ВОДОРАСТВОРИМЫЙ МОЛЕКУЛЯРНЫЙ КОМПЛЕКС ВКЛЮЧЕНИЯ ВОССТАНОВЛЕННОЙ ФОРМЫ КОЭНЗИМА Q В β-ЦИКЛОДЕКСТРИНЕ И СПОСОБ ЕГО ПРЕПАРАТИВНОГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2014 года по МПК C07C39/00 A61K38/43 A61K31/47 A61K9/14 

Коэнзим Q₁₀ (убихинон - окисл.; убихинол - восст.) является коферментом системы тканевого дыхания митохондрий, который участвует в процессе биохимического окисления. Антиоксидантная и мембраностабилизирующая активность коэнзима Q₁₀ связана в основном с его восстановленной формой, обладающей высокой антирадикальной активностью в отношении пероксирадикалов, способной восстанавливать окисленную форму витамина Е, поддерживать его эффективную концентрацию и предотвращать прооксидантное действие токофероксил-радикала.

Прием препаратов коэнзима Q₁₀ как здоровыми людьми, так и лицами, страдающими сердечно-сосудистыми заболеваниями, сопровождается увеличением образования АТФ в миокарде. При этом клинические испытания показали, что применение восстановленной формы коэнзима Q₁₀ повышает его уровень в крови в несколько раз более эффективно, чем использование его окисленной формы. Возможно, именно этим объясняется тот факт, что убихинол оказывается более эффективным в профилактике и лечении не только атеросклеротических поражений сердца и сосудов, но и начальных стадий сердечной недостаточности. Поэтому представляется перспективным восполнение дефицита коэнзима Q₁₀ путем назначения именно его восстановленной формы - убихинола. Убихинол, как и убихинон, не растворим в воде и плохо растворим в спиртах, что требует создания новых форм и способов его доставки. При этом в любой фармацевтической композиции, содержащей легко окисляющийся убихинол, должна быть обеспечена защита от окисления. В препаратах и рецептурах биологически активных добавок к пище с восстановленной формой коэнзима Q₁₀ прибегают к использованию синтетических и природных антиоксидантов, однако, вопрос о его стабилизации все же остается открытым.

В качестве способа защиты восстановленной формы коэнзима Q₁₀ от окисления предложен путь включения его в молекулярные комплексы с полигидроксильными соединениями (по типу «гость - хозяин»). Такие молекулярные комплексы, экранируя химически активные гидроксильные группы убихинола, существенно уменьшают его способность к окислению.

Настоящее изобретение относится к созданию и разработке способа получения новой субстанции на основе комплекса «восстановленный коэнзим Q₁₀ - β-циклодекстрин».

Патентная информация о комплексах включения восстановленной формы коэнзима Q₁₀ в полость молекулы β-циклодекстрина, а также о способах получения таких комплексов отсутствует. Имеющиеся сообщения о молекулярных комплексах с β-циклодекстрином относятся только к окисленной форме коэнзима Q₁₀: Zmitek J., Smidovnik A., Fir M. et al., 2008; Kagan D., Madhavi D., 2010; Патенты US 2003/0012774 (A1) (публ. 2003-06-16), US 2007/202090 (A1) (публ. 2007-08-30), SI21992 (А) (публ. 2006-10-31), CN 101053556 (А) (публ. 2007-10-17), KR20090020557 (А) (публ. 2009-02-26), CN 101485626 (А) (публ. 2009-07-22), JP2009062347 (А) (публ. 2009-03-26), JP2007300919(A) (публ. 2007-11-22), JP2006249050 (А) (публ. 2006-09-21), JP2006001917(A) (публ. 2006-01-05), US2003012774 (A1) (публ. 2003-01-16), JP59047202 (А) (публ. 1984-03-16), JP56109590 (А) (публ. 1981-08-31).

