СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ β-ЛАКТАМАЗОПРОДУЦИРУЮЩИХ ОКСИДАЗОПОЗИТИВНЫХ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ ДИПЛОКОККОВ, ПОДОЗРИТЕЛЬНЫХ НА ПРИНАДЛЕЖНОСТЬ К MORAХELLA (BRANCHAMELLA) CATARRHALIS Российский патент 2013 года по МПК C12Q1/04 C12R1/01 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для бактериологической диагностики инфекций, вызванных Moraxella (Branchamella) catarrhalis.

Moraxella (Branchamella) catarrhalis впервые выделена от человека в 1896 г., до недавнего времени считалась нормальным обитателем слизистых верхних дыхательных путей, но за последние десятилетия накоплены убедительные данные об ее участии в развитии различных инфекций. М. catarrhalis вызывает гнойный отит в 10-15% случаев, играет важную роль в возникновении острых синуситов и занимает второе-третье место среди бактериальных возбудителей внебольничных пневмоний. Из числа этиологических агентов при хроническом бронхите М. catarrhalis уступает лишь Haemophilus influenzae и Streptococcus pneumoniae. У 54,6% всех больных с инфекцией, вызванной М. catarrhalis, диагностируется хроническая обструктивная болезнь легких [3]. До недавнего времени считалось, что М. catarrhalis обычно высокочувствительна к пенициллину [5]. В настоящее время до 95%, а по ряду авторов почти в 100% случаев, клинические изоляты М. catarrhalis продуцируют бета-лактамазу (тест с нитроцефином) [1, 2, 7]. Существуют определенные трудности в идентификации М. catarrhalis: 1) безпигментные "сапрофитные" нейссерии, нередко контаминирующие мокроту и в норме обитающие в носоглотке, имеют сходную морфологию с М. catarrhalis - растут в виде беспигментных круглых непрозрачных полусферических беловато-серых колоний диаметром до 2-3 мм; гемолиз не образуют, коррозию агара не вызывают, при бактериоскопии культур обнаруживаются грамотрицательные парные кокки, оксидазо- и каталазоположительные, так как относятся к одному семейству Neisseriaceae [3, 5, 6]; 2) при культуральном исследовании носоглотки или мокроты М. catarrhalis может быть не идентифицирована из-за подавления роста другими преобладающими микроорганизмами: Neisseria sp., Streptococcus viridans, Corynebacterium sp., Staphylococcus sp., Streptococcus sp. и др. в норме находящихся в носоглотке или контаминирующих мокроту. Лишь выделение оксидазопозитивных, бета- лактамазоположительных, грамотрицательных диплококков позволяет заподозрить их принадлежность к М. catarrhalis.

Поэтому важно совершенствование лабораторной диагностики воспалительных заболеваний дыхательной системы и ЛОР-органов, вызванных М. catarrhalis.

Ближайшим аналогом является определение чувствительности к пенициллину, описанное в Manual of clinical microbiology / editor in chief Patrick R. Murray. 7^th ed. - ASM PRESS Washington, 1999, 1773 p. на странице 544. Согласно нему сплошным газоном засевают чистую культуру оксидазоположительного, индолнегативного, асахаралитического коккоподобной формы нефермента на поверхность кровяного агара с 5% бараньей кровью и затем незамедлительно накладывают диск с пенициллином 10 БД. и инкубируют при 35°С в обычных условиях атмосферы 18-24 часа. Любой штамм с зоной ингибиции роста вокруг диска с пенициллином интерпретируется как чувствительный для идентификационных целей.

Целью предлагаемого нами способа является облегчить выделение β-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных грамотрицательных диплококков подозрительных на принадлежность к Moraxella (Branchamella) catarrhalis из контаминированного клинического материала (естественно откашливаемая или индуцированная мокрота, транстрахеальный аспират) или из клинического материала в норме содержащего сапрофитные микроорганизмы (мазки из носа, зева, носоглотки).

