СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ СМЕСИ ЖИРНЫХ КИСЛОТ ФРАКЦИИ C-C МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ Российский патент 2004 года по МПК B01D15/08 G01N30/48 

Изобретение относится к области медицины и химии, в частности к хроматографическому разделению веществ, и может быть использовано для анализа биологических субстратов и других объектов, содержащих смесь короткоцепочечных жирных кислот.

К короткоцепочечным жирным кислотам (фракции С₂-С₆) относят уксусную, пропионовую, изомасляную, масляную, изовалериановую, валериановую и капроновую.

Известен способ разделения жирных кислот фракции С₂-С₆, включающий подготовку пробы путем гомогенизации в растворе NaOH, центрифугирование, упаривание, добавление Н₂SO₄, экстракцию смеси кислот серным эфиром в присутствии сернокислого натрия, введение экстракта в испаритель хроматографа и разделение на колонке из нержавеющей стали длиной 3 метра с внутренним диаметром 3 мм, заполненную 5%-ным полиэтиленгликолятадипинатом на хромосорбе, модифицированым 2% Н₃РO₄. (Тамм А. О. и др. Метаболиты кишечной микрофлоры в диагностике дисбиоза. В журнале "Антибиотики и медицинская биотехнология". Т. 32, 3, 1987, с. 191-195).

Известен способ, предусматривающий разделение смеси жирных кислот фракции С₂-С₆ методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ), включающий пробоподготовку образца биологического субстрата путем добавления Н₂SO₄ до рН 2-3, перегонки с паром, добавление NaOH до рН 9-10, упаривания пробы, добавления серного эфира и H₂SO₄ до рН 3, введения подготовленного образца в виде эфирного раствора в испаритель хроматографа и разделение на колонке из нержавеющей стали длиной 1,2 м, внутренним диаметром 3 мм, заполненную неподвижной фазой (15% Carbowax 20M, модифицированной терефталевой кислотой (1,5%) на Chromaton с диаметром зерна 0,16-0,20 мм). (Комплексная диагностика, лечение и профилактика дисбактериоза (дисбиоза) в клинике внутренних болезней. Методические рекомендации МЦ УДПРФ под редакцией проф. Минушкина О.Н., проф. Минаева В.Н., Москва, 1997, с. 16-17).

Недостатками известных способов является сложность пробоподготовки, недостаточная степень разделения смеси кислот на фракции, содержащие индивидуальные кислоты, приводящие к появлению систематических ошибок в оценке концентраций кислот, особенно изомерных кислот.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ разделения смеси жирных кислот фракции С₂-С₇ методом газожидкостной хроматографии, включающий обработку пробы биологического субстрата водой или водным раствором хлористоводородной кислоты, или последовательно водой и кислотой, введения надосадочной жидкости в испаритель хроматографа и разделения на кварцевой капиллярной колонке длиной 30±1 метр с внутренним диаметром 0,25±0,02 мм, при этом в качестве неподвижной фазы используют пленку сополимера полиэтиленгликоля с 2-нитротерефталевой кислотой при толщине пленки 0,25 мкм (патент RU 2145511, кл. В 01 D 15/08, 20.02.2000).

Чувствительность этого способа недостаточна при малых пробах биологических объектов (меньших чем 2,0 г), а также в случаях низкого содержания кислот в биологических образцах.

Задачей настоящего изобретения является создание газохроматографического способа разделения жирных кислот фракции С₂-С₆ из биологических субстратов. Технический результат, который может быть достигнут при осуществлении способа, - увеличение чувствительности при малых пробах биологических объектов (меньших чем 2,0 г), а также в случаях низкого содержания кислот в биологических образцах при обеспечении высокой степени разделения.

Поставленная задача решается разделением смеси жирных кислот фракции С₂-С₆ методом газожидкостной хроматографии, включающим обработку пробы биологического субстрата водой или водным раствором реагента, введение надосадочной жидкости в испаритель хроматографа и разделение на кварцевой капиллярной колонке длиной 32-40 метров с внутренним диаметром 0,28-0,35 мм с использованием в качестве неподвижной фазы пленки сополимера полиэтиленгликоля с терефталевой кислотой. При этом используют пленку толщиной 0,26-0,35 мкм и температуру термостата поддерживают равной 145-155^oС.

Определение содержания индивидуальных кислот в смеси осуществляются как путем расчета площадей хроматографических пиков методом "треугольника", так и методом компьютерной обработки хроматограмм.

