СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ОТСЛОЙКИ ХОРИОНА И ПЛАЦЕНТЫ НА РАННИХ СРОКАХ БЕРЕМЕННОСТИ НА ОСНОВАНИИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА ИНГИБИТОРА АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА I ТИПА (PAI-1) Российский патент 2013 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и предназначено для прогнозирования отслойки хориона и плаценты на ранних сроках при полиморфизме генов PAI-1.

Отслойка хориона и плаценты на ранних сроках беременности в общей популяции составляет 3%, у женщин с привычной потерей беременности может достигнуть 10-15%. Наиболее часто встречаются субхориальные отслойки в среднем в 7 недель беременности, что соответствует наиболее активной фазе инвазии цитотрофобласта в стенки спиральных артерий [3].

Наличие отслоек сопровождается наружным кровотечением в 71%, бессимптомным течением - в 29%. Если не происходит гибель эмбриона (плода), то в дальнейшем возможно развитие плацентарной недостаточности - в 24% случаев, преждевременных родов - в 16-19%, преэкламсии - в 8%, задержки развития плода - в 7%, дистресс-синдрома у новорожденного - в 19%. Частота кесарева сечения у данного контингента беременных составляет 27% [2].

Существенное значение в процессе инвазии цитотрофобласта играет соотношение фибринолитических и антифибринолитических компонентов системы гемостаза на локальном (эндометрий) уровне. Процесс регуляции фибринолиза зависит от активности активаторов плазминогена тканевого и урокиназного типа (t-PA и u-РА) и от уровня синтеза и секреции ингибиторов активации плазминогена (PAI-1 и PAI-2). [1, 5]

PAI-1 ответственен не только за повышение депозиции фибрина в маточных сосудах и снижении маточно-плацентарного кровотока, ему принадлежит также важная роль в снижении степени инвазии трофобласта в ранние сроки беременности. Имеется также связь между ранними преэмбриотическими потерями и уровнем PAI-1, что в основном связано с дефектами имплантации [4].

При подготовке к имплантации под влиянием прогестерона в эндометрии происходит повышение содержания PAI-1, тканевого фактора и снижение уровня активаторов плазминогена тканевого и урокиназного типов (t-PA и u-РА) и других протеаз, необходимых для разрушения экстрацеллюлярного матрикса в процессе имплантации. В условиях гипофибринолиза, в частности, связанных с полиморфизмом генов PAI-1 происходит десинхронизация локальных процессов фибринолиза и фибринообразования при имплантации. В такой ситуации протеаз, синтезируемых бластоцистой, становится недостаточно для разрушения экстрацеллюлярного матрикса и адекватного внедрения в эндометрий. В связи с этим происходит образование ретрохориальных отслоек наиболее часто в сроки 8,3±0,4 недели [2].

Ингибитор активатора плазминогена (PAI-1) образуется в клетках эндотелия, гепатоцитах, а также в неактивной форме может высвобождаться из тромбоцитов. Концентрация PAI-1 зависит как от внешних (уровень триглицеридов [8], курение [9]), так и внутренних (генетических) факторов. Известен полиморфизм в промоторной области гена PAI-1. Различия в фенотипических проявлениях генотипа PAI-1 обусловлены тем, что с промотором гена 5G может связываться как активатор, так и репрессор, а с промотором гена 4G - только активатор. Поэтому ген 5G, легко включается и легко выключается, а ген 4G легко включается, но слабо выключается [6, 7].

Полиморфный вариант 4G сопровождается повышенной экспрессией гена и повышением уровня PAI-1 в крови [9]. В результате снижается активность фибринолитической системы. В крови людей, имеющих вариант 4G/4G, концентрация PAI-1 значительно выше, чем при вариантах 5G/4G и 5G/5G.

Задача изобретения - повысить эффективность прогнозирования отслойки хориона и плаценты на ранних сроках беременности на основании определения полиморфизма гена PAI-1.

Поставленная задача решается тем, что на основании определения полиморфизма гена PAI-1 вне беременности с высокой степенью вероятности возможно прогнозирование отслойки хориона и плаценты на ранних сроках беременности и проведение лечебно-профилактических мероприятий.

Определение полиморфизма гена PAI-1 необходимого производить у женщин:

1) с метаболитическим синдромом;

2) при наличии репродуктивных потерь;

3) при наличии плацентарной недостаточности в анамнезе;

4) при наличии преэкламсии в анамнезе.