Способ предусматривает следующее. На кровяно-сывороточный агар в чашках Петри диаметром 90 или 100 мм на 1/2 площадь чашки (первый сектор) сплошным газоном засевают клинический материал (мазки из носа, зева, носоглотки, естественно откашливаемая или индуцированная мокрота, транстрахеальный аспират), с последующим рассевом еще на два сектора для получения изолированных колоний микроорганизмов. Затем на поверхность первого сектора накладывают диск с пенициллином (10 ЕД.). Чашки инкубируют при 37°С в обычных условиях атмосферы 18-24 часа. Высокая концентрация пенициллина подавляет рост большинства других микроорганизмов, являющихся представителями нормальной микрофлоры дыхательных путей (нейссерий, стафилококков, стрептококков и др.), что позволяет получить вокруг диска с пенициллином (10 ЕД.) рост β-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных грамотрицательных диплококков подозрительных на принадлежность к M. catarrhalis из клинического материала. В дальнейшем производится биохимическая идентификация данной культуры.

Сущность способа:

1. На кровяно-сывороточный агар в чашках Петри диаметром 90 или 100 мм на 1/2 площадь чашки (первый сектор) сплошным газоном засеять клинический материал, с последующим рассевом еще на два сектора для получения изолированных колоний микроорганизмов.

2. Затем на поверхность первого сектора наложить диск с пенициллином (10 ЕД.).

3. Чашки инкубировать при 37°С в обычных условиях атмосферы 18-24 часа.

4. Оценить наличие или отсутствие зоны задержки роста микроорганизмов вокруг диска с пенициллином 10 ЕД.

Известны методики определения чувствительности к пенициллину у М. catarrhalis, которые используются при идентификации данного микроорганизма и для его дифференциации от других представителей рода Moraxella [6, 8]. Для данного теста необходима чистая суточная культура штамма, подозрительного на принадлежность к М. catarrhalis, то есть от момента посева клинического материала до получения результатов теста должно пройти 36-48 часов.

Общее с прототипом: 1) использование диска с пенициллином 10 ЕД.; 2) нанесение его сразу после посева; 3) инкубация посева в обычных условиях атмосферы 18-24 часа.

Отличительные признаки от прототипа: 1) наносится не чистая культура штамма микроорганизма, а непосредственно клинический материал; 2) посев производится на кровяно-сывороточный агар; 3) инкубация осуществляется при 37°С; 4) посев клинического материала делается секторами для получения также изолированных колоний микроорганизмов.

В предлагаемом нами способе заподозрить культуру на принадлежность к М. catarrhalis, продуцирующую β-лактамазу, можно уже в первые сутки после посева клинического материала. Следовательно, окончательная идентификация и выдача результата антибиотикочувствительности возможна на вторые сутки от момента посева клинического материала.

Авторы провели исследования на выявление β-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных грамотрицательных диплококков подозрительных на принадлежность к М. catarrhalis из клинического материала (зев, нос, мокрота) данным способом. За 2007 г. выделено 19 штаммов М. catarrhalis: 2 штамма из мокроты (у детей со следующей патологией: ХИВЗЛ, пневмония); 1 штамм выделен из зева (обострение хронического тонзиллита); 16 штаммов выделены из носа (хронический риносинусит, гайморит, этмоидит, мастоидит, субтрофический ринит). В результате: вокруг диска с пенициллином (10 ЕД.) нет зоны подавления роста у β-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных грамотрицательных диплококков, подозрительных на принадлежность к М. catarrhalis, которые в дальнейшем были по биохимическим признакам идентифицированы как М. catarrhalis. В отличие от идентифицированных как S. viridans, S. pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Neisseria sp., Staphylococcus sp., которые образуют зону подавления роста вокруг диска с пенициллином (10 ЕД.), диаметром, в среднем равным 20 мм.