Наиболее близкими к настоящему изобретению является запатентованный авторами Prosek M., Smidovik A. et al. способ получения молекулярных комплексов коэнзима Q₁₀ с β-циклодекстрином US 2007/202090 (A1) (публ. 2007-08-30) «Water Soluble Form Of Coenzyme Q₁₀ In The Form Of An Inclusion Complex With Beta-Cyclodextrin, Process Of Preparing, And Use Thereof». Как и все перечисленные выше, этот способ направлен на включение в молекулярный комплекс с β-циклодекстрином только окисленной формы коэнзима Q₁₀. Недостатком этого способа также является невозможность достижения значимых концентраций связанного в молекулярный комплекс коэнзима Q₁₀ в искомой композиции из-за низкой его растворимости в предложенных растворителях.

Особенностью настоящего изобретения является получение комплексов включения восстановленной формы коэнзима Q₁₀ в β-циклодекстрин с почти количественным выходом. При этом связанный в комплекс с β-циклодекстрином восстановленный коэнзим Q₁₀ является более стабильным и устойчивым к окислению по сравнению со свободным коэнзимом Q₁₀.

Задача настоящего изобретения состояла в получении солюбилизированной формы комплексов включения предварительно восстановленного коэнзима Q₁₀ в β-циклодекстрин в виде сухих порошков.

Эта задача решена тем, что в описываемом способе используется оптимальный безводный органический растворитель для растворения выбранных реагентов, проведения реакции восстановления и образования молекулярных комплексов включения. При этом, получение восстановленного коэнзима Q₁₀ на первом этапе проводилось только с помощью природных восстановителей и без применения синтетических соединений.

Близким по способу получения восстановленной формы коэнзима Q₁₀ из его окисленной формы является способ, защищенный Патентом KR 20090017547 (А) (публ. 2009-02-18), где получение восстановленной формы коэнзима Q₁₀ проводится также с помощью аскорбиновой кислоты, но в смешиваемых с водой органических растворителях. Такой способ ограничивает получение значимых количеств восстановленной формы коэнзима Q₁₀, поскольку наличие даже малых количеств воды в растворах, содержащих коэнзим Q₁₀, приводит к выпадению его в осадок из-за резкого уменьшения растворимости.

Особенностью данного изобретения также является то, что оптимально подобранная среда с использованием, например, этанола, ацетона, диметилсульфоксида, диметилацетамида и их смесей может одновременно растворять в различных соотношениях любые сильно гидрофобные, например, коэнзим Q₁₀ и гидрофильные соединения, например, аскорбиновую кислоту.

Быстрое получение восстановленного коэнзима Q₁₀ с помощью аскорбиновой кислоты проводится в том же растворителе, аликвота которого используется для получения комплексов уже восстановленного коэнзима Q₁₀ в β-циклодекстрине. Тем самым достигается эффективность получения комплексов включения в значимых для препаративного синтеза количествах.

Путем смешивания раствора восстановленного коэнзима Q₁₀ с водным раствором β-циклодекстрина, взятых в объемном соотношении, не превышающем 1:10, образуются молекулярные комплексы включения. Их агрегация с последующей кристаллизацей в виде порошка, полное освобождение субстанции от органического растворителя и воды происходит при строгом соблюдении температурного режима на всех стадиях.

Описываемый способ включает: (i) предварительное растворение окисленной формы коэнзима Q₁₀ и аскорбиновой кислоты, взятых в мольном соотношении не менее 1:40; (ii) получение восстановленной формы коэнзима Q₁₀ из его окисленной формы; (iii) получение молекулярных комплексов включения восстановленной формы коэнзима Q₁₀ в β-циклодекстрин. При этом обеспечивается простота, хороший выход восстановленного продукта синтеза и экономичность химико-технологического процесса.

1. Получение восстановленного коэнзима Q₁₀. Выход восстановленного продукта - убихинола, оптимальное соотношение.