Использование терефталевой кислоты для получения пленки сополимера с полиэтиленгликолем приводит к удешевлению стоимости колонок и проведению исследований (особенно в массовом масштабе) при сохранении хорошего разделения смесей, содержащих кислоты. В многолетней практике применения ГЖХ никто не использовал терефталевую кислоту для разделения и определения жидких смесей, содержащих короткоцепочечные жирные кислоты.

Увеличение длины колонки приводит к улучшению разделения кислот (коэффициент разделения R=1,9). Увеличение диаметра колонки позволяет нанести большую толщину фазы пленки (0,26-0,35 мкм), что приводит к увеличению чувствительности способа.

Это в свою очередь при введении большего количества исследуемого образца (0,9-1 мкл) позволяет определять кислоты в более низких концентрациях ("следовых"), находящихся в образце биоматериала (биоптаты слизистой оболочки толстой кишки, стерильная спинно-мозговая жидкость, вагинальные смывы).

Увеличение длины и диаметра колонки позволяет нанести большую толщину фазы пленки, что приводит к увеличению чувствительности способа и позволяет снизить вес исследуемого образца. В предлагаемом способе используют пробы вещества весом от 0,05 до 1,8 г (или 0,1-1,8 мл).

Уменьшение веса исследуемого образца до 0,05-0,1 г позволяет избежать многократных заборов материала (что важно особенно при инвазивных методах исследования (фиброскопия, спинномозговая пункция и т.д.), у тяжелых больных и детей и, кроме того, приводит к уменьшению расхода реактивов при пробоподготовке.

Обработку пробы образца проводят водой или раствором хлористоводородной кислоты (НСl) или последовательно водой и кислотой.

В частности, уменьшение объема пробы для анализа влечет за собой уменьшение объема НСl, что при сохранении хорошего разделения кислот обеспечивает "долговременность" использования неподвижной фазы.

При длинной колонке повышение температуры до 145-155^oС способствует сокращению времени анализа до 8 минут при сохранении хорошего разделения кислот на фракции, включая их изомеры.

На фиг.1 представлена хроматограмма разделения кислот С₂-С₆ из стандартной смеси.

На фиг. 2-9 представлены хроматограммы разделения смесей кислот фракции С₂-С₆ из образцов: биоптата слизистой оболочки толстой кишки, интраоперационного образца аденокарциномы толстой кишки, фекалий, спинно-мозговой жидкости, вагинального смыва, слюны, асцитической жидкости, образца фекалий (без обработки пробы НСl).

Ниже приведены примеры разделения смеси жирных кислот фракции С₂-С₆ (с целью определения их содержания в различных биологических объектах), подтверждающие возможность осуществления способа, который не ограничивается ими.

Пример 1.

К пробе препарата (образца биоптата слизистой оболочки толстой кишки) весом 0,07 г приливают 0,5 мл дистиллированной воды и 0,1 мл стандартного раствора (для количественного определения содержания летучих жирных кислот), гомогенизируют, растирая в ступке, добавляют 0,1 мл 1 N НСl, центрифугируют при 4500 об/мин в течение 10 мин. Микрошприцем вводят пробу надосадочной жидкости в испаритель хроматографа с детектором ионизации в пламени, снабженном кварцевой капиллярной колонкой длиной 38 м с внутренним диаметром 0,33 мм, колонка в качестве неподвижной фазы содержит сополимер полиэтиленгликоля с терефталевой кислотой в виде пленки толщиной 0,34 мкм.

Режим работы хроматографа: изотермический с температурой термостата 155^oС, температурой испарителя и детектора 230^oС. Газ-носитель - азот с давлением на входе на входе в колонку 1,8 ати. Расход газа-носителя 2,0 мл/мин, воздуха 300 мл/мин. Соотношение потоков газа-носителя на сброс и в колонку 50: 1. Время хроматографирования около 8 мин. Результат разделения представлен на фиг. 2.

Пример 2.

К пробе препарата (интраоперационный образец аденокарциномы толстой кишки ) весом 0,15 г приливают 0,5 мл дистиллированной воды и 0,1 мл стандартного раствора, гомогенизируют, растирая в ступке, добавляют 0,1 мл 1 N НСl, центрифугируют при 4500 об/мин в течение 10 мин. Микрошприцем вводят пробы надосадочной жидкости в испаритель хроматографа.

Хроматографическое разделение проводят, как описано в примере 1, за исключением того, что разделение проводят на колонке длиной 37 м с внутренним диаметром 0,31 мм с неподвижной фазой в виде пленки толщиной 0,32 мкм при температуре термостата 150^oС. Время хроматографирования 8 мин. Результат разделения представлен на фиг.3.

Пример 3.