Так же авторами были протестированы музейные тест-штаммы, путем посева суточной культуры каждого в отдельности сплошным газоном на кровяно-сывороточный агар и наложением затем на поверхность агара диска с пенициллином (10 ЕД.). Чашки инкубировали при 37°С в обычных условиях 18-24 часа. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 Тестирование музейных тест-штаммов к пенициллину (диск 10 ЕД.) Музейный тест-штамм Диаметр зоны подавления роста в миллиметрах Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 25 Staphylococcus aureus 25923, NCDC, США 30 Staphylococcus haemolyticus*, продуцирующий β-лактамазу 0 Streptococcus pyogenes* 30 Streptococcus agalactiae* 25 Neisseria meningitides* 25 Moraxella catarrhalis*, продуцирующая β-лактамазу 0 Moraxella catarrhalis*, не продуцирующая β-лактамазу 25 Corynebacterium diphtheriae mitis toxigenes 090086 33 Corynebacterium diphtheriae gravis 665 36 Corynebacterium ulcerans* 35 * - из рабочего музея - культуры, выделенные из клинического материала и используемые для контроля бактериологических питательных сред, с типичными свойствами, соответствующие микроорганизмам признанных национальных и международных коллекций [4].

Список цитируемой литературы:

1. Авдеев С.Н., Чучалин А.Г. Роль бактериальной инфекции и выбор антибиотиков при обострении хронического бронхита / С.Н.Авдеев, А.Г.Чучалин // Consilium Medicum. - 2000. - Т.2, №10. - С.5-9.

2. Зубков М.Н. Современные аспекты этиологической диагностики и антимикробной терапии внебольничных пневмоний / М.Н.Зубков // Фарматека. - 2005. - №19. - С.31-37.

3. Зубков М.Н. Moraxella (Branchamella) catarrhalis: роль в патологии человека, идентификация и антибиотикорезистентность / М.Н.Зубков // Инфекция и антимикробная терапия. - 2001. - Т.3, №4. - С.115-116.

4. МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред».

5. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т.1: Пер. с англ. Под ред. Дж.Хоулта, Н.Крига, П.Снита, Дж. Стейли, С.Уильямса. - М.: Мир, 1997. - 432 с.

6. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий (аэробных и факультативно анаэробных). Пер. с англ. Р.Вейант, У.Мосс, Р.Уивер, Д.Холлис, Дж.Джордан, Э.Кук, М.Дейншвар. - М.: Мир, 1999. - 791 с.

7. Страчунский Л.С., Каманин Е.И. Антибактериальная терапия инфекций в оториноларингологии / Л.С.Страчунский, Е.И.Каманин // Русский Медицинский Журнал. - 1998. - Т.6, №17. - С.684-693.

8. Manual of clinical microbiology / editor in chief Patrick R. Murray. 7^th ed. - ASM PRESS Washington, 1999, 1773 p.

Способ по изобретению раскрывает возможность выявления β-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных грамотрицательных диплококков, подозрительных на принадлежность к Moraxella (Branchamella) catarrhalis, и предусматривает посев клинического материала на кровяно-сывороточный агар секторами с одновременным накладыванием дисков с пенициллином 10 ЕД. Посев инкубируют в обычных условиях атмосферы 18-24 часа, а через 36-48 часов от момента посева осуществляют оценку наличия или отсутствия зоны задержки роста микроорганизмов, присутствующих в клиническом материале. При отсутствии зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков выявляют наличие в клиническом материале β-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных грамотрицательных диплококков. Принадлежность выявленных диплококков к Moraxella (Branchamella) catarrhalis идентифицируют по биохимическим признакам. Реализация способа обеспечивает упрощение выделения искомых микроорганизмов из контаминированного клинического материала. 1 табл.

Способ выявления β-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных грамотрицательных диплококков, подозрительных на принадлежность к Moraxella (Branchamella) catarrhalis, отличающийся тем, что клинический материал высевают на кровяно-сывороточный агар секторами для получения изолированных колоний и одновременно накладывают на посев диски с пенициллином 10 ЕД., посев инкубируют в течение 18-24 часов при температуре 37°С в обычных условиях атмосферы, через 36-48 часов от момента посева оценивают наличие или отсутствие зоны задержки роста микроорганизмов, присутствующих в клиническом материале, и при отсутствии зоны подавления роста вокруг дисков выявляют наличие в клиническом материале β-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных грамотрицательных диплококков, а принадлежность выявленных диплококков к Moraxella (Branchamella) catarrhalis идентифицируют по биохимическим признакам.