Практически способ осуществляется следующим образом:

Материалом для проведения исследования является периферическая кровь. Взятие крови для исследования осуществляется путем пункции кубитальной вены. В качестве антикоагулянта используется ЭДТА. Допустимо также использовать цитрат.

1-й Этап: Выделение ДНК

Для выделения ДНК используется комплект реагентов ПРОБА-РАПИД-ГЕНЕТИКА или ПРОБА-ГС-ГЕНЕТИКА (000 «НПО ДНК-Технология», Россия)

Полученный препарат ДНК можно хранить до 7 суток при температуре 2-8°C, при температуре минус 20°C до одного месяца.

2-й Этап. Проведение реакции амплификации

Для проведения амплификации используется комплект реагентов для определения генетических полиморфизмов, ассоциированных с нарушениями функций сердечно-сосудистой системы «КардиоГенетика» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).

1. Внести в промаркированные пробирки по 20 мкл соответствующей смеси для амплификации.

2. Приготовить в отдельной пробирке смесь ПЦР-буфера и Taq-AT полимеразы. Добавить в каждую пробирку со смесью для амплификации по 10 мкл смеси ПЦР-буфера и Taq-AT полимеразы.

3. Добавить в каждую пробирку по одной капле (20 мкл) минерального масла.

4. Добавить в соответствующие пробирки по 5,0 мкл анализируемого препарата ДНК.

5. Добавить в пробирки, предназначенные для «К-», по 5,0 мкл отрицательного контрольного образца, прошедшего этап выделения ДНК.

6. Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге/вортексе в течение 1-3 сек.

7. Установить пробирки в блок детектирующего амплификатора, заполнить протокол в программном обеспечении детектирующего амплификатора и запустить программу амплификации.

Регистрация и учет результатов ПЦР проводится автоматически программным обеспечением для амплификаторов детектирующих.

Результаты испытаний

Для оценки информативности данного метода обследовано 67 женщин с синдромом привычной потери беременности с учетом особенностей полиморфизма генов PAI-1. Средние сроки выявления субхориальных отслоек составляли 8,3±0,4 недели, средний объем - 1,32±0,25 см². Средние сроки выявления субамниотических отслоек составляли 12,1±0,5 недель, средний объем - 17,7±6,0 см². При субхориальных отслойках гипоплазия хориона встречалась в 4 раза чаще, чем при субамниотических (p>0,01).

Субхориальные/субамниотические отслойки в 2 раза чаще встречались среди носительниц полиморфизма PAI-1 (4G4G и 4G5G), чем в группе PAI-1 (5G5G).

При генотипах 4G5G отслойки встречались в 1,5 раза чаще, чем при генотипе 4G4G (p<0,05).

Отношение шансов (OR) образования отслоек при носительстве аллели 4G при гетерозиготном генотипе полиморфизма гена PAI-1 (4G/5G) равнялось 4,04 (1,06-15,34, р=0.062) при 95% конфиденциальном интервале (95% CI 1,06-15,34, р=0.062). При гомозиготном генотипе полиморфизма гена PAI-1 (4G/4G) отношение шансов (OR) равнялось 7.4 (95% CI 1.51-36.33, p=0.026).

Для решения вопроса о влиянии 4G аллели на образование ретрохориальных/ретроамниотических отслоек были рассчитаны частоты образования отслоек в зависимости от генотипа. Полученные результаты отражены в таблице 3.

Таблица 3 Вероятность развития отслоек в зависимости от количества 4G аллели. Количество аллели 4G Количество пациенток с отслойками / количество пациенток-носителей аллели Частота образования отслоек 2 (4G/4G) 4/8 50%* 1 (4G/5G) 6/17 35,3% 0 (5G/5G) 5/42 11,9% *p<0,05 R²=0,98

Как следует из представленных в таблице 3 данных, частота образования ретрохориальных/ретроамниотических отслоек «дозозависима» от аллели 4G (p<0,05, коэффициент достоверности аппроксимации R²=0,98).

В результате проведенного исследования была установлена высокая прогностическая значимость определения полиморфизма генов PAI-1 при развитии отслойки хориона/плаценты на ранних сроках беременности.

В соответствии с полученными ранее данными при наличии полиморфизма генов PAI-1 и образование ретрохориальных/ретроамниотических отслоек в ранние сроки беременности с лечебно-профилактической целью следует использовать селективные ингибиторы фибринолиза (транексам) в сочетании с антиагрегантами (курантил). При наличии тромбофилических состояний возможно одновременное назначение антифибринолитиков и низкомолекулярных гепаринов. Наряду с общепринятыми методами терапии подобная тактика позволяет снизить частоту развития плацентарной недостаточности, преэкламсии, преждевременных родов и ряда других осложнений [2].

