СПОСОБ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ ТУБЕРКУЛЕЗА У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, преимущественно к фтизиатрии, может быть использовано для диагностики первичного инфицирования, скрытой активности туберкулеза у детей и оценки эффективности специфической терапии.

Известен иммунологический метод определения противотуберкулезных антител - иммуноферментный анализ (ИФА). В диагностике туберкулеза серологические методы, в том числе ИФА, не оправдали всех возлагавшихся надежд, поскольку не удалось обнаружить специфичных антигенов M.tuberculosis, на которые у большинства больных вырабатываются соответствующие антитела. Существующие иммуноферментные тест-системы обладают специфичностью на уровне 90-94% (6-10% ложноположительных результатов у здоровых лиц или больных нетуберкулезными заболеваниями), тогда как чувствительность (число положительных результатов у больных активным туберкулезом) составляет, в среднем, около 70%. Поэтому говорить о самостоятельном значении данного метода для дифференциальной диагностики туберкулеза органов дыхания пока не представляется возможным (Диагностика и химиотерапия туберкулеза органов дыхания. Пособие для врачей. - М.: «Медицина и жизнь», 2003. - 48 с.), также как и для дифференциальной диагностики инфицирования микобактериями туберкулеза и парааллергии, чувствительность ИФА у инфицированных составляет 23,2% (Некрасов С.В. Диагностическая и прогностическая значимость определения противотуберкулезных антител при инфицировании и заболевании туберкулезом легких у детей и взрослых: Автореф.дис. … канд.мед.наук. - М., 1999. - 23 с.).

Известен иммунологический метод определения уровня интерферона-гамма (ИФН-γ) с помощью ИФА. Роль ИФН-γ в противотуберкулезном иммунитете подтверждается тяжелым течением микобактериальных инфекций у мышей - нокаутов по гену ИФН-γ (Dalton D.K., Pitts-Meek S., Keshav S. et al. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes // Science. 1993. - Vol.259, №5102. - P.1739-1742) и развитием тяжелых микобактериозов с летальным исходом у людей с генетически обусловленным полным или частичным дефицитом рецептора к ИФН-γ (Jouanguy E., Doffinger R., Dupuis S. et al. IL-12 and IFN-gamma in host defense against mycobacteria and salmonella in mice and men // Curr. Opin. Immunol. 1999. - Vol.11, №3. - P.346-351). Течение туберкулезной инфекции у людей также сопровождается продукцией ИФН-γ - антигенспецифическими клетками. Основанием для клинического применения сывороточного ИФН-γ явились сведения о его сниженной продукции при туберкулезе, 380±147,8 пг/мл (490±54,9 пг/мл у здоровых). Эффективная химиотерапия способствует отчетливому повышению уровня ИФН-γ (р<0,02) по сравнению с исходными данными (Кузнецов В.П., Маркелова Е.В., Федянина Л.Н. Природные препараты альфа-интерферона и цитокинов в практике врача-фтизиатра: реферативный обзор №1. - М., 1999. - 59 с.; Хасанова P.P., Воронкова О.В., Уразова О.И. и др. Роль цитокинов в модуляции субпопуляционного состава лимфоцитов крови у больных туберкулезом легких // Пробл. туб. - 2008. - №3. - С.31-34.). В то же время по некоторым наблюдениям у больных туберкулезом, особенно при благоприятном течении процесса, может отмечаться и высокий уровень сывороточного ИФН-γ. Учитывая данные факты трудно говорить о диагностической значимости уровня сывороточного ИФН-γ при оценке активности туберкулезной инфекции.