К пробе препарата (образец фекалий) весом 1,2 г приливают 2 мл дистиллированной воды и 1 мл стандартного раствора, перемешивают путем встряхивания в течение 10 минут, добавляют 0,5 мл 1 N НСl, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 10 мин. Хроматографическое разделение проводят, как описано в примере 1, за исключением того, что используют колонку длиной 32 м с внутренним диаметром 0,29 мм с неподвижной фазой в виде пленки толщиной 0,28 мкм при температуре термостата 145^oС. Время хроматографирования 8 мин.

Результат разделения представлен на фиг.4
Пример 4.

Образец жидкого биологического субстрата (спинно-мозговая жидкость) 0,5 мл помещают в пробирку для центрифуги, приливают к содержимому 0,1 мл 6 N HCl и 0,1 мл стандартного раствора. Скоагулированные белки отделяют центрифугированием 4000 об/мин в течение 10 мин.

Хроматографическое разделение проводят, как описано в примере 1, за исключением того, что разделение проводят на колонке длиной 36 м с внутренним диаметром 0,32 мм с неподвижной фазой в виде пленки толщиной 0,33 мкм при температуре термостата 150^oС. Время хроматографирования 8 мин.

Результаты разделения приведены на фиг. 5.

Примеры 5-7.

Образец жидкого биологического субстрата (вагинальный смыв, или слюна, или асцитическая жидкость) 1 мл помещают в пробирку для центрифуги, приливают к содержимому 0,2 мл 1 N HCl и 0,9 мл стандартного раствора. Скоагулированные белки отделяют центрифугированием 4000 об/мин в течение 10 мин. Хроматографическое разделение проводят, как описано в примере 1, за исключением того, что разделение проводят на колонке длиной 34 м с внутренним диаметром 0,29 мм с неподвижной фазой в виде пленки толщиной 0,31 мкм при температуре термостата 150^oС. Время хроматографирования 8 мин.

Результаты разделения приведены на фиг. 6-8.

Пример 8 (без обработки биосубстрата хлористоводородной кислотой).

К пробе препарата (образец фекалий) весом 0,5 г приливают 1 мл дистиллированной воды и 1 мл стандартного раствора, перемешивают путем встряхивания в течение 10 минут, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость вводят в испаритель хроматографа и ведут разделение при тех же условиях хроматографирования, как в примере 3.

Результаты разделения приведены на фиг. 9.

Кислоты на хроматограммах представлены в виде четких пиков, пригодных для точного расчета их содержания в анализируемых образцах. Для сравнения на фиг 1. представлена хроматограмма разделения кислот С₂-С₆ из стандартной смеси.

Достоверность способа подтверждена в контрольных опытах на модельных смесях кислот. Ошибка не превышала 2-4%. Чувствительность методики 96±2%. Воспроизводимость результатов 98±2%.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет достигнуть увеличения чувствительности при малых пробах биологических объектов (меньших чем 2,0 г), а также в случаях низкого содержания кислот в биологических образцах при обеспечении высокой степени разделения. Кроме того, обеспечивается удешевление способа разделения смеси жирных кислот фракции С₂-С₆ (за счет использования неподвижной фазы сополимера полиэтиленгликоля с терефталевой кислотой).

Изобретение относится к химии и медицине, в частности к хроматографическому разделению веществ, и может быть использовано для анализа биологических субстратов и других объектов, содержащих смесь короткоцепочечных жирных кислот. Предложен способ разделения короткоцепочечных жирных кислот фракции C₂-С₆ методом ГЖХ на колонке с использованием неподвижной фазы из сополимера полиэтиленгликоля с терефталевой кислотой. Способ позволяет проводить выделение, разделение и определение короткоцепочечных жирных кислот с высокой точностью при уменьшении веса (или объема) пробы биологического образца. 3 з.п.ф-лы, 9 ил.

1. Способ разделения смеси жирных кислот фракции С₂-С₆ методом газожидкостной хроматографии, включающий обработку пробы биологического субстрата, введение образца пробы в испаритель хроматографа и разделение на колонке с неподвижной фазой, отличающийся тем, что в качестве неподвижной фазы используют сополимер полиэтиленгликоля с терефталевой кислотой.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сополимер полиэтиленгликоля с терефталевой кислотой используют в виде пленки толщиной 0,26-0,35 мкм.3. Способ по любому из пп.1-2, отличающийся тем, что разделение проводят на кварцевой капиллярной колонке длиной 32-40 м, внутренним диаметром 0,28-0,35 мм.4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что при разделении на колонке температуру поддерживают равной 145-155°С.