Получение убихинола (Н₂Q₁₀) для последующего введения в комплексы с β-циклодекстрином (β-CD) проводили восстановлением его окисленной формы - убихинона Q₁₀ (6.08 ммоль/л) избытком аскорбиновой кислоты АК (соотношения от 9.3:1 до 72.3:1). Выход восстановленного коэнзима Q₁₀ составлял соответственно от 24.65% до 98% при соответствующей остаточной равновесной концентрации Q₁₀ от 75.35% до 2% к исходной. Время достижения остаточной концентрации с увеличением избытка аскорбиновой кислоты сокращается от 4.6 часа до 2.6 часов. Выход восстановленной формы коэнзима Q₁₀ нелинейно возрастает до 98% при увеличении концентрации аскорбиновой кислоты (АК) и/или молярного соотношения AK/Q₁₀. Таким образом, оптимальным режимом получения восстановленной формы коэнзима Q₁₀ с точки зрения выхода продукта и расходования восстановителя является режим, при котором молярное соотношение AK/Q₁₀ составляет не менее 40-47. При этом обеспечивается 88-90%-ный выход продукта.

Реакция восстановления Q₁₀ аскорбиновой кислотой из водной фазы в двухфазной липосомальной системе в тождественных концентрационных и температурных условиях протекает с выходом восстановленной формы не более 3-5% в течение 4-5 часов. Таким образом, для наиболее эффективного получения убихинола в достаточно высоких концентрациях использование подобранной среды является оптимальным.

2. Получение молекулярных комплексов включения и выход продукта.

После получения восстановленной формы коэнзима Q₁₀, его раствор вводят при температуре не менее 50-53°С в водный раствор β-CD с массовой концентрацией 1,8 г% (объемное соотношение растворитель:вода составляет 1:10) и смесь медленно охлаждают до комнатной температуры с периодическим перемешиванием. Затем проводят кристаллизацию с последующим охлаждением до температуры не выше +2°С. Далее процесс включает полное освобождение от растворителя и высушивание надкристаллической жидкой фазы, содержащей не менее 53.9% убихинола. Пределы исходного количественного соотношения Q₁₀:β-CD были выбраны из условия получения максимального количества восстановленной формы коэнзима Q₁₀ в искомой субстанции, способной к растворению в воде.

2.1. Приготовление искомой восстановленной формы коэнзима Q₁₀ в β-циклодекстрине из исходного соотношения Q₁₀:β-CD.

Пример 1. Растворенный восстановленный коэнзим Q₁₀ (H₂Q₁₀) вводят в водный раствор β-CD (исходное соотношение соответственно 1:18) при температуре не менее 50-53°С. Полученный высушенный образец содержит 36.1% восстановленной формы коэнзима Q₁₀ ко всей массе образца. Полный выход продукта составляет 90%.

Пример 2. Растворенный восстановленный коэнзим Q₁₀ (H₂Q₁₀) вводят в водный раствор β-CD (исходное соотношение соответственно 2:18) при температуре не менее 50-53°С. Полученный высушенный образец содержит 35.5% восстановленной формы коэнзима Q₁₀ ко всей массе образца. Полный выход продукта составляет 91%.

Пример 3. Растворенный восстановленный коэнзим Q₁₀ (H₂Q₁₀) вводят в водный раствор β-CD (исходное соотношение соответственно 4:18) при температуре не менее 50-53°С. Полученный высушенный образец содержит 35.1% восстановленной формы коэнзима Q₁₀ ко всей массе образца. Полный выход продукта составляет 89.1%.

Пример 4. Растворенный восстановленный коэнзим Q₁₀ (H₂Q₁₀) вводят в водный раствор β-CD (исходное соотношение соответственно 9:18) при температуре не менее 50-53°С. Полученный высушенный образец содержит 34.5% восстановленной формы коэнзима Q₁₀ ко всей массе образца. Полный выход продукта составляет 92.1%.

