрации отдельных летучих жирных кислот в ротовой жидкости при их низкой общей концентрации и небольших объемах биопроб. Показатели, получаемые данным способом, можно использовать при мониторинге эффективности проводимых терапевтических мероприятий, изучении влияния на нормальную микрофлору новых лекарственных препаратов и пребиотиков. 6 пр.

Способ газохроматографического анализа ротовой жидкости у детей, отличающийся тем, что анализируемую пробу дополнительно подкисляют трифторметилсульфокислотой, или фторсульфокислотой, или 40%-ным водным раствором хлорной кислоты до рН 1,9-2,1.