В отличие от сывороточного уровня ИФН-γ количество Т-лимфоцитов, содержащих внутриклеточный ИФН-γ, у больных туберкулезом повышено по сравнению со здоровыми донорами и носителями латентной инфекции (Veenstra H., Crous I., Brahmbhatt S. et al. Changes in the kinetics of intracellular IFN-gamma production in ТВ patients during treatment // Clin.Immunol. 2007. - Vol.124, №3. - P.336-344.). Данные о высоком содержании ИФН-γ-продуцирующих лимфоцитов у больных активным туберкулезом позволяют считать, что количество ИФН-γ-продуцирующих клеток может являться мерой микобактериальной нагрузки и использоваться для диагностики туберкулеза. Новые подходы к диагностике латентного и активного туберкулеза основаны именно на определении количества (частоты) клеток, продуцирующих ИФН-γ (тест T-SPOT), и/или количества ИФН-γ, продуцируемого клетками периферической крови после их стимуляции in vitro антигенами M.tuberculosis (Quantiferon Gold) (Lalvani A., Millington K.A. Т Cells and Tuberculosis: Beyond Interferon-gamma // J. Infect. Dis. 2008. - Vol.197. - P.941-3; Pai M., Zwerling A., Menzies D. Systematic Review: T-Cell-Based Assays for the Diagnosis of Latent Tuberculosis Infection: An Update // Annals. Internal, medicine. 2008. - Vol.149, №3; Ferrara G., Lost M. et al. Routine Hospital Use of a New Commercial Whole Blood Interferon-gamma Assay for the Diagnosis of Tuberculosis Infection // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2005. - Vol.172, №5. - P.631-5; Ferrara G., Lost M. et al. Use in routine clinical practice of two commercial blood tests for diagnosis of infection with Mycobacterium tuberculosis: a prospective study // Lancet. 2006. - Vol.367. - P.1328-34.), при постановке реакции рекомендуется короткое время экспозиции - 24 часа, поэтому тест в основном используется как скрининговый при отборе для более детального обследования на туберкулез, что не исключает получения ложноотрицательных результатов. В отечественной практике данные тесты не используются (Киселев В.И., Барановский П.М. и др. Новый кожный тест для диагностики туберкулеза на основе рекомбинантного белка ESAT-CFP // Молекулярная медицина. - 2008, №4. - С.28-34), поэтому оценить чувствительность и специфичность данных тестов не возможно.

Известна реакция бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) с туберкулином (ППД-Л) для оценки состояния специфического клеточного иммунитета используемая в клинике (особенно в комплексе с рядом других иммунологических тестов) для дифференциальной диагностики туберкулеза, оценки активности его течения и выявления минимальной активности туберкулезных поражений. Механизм этой реакции состоит в трансформации лимфоцитов в бластные клетки под действием специфического митогена - туберкулина. Реакция состоит из 3-х этапов:

1. выделение лимфоцитов (или лейкоцитарной массы);

2. культивирование лимфоцитов (лейкоцитов) с ППД-Л;

3. оценка результатов.

Недостатки методики:

- Данную реакцию чаще оценивают морфологическим методом (подсчет визуальный в окрашенных мазках), что может давать субъективные ошибки.

- Невысокий процент выявления повышенного уровня бластообразования (положительных результатов) можно объяснить потерей лимфоцитов на этапе их выделения (на фекол-верографине). Для оптимального протекания РБТЛ необходимо присутствие макрофагов, поэтому использовать высокоочищенные лимфоциты не рекомендуется (Лебедев К.А., Понякина И.Д. Иммунограмма в клинической практике. - М.: Наука, 1990. - 224 с.).

Задачей изобретения является повышение качества и сокращение времени диагностики активного туберкулеза у детей и подростков.

Поставленная задача решается тем, что в способе оценки активности туберкулеза у детей и подростков, включающем на первом этапе оценку состояния специфического клеточного иммунитета с помощью модифицированной реакции бластной трансформации лимфоцитов (мРБТЛ) с туберкулином (ППД-Л), используя четыре разведения, оценивают уровень специфического клеточного ответа по определению индекса стимуляции. Дополнительно после стимуляции ППД-Л оценивают количество ИНФ-γ в супернатантах с помощью иммуноферментного анализа. Проводят мРБТЛ с ППД-Л с использованием малого объема (200 мкл) культуры цельной крови без выделения лимфоцитов. Гепаринизированную кровь (25 ЕД гепарина на 1 мл крови) 0,02 мл культивируют во влажной камере термостата или CO2-инкубатора в стерильных условиях, в круглодонных иммунологических. планшетах, в 0,120 мл полной ростовой среды (ПРС) (среда 199, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, L-глютамин (2mM), HEPES (10mM), гентамицина сульфат 50 мкг/мл) - контрольные 3 образца крови. Опытные образцы крови 0,02 мл культивируют в 0,120 мл ПРС, содержащей ЛПД-Л в качестве индуктора ИФН-γ в четырех разведениях (60, 30, 15, 7,5 мкг/мл) в течение 96 часов. За 18 часов до окончания культивирования в культуры клеток (контрольную и опытную) вносят по 1 MKCi ³Hi-тимидина. По окончании культивирования клетки крови собирают полуавтоматическим сборщиком клеток на стекловолоконные фильтры и высушивают. Подсчет радиоактивности в имп/мин проводят в сцинтилляционной жидкости с помощью «Betta-2» камеры. Оценку уровня специфического клеточного ответа проводят по определению индекса стимуляции (и.с.), расчет и.с.по формуле: .