Ниже следует пример, который иллюстрирует способ по изобретению.

Беременная И., 30 лет, обратилась на обследование и подготовку к беременности. Наследственность не отягощена. Из соматических заболеваний: хронический цистит, хронический панкреатит. Аллергологический анамнез не отягощен. Менструальная функция с 13 лет через 28 дней по 6 дней, без особенностей.

Гинекологические заболевания: бактериальный вагиноз.

Имела 3 самопроизвольные потери беременностей в сроках 8-9 недель, 7-8 недель и 5-6 недель. Обследование вне беременности:

1. Бак. посев из цервикального канала - роста микроорганизмов не обнаружено.

2. Гормональный профиль - в пределах N

3. Гемостазиограмма - в пределах N

4. Спектр антифисфолипидных антител и антител к ХГЧ - в пределах N.

5. Кариотип супругов - в пределах N

6. HLA типирование I и II классов - отклонений нет.

7. Гомоцистеин - в пределах N

8. Диагностика полиморфизма генов тромбофилии:

- С677Г - гетерозиготная форма (метилентетрагидрофолатредуктаза)

- Полиморфизм генов F5 и F2 (кодирующих V и II факторы) - отсутствует

- Выявлен полиморфизм гена PAI-1 - генотип 4G/4G (гомозиготная форма).

В сроке 7 недель беременности отмечала сукровичные выделения из половых путей. По данным УЗИ - хорион кольцевидный, толщиной 5 мм, определяются 2 ретрохориальные отслойки размерами 2,4×1,1×2,6 см и 2,7×1,1×2,4 см. Гемостазиограмма - гиперкоагуляция. К терапии добавлен транексам 1 табл. × 3 р.

В сроке 9 недель - сукровичные выделения прекратились. По данным УЗИ - хорион по передней стенке, толщиной 9 мм, ретрохориальная отслойка в стадии организации, размерами 3,3×1,6×0,7 см. Гемостазиограмма - нарастание гиперкоагуляции, повышение функции тромбоцитов. Дополнительно назначен курантил по 1 т (25 мг) × 3 р.

В сроке 13 недель - выделения светлые. По данным УЗИ - плацента по передней стенке, толщиной 12 мм, определяется организовавшаяся ретроамниотическая отслойка размерами 2,2×0,6×2,1 см.

Гемостазиограмма - признаки хронической формы синдрома ДВС. Транексам и курантил отменены, назначен фрагмин по 2500 ЕДх1р п/к - сроком на 3 недели.

При сроке беременности - 20 недель - хирургическая коррекция истмико-цервикальной недостаточности, дальнейшее течение беременности без осложнений.

Родоразрешена в 39 недель путем операции кесарева сечения. Ребенок женского пола массой 3152, ростом 50 см, оценка по шкале Апгар 8/9 баллов. Течение послеродового и раннего неонатального периодов без особенностей.

В заключение следует отметить, что предложенный нами метод позволяет с довольно высокой точностью прогнозировать вероятность отслойки хориона и плаценты на ранних сроках, что способствует более рациональному ведению беременности и улучшению ее исходов.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ прогнозирования отслойки хориона и плаценты на ранних сроках беременности. Осуществляют выделение ДНК с последующей амплификацией полиморфизма -675 5G>4G гена ингибитора активатора плазминогена I типа (PAI-1) при помощи метода ПЦР. Вероятность развития отслойки хориона и плаценты у женщин с высоким риском самопроизвольных репродуктивных потерь при генотипе 4G/4G прогнозируют как 50,0%, при генотипе 4G/5G - как 35,3%. Изобретение позволяет с довольно высокой точностью прогнозировать вероятность отслойки хориона и плаценты на ранних сроках, что способствует более рациональному ведению беременности и улучшению ее исходов. 3 табл., 1 пр.

Способ прогнозирования отслойки хориона и плаценты на ранних сроках беременности, включающий выделение ДНК с последующей амплификацией полиморфизма -675 5G>4G гена ингибитора активатора плазминогена I типа при помощи метода ПЦР, при этом вероятность развития отслойки хориона и плаценты у женщин с высоким риском самопроизвольных репродуктивных потерь при генотипе 4G/4G прогнозируют как 50,0%, при генотипе 4G/5G - как 35,3%.