Пример 5. Предварительно восстановленный коэнзим Q₁₀ (H₂Q₁₀) и β-CD растворены в органическом растворителе с исходным соотношением соответственно 1:1. Оба компонента в растворителе вводят в водный раствор в том же объемном соотношении 1:10. В таких условиях проведения опытов полученный высушенный образец содержит 9.30% восстановленной формы коэнзима Q₁₀ ко всей массе образца. При соотношении растворенных в растворителе коэнзима Q₁₀ и β-циклодекстрина 1.5:1 и 3:1 в тех же условиях вместо образования кристаллов молекулярных комплексов наблюдается осаждение аморфной массы убихинола на стенках реакционного сосуда.

Таким образом, в описанных условиях получены почти количественные молекулярные выходы комплексов включения, которые составляют около 90%. Выход продукта на стадии (iii) - молекулярного комплекса в кристаллической фазе, составляет не менее 34.5%. Надкристаллическая жидкая фаза содержит не менее 53.9% убихинола. Избыток β-CD является условием повышения выхода продукта комплекса включения в кристаллической фазе. Возможность получения водных солюбилизированных растворов комплекса «восстановленный коэнзим Q₁₀ β-CD» и снятия УФ-спектров подтверждает связанность в молекулярный комплекс изначально не растворимой в воде восстановленной формы коэнзима Q₁₀. Полученная субстанция, таким образом, представлена в виде сухого порошка, состоящего из агрегатов молекулярных комплексов убихинола в β-циклодекстрине, с размерами частиц до 70-100 мкм. Спектральные исследования водного раствора порошка комплекса «восстановленный коэнзим Q₁₀ - β-CD» подтверждают образование молекулярных комплексов. Эти молекулярные комплексы, полученные в форме сухих порошков, представляет собой биологически активную субстанцию, обладающую аморфными свойствами. Методом лазерного малоуглового рассеяния света на приборе Коултера определены размеры молекулярных ассоциатов комплексов «восстановленный коэнзим Q₁₀ - β-CD». В водном растворе ассоциаты представляют собой различные фракции размерами от 200 до 700 нм.

3. Стабильность и окисляемость кристаллической формы комплекса.

Спектрофотометрические наблюдения окисляемости сухой формы порошка проводились по увеличению интенсивности характерного для окисленной формы коэнзима Q₁₀ максимума поглощения при 407-410 нм. Оптическая плотность водного раствора порошка изначально составляла ≈0.03 и увеличивается в течение 40 суток, достигая предельных значений к 3-м месяцам. Таким образом, сухой кристаллический порошок комплекса «восстановленный коэнзим Q₁₀ - β-CD» значительно медленней окисляется на воздухе и свету, чем свободный восстановленный коэнзим Q₁₀. Наибольшей стабильностью обладают образцы порошков комплекса «восстановленный коэнзим Q₁₀ - β-CD» под слоем водной фазы с растворенной аскорбиновой кислотой. Период сохранности восстановленного коэнзима Q₁₀ прямо связан с содержанием в воде АК. Поэтому введение аскорбиновой кислоты в водные препараты с полученными молекулярными комплексами является простым, регулируемым и надежным способом для увеличения стабильности связанного в комплексы восстановленного коэнзима Q₁₀.

3.1. Антирадикальная активность как мера способности к окислению восстановленного коэнзима Q₁₀. Проведенные измерения антирадикальной активности свободного восстановленного коэнзима Q₁₀ и его комплекса с β-циклодекстрином хемилюминесцентным методом при варьировании концентрации коэнзима Q₁₀ в интервале от 3 до 45 мкМ, показали, что свободный восстановленный коэнзим Q₁₀ обладает в ~10 раз более высокой антирадикальной активностью в отношении пероксирадикалов инициатора в цепном процессе инициируемого окисления, чем его комплекс с β-циклодекстрином. А, значит, свободный убихинол в 10 раз быстрее окисляется, чем связанный в комплекс восстановленный коэнзим Q₁₀. Тем самым, комплексы восстановленного коэнзима Q₁₀ с β-циклодекстрином являются более устойчивыми к окислению. Кроме того, такое значительное (~10 раз) уменьшение способности к окислению восстановленного коэнзима Q₁₀ в комплексе с β-CD по сравнению со свободным убихинолом является дополнительным свидетельством связывания его в комплекс, а также подтверждением включения химически активных ОН-групп фенильного кольца убихинола в полость β-CD. Наиболее полная стабилизация молекулярных комплексов «восстановленный коэнзим Q₁₀ - β-CD» в водной фазе достигается добавлением избытка восстановителя - аскорбиновой кислоты.