Установлено, что результат индекса стимуляции лимфоцитов до 3,2 -отрицательный, более 3,2 - положительный (свидетельствует о сенсибилизации организма МБТ). Из полученных контрольных культур и культур клеток с ППД-Л отбирают супернатанты (надосадок) по 0,05 мл, объединяют в общий контрольный (0,15 мл) и общий опытный образец (0,20 мл), которые в дальнейшем используют для количественного определения гамма-интерферона спектрофотометрически с помощью ИФА с использованием тест-систем, предназначенных для определения гамма-интерферона в супернатантах. Оценку уровня ИФН-γ проводят по определению индекса стимуляции. При показателе индекса стимуляции менее 7,0 диагностируют отсутствие активной туберкулезной инфекции, при показателе индекса стимуляции более 7,0 диагностируют активный туберкулезный процесс.

Разработанная реакция на основании РБТЛ (модифицированная РБТЛ с ППД-Л) позволила повысить информативность данного иммунологического теста и информативность ИФА при оценке ИФН-γ. При выполнении теста исключены потери Т-лимфоцитов и других клеток крови, принимающих участие в реакции (макрофаги), использовано несколько доз антигена (туберкулина), параллельно для установления активности туберкулезного процесса определяют максимальное количество выделяемого клетками гамма-интерферона. Отличительными признаками предлагаемого способа является: использование культурального надосадка, возможность использования малого объема крови (200 мкл) и время экспозиции 96 часов.

В исследованиях была определена специфичность и чувствительность мРБТЛ с ППД-Л. Установлена высокая специфичность - 97,9% и чувствительность метода - 97,8%.

Нами была исследована информативность показателя пролиферации лимфоцитов при стимуляции туберкулином (мРБТЛ с ППД-Л) у 279 детей. Среди них у 117детей (41,9%) 2-17 лет рентгенологически был подтвержден туберкулез органов дыхания, в том числе в фазе инфильтрации у 72 (61,5%), в фазе распада у 6 (5,1%), в фазе рассасывания и уплотнения у 11 (9,4%), кальцинации у 16 (13,7%), или внелегочный туберкулез. Инфицирование диагностировано у 107 детей (38,4%) дошкольного и младшего школьного возраста. Здоровых, не реагирующих на туберкулин или с сомнительными результатами пробы Манту с 2 ТЕ ППД-Л, был 31 ребенок (11,1%) дошкольного возраста, из них 9 детей были обследованы в динамике через 6-12 месяцев.

Полученные результаты отражены в таблице 1. Как видно из таблицы уровень пролиферативного ответа лимфоцитов на туберкулин у детей, не инфицированных, инфицированных (в том числе и в период «виража») и больных туберкулезом, достоверно (р=0,000) различался.

При обследовании детей, больных туберкулезом, в фазе инфильтрации до лечения пролиферация лимфоцитов на туберкулин у всех (100%) была выражена, при этом результаты по фазам туберкулезного процесса до лечения достоверно не различались (р=0,302).

Таблица 1 Уровень индекса стимуляции в мРБТЛ с ППД-Л у детей больных туберкулезом, инфицированных МБТ и не инфицированных МБТ Группы наблюдения n Результат мРБТЛ с ППД-Л, индекс стимуляции М±m Доверительный интервал Не инфицированные МБТ 29 2,1±0,2* 1,1-3,1 Больные туберкулезом в фазе инфильтрации до лечения 25 16,6±2,0* 6,7-26,5 Больные туберкулезом независимо от фазы процесса до лечения 42 14,6±1,4* 5,3-23,9 Инфицированные микобактериями туберкулеза (туберкулиноположительные) 107 7,4±0,4* 3,5-11,3 Период ранней туберкулезной инфекции («вираж») 71 7,7±0,5* 3,3-12,1 Инфицированные микобактериями туберкулеза более года 36 6,7±0,4 4,1-9,3 * р=0,000

Нами была дополнительно исследована информативность показателя ИФН-γ с ППД-Л: у 42 детей и подростков, больных туберкулезом, средний уровень показателя составил 624,6±205,2 пг/мл; у 30 здоровых детей и подростков он был 147,6±16,2 пг/мл, при этом данные показатели имели достоверные различия, р=0,000 (критерий Манна-Уитни). При первичных формах туберкулеза (n=20) регистрировали более высокий уровень синтеза ИФН-у после стимуляции ППД-Л (846,0±291,6 пг/мл), чем при вторичных (n=22, 403,2±291,6 пг/мл), но достоверных различий не установили (р=0,288). При этом выявили слабую обратную корреляцию между уровнем синтеза ИФН-γ после стимуляции ППД-Л и генезом заболевания (г=-0,17, р<0,05), что подтверждает тенденцию более выраженного клеточного ответа при первичном генезе туберкулеза. Одновременно с этим установили умеренно выраженную прямую зависимость между мРБТЛ с ППД-Л и ИФН-γ с ППД-Л (г=0,61, р<0,05 по Спирмену) у больных туберкулезом и умеренно выраженную прямую зависимость у здоровых (г=0,43, р<0,05 по Спирмену). Оценивая степень корреляции между показателями (мРБТЛ с ППД-Л и ИФН-γ с ППД-Л) у всех обследуемых детей и подростков, установили умеренно выраженный уровень корреляционной зависимости (г=0,67, р<0,05 по Спирмену). Была проведена оценка ИФН-γ с ППД-Л по индексу стимуляции, так средний показатель индекса стимуляции у больных туберкулезом составил 12,2±2,6, у здоровых детей 2,2±0,3. Определяя уровень ИФН-γ без стимуляции и при стимуляции неспецифическим митогеном (ФГА) у больных туберкулезом и у здоровых детей достоверных различий не установили (р<0,05), следовательно данные показатели диагностического значения в определении активности туберкулезной инфекции не имеют (табл.2). Дополнительно определена специфичность и чувствительность ИФН-γ с ППД-Л для больных туберкулезом. Установлен уровень специфичности - 70% и чувствительности метода - 97%. Анализируя полученные ложноотрицательные результаты ИФН-γ с ППД-Л у детей, больных туберкулезом установили, что данные показатели отмечены в случае завершения туберкулезного процесса (снижения активности сочеталось с низким уровнем пролиферации лимфоцитов на туберкулин), в одном случае регистрировали развитие отрицательной анергии при генерализации туберкулеза.

Таблица 2 Уровень показателя ИФН-γ при стимуляции различными митогенами и без стимуляции у больных туберкулезом и здоровых детей и подростков Показатели Не инфицированные МВТ Больные туберкулезом органов дыхания до лечения ИФН-γ с ППД-Л:   М±m, пг/мл 147,6±16,2* 624,6±205,2* Доверительный интервал, пг/мл 115,2-181,8 208,8-1040,4 М±m, и.с. 2,2±0,3 12,2±2,6 Доверительный интервал, и.с. 1,6-2,9 7,0-17,4 ИФН-γ спонтанный:   М±m, пг/мл 71,1±7,2 82,8±14,4 Доверительный интервал, пг/мл 57,6-64,8 55,8-111,6 ИФН-γ с ФГА:   М±m, пг/мл 9397,8±1155,6 7189,2±1517,4 Доверительный интервал, пг/мл 7021,8-11775,6 3756,6-10621,8 * р=0,000

Полученные результаты проведенных исследований мРБТЛ с ППД-Л и ИФН-γ с ППД-Л позволяют утверждать, что у детей с положительным индексом стимуляции лимфоцитов (более 3,2) и положительном результате уровня ИФН-γ после стимуляции туберкулином (более 209 пг/мл или и.с. более 7,0) имеет место активный туберкулезный процесс. Это позволяет данный иммунологический тест применять как в диагностике первичного специфического процесса, так и при развитии туберкулеза вторичного генеза, в том числе при внелегочных локализациях.

Примерами информативности определения уровня специфического клеточного ответа при первичной туберкулезной инфекции у детей могут служить следующие выписки из историй болезни.

Пример 1. Алексей Р., 15 лет, карта стационарного больного №68, поступил в стационар Бюджетного учреждения здравоохранения Омской области Специализированной детской туберкулезной клинической больницы (БУЗ ОО СДТКБ) 30.04.09 г. на обследование и лечение. Клинический диагноз: Экссудативный плеврит, левосторонний, туберкулезной этиологии, МБТ-. При профилактическом обследовании в апреле 2009 года выявили изменения на флюорограмме. Антибактериальная терапия, проведенная в учреждении общей лечебной сети, эффекта не дала.

При поступлении жалоб не отмечалось, но наблюдали проявление интоксикации в виде бледных кожных покровов, небольшой потливости. По другим органам и системам без особенностей. Уточняя эпидемилогоический анамнез, был установлен семейный контакт. Бактериологическое исследование на МБТ было не информативным. От проведения бронхоскопии отказались. При поступлении был определен уровень специфического клеточного ответа в мРБТЛ с ППД-Л, индекс стимуляции составил 23,5. Уровень интерферона-гамма, после стимуляции туберкулином составил 763,2 пг/мл (и.с.=7,5). При рентгенологическом обследовании на фоне противотуберкулезной терапии была выявлена положительная рентгенологическая динамика в виде рассасывания плеврального выпота на 3 месяце химиотерапии. Таким образом, с помощью мРБТЛ с ППД-Л и ИФН-γ с ППД-Л была подтверждена этиология плеврита и активность туберкулезной инфекции.

Пример 2. Валихан А., 14 лет, карта стационарного больного №51, поступил в стационар БУЗ ОО СДТКБ 07.04.2009 г. с целью оценки активности туберкулезного процесса и подготовки к оперативному лечению.

Диагноз при поступлении: Множественные туберкулемы левого легкого, фаза распада и обсеменения, МБТ+, обострение. Туберкулез левого бронха. Туберкулез мочевой системы, МБТ-.

Семейный контакт, длительный, наличие множественной лекарственной устойчивости. С 2006 года у ребенка регистрируются выраженные и гиперергические туберкулиновые пробы. По контакту получал курсы противотуберкулезной терапии.

При поступлении в стационар проявлений туберкулезной интоксикации, бронхо-легочного синдрома не наблюдалось. При осмотре по органам и системам патологических изменений выявлено не было. При проведении бронхоскопии патологии выявлено не было. В общих анализах крови и мочи без патологии. По результатам туберкулинодиагностики в январе 2009 г. инфильтрат 16 мм (выраженная положительная реакция). Рентгенологически определяли 2 округлые тени до 2 см в диаметре, однородной структуры без зоны перифокального воспаления и очагов отсева в окружающей ткани. По результатам бактериоскопии выявили кислотоустойчивые микобактерии, при посеве результат отрицательный (через 3 мес.). Был определен уровень специфического клеточного ответа в мРБТЛ с ППД-Л, индекс стимуляции составил 3,2, что соответствует уровню инфицирования микобактериями туберкулеза, без активности специфического процесса. Был определен уровень ИФН-γ с ППД-Л, который составил 144,9 пг/мл (и.с.=0,7), что также подтверждало отсутствие активности специфического процесса.

Таким образом, на основании полученных данных можно было говорить об отсутствии прогрессирования туберкулезного процесса и рекомендовать хирургическое лечение в плановом порядке через 3 мес.на фоне противотуберкулезной терапии с учетом возможного риска лекарственной устойчивости. Ребенку 04.08.2009 года была проведена резекция С2, С6 левого легкого, в послеоперационном периоде осложнений не было.

По нашему мнению, учитывая высокую специфичность и чувствительность метода, использование мРБТЛ с ППД-Л в клинической практике в сочетании с ИФН-γ с ППД-Л позволит повысить качество диагностики специфического воспаления, оценить эффективность специфического лечения, сократить сроки диагностики активной туберкулезной инфекции, следовательно, провести своевременную противотуберкулезную терапию.

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, может быть использовано для диагностики скрытой активности туберкулеза у детей и подростков. Для этого проводят оценку состояния специфического клеточного иммунитета с помощью модифицированной реакции бластной трансформации лимфоцитов (мРБТЛ) с туберкулином (ППД-Л) и определение уровня интерферона-гамма (ИФН-γ) с ППД-Л с использованием малого объема (200 мкл) цельной крови и 4-х разведении антигена ППД-Л. При показателях индекса стимуляции клеточного ответа более 3,2 и ИФН-γ с ППД-Л более 7,0 диагностируют активный туберкулезный процесс, а при показателе мРБТЛ с ППД-Л более 3,2 и ИФН-γ с ППД-Л менее 7,0 - не активную туберкулезную инфекцию. Использование данного способа позволяет повысить специфичность диагностики туберкулезной инфекции, а также оценить эффективность проводимого лечения. 2 табл., 2 пр.

Способ оценки активности туберкулеза у детей и подростков, включающий оценку состояния специфического клеточного иммунитета с помощью модифицированной реакции бластной трансформации лимфоцитов (мРБТЛ) с туберкулином (ППД-Л) и иммуноферментного анализа (ИФА) с определением уровня интерферона-гамма (ИФН-γ) с ППД-Л, отличающийся тем, что мРБТЛ и ИФА проводят с использованием малого объема (200 мкл) цельной крови с аллергеном туберкулезным (ППД-Л), используют 4 разведения антигена, оценивают уровень специфического клеточного ответа и ИФН-γ после стимуляции по определению индекса стимуляции и при показателях индекса стимуляции клеточного ответа более 3,2 и ИФН-γ с ППД-Л более 7,0 диагностируют активный туберкулезный процесс, а при показателе мРБТЛ с ППД-Л более 3,2 и ИФН-γ с ППД-Л менее 7,0 - не активную туберкулезную инфекцию.