Литература

1. Zmitek J., Smidovnik A., Fir M. et al. Relative bioavailability of two forms of a novel water-soluble coenzyme Q₁₀. // J. Nutr. Metab. - 2008. - Vol. 52, №4. - P.281-287.

2. Kagan D., Madhavi D. A study on the bioavailability of a novel sustained-release coenzyme Q₁₀.-β-cyclodextin complex. // Integr. Med. - 2010. - Vol. 9, №1.

Изобретение относится к области химико-фармацевтической и пищевой промышленности, а именно к области создания порошкообразных и капсульных форм препаратов, обладающих антигипоксантным и антиоксидантным действием. Получаемая по настоящему изобретению субстанция представляет собой биологически активную порошковую форму достаточно стабильных молекулярных комплексов включения восстановленного коэнзима Q₁₀ в β-циклодекстрине с размерами частиц до 70-100 мкм, обладающую в 10 раз меньшей способностью к окислению по сравнению со свободным восстановленным коэнзимом Q₁₀ и легко переходящую в водном растворе в солюбилизированную форму с размерами частиц 200-700 нм. Эти молекулярные комплексы способны к солюбилизации в воде и являются более стабильными (защищены от окисления) по сравнению с нерастворимым в воде и быстро окисляющимся свободным восстановленным коэнзимом Q₁₀. Также заявлен способ получения вышеуказанной субстанции, содержащей комплексы «восстановленный коэнзим Q₁₀ - β-циклодекстрин», включающий последовательные стадии (i) получения восстановленной формы коэнзима Q₁₀ в присутствии избытка аскорбиновой кислоты; (ii) смешивания реакционного раствора, полученного на стадии (i), с водным раствором β-циклодекстрина для получения молекулярных комплексов включения; (iii) охлаждения, кристаллизации смеси, полученной на стадии (ii), и освобождения от растворителя и воды. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 5 пр.

1. Способ получения субстанции, содержащей комплексы «восстановленный коэнзим Q₁₀ - β-циклодекстрин», отличающийся тем, что включает последовательные стадии (i) получения восстановленной формы коэнзима Q₁₀ в присутствии избытка аскорбиновой кислоты; (ii) смешивания реакционного раствора, полученного на стадии (i), с водным раствором β-циклодекстрина для получения молекулярных комплексов включения; (iii) охлаждения, кристаллизации смеси, полученной на стадии (ii), и освобождения от растворителя и воды.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (i) для получения восстановленного коэнзима Q₁₀ используется избыток аскорбиновой кислоты при соотношении мольного количества аскорбиновой кислоты и коэнзима Q₁₀ от 40:1 и выше.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (i) использует оптимально удобный растворитель для полного и одновременного растворения экстремально гидрофобных (коэнзима Q₁₀) и гидрофильных соединений (аскорбиновой кислоты).

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (i) достигается выход восстановленного коэнзима Q₁₀, близкий к количественному (~96-98%).

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что для получения молекулярных комплексов на стадии (ii) проводится смешение реакционного раствора восстановленного коэнзима Q₁₀ (молекул-«гостя») и водного раствора β-циклодекстрина (молекул-«хозяина»).

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (ii) объемное соотношение реакционного и водного раствора в получаемой смеси не превышает 1:10.

7. Способ по п.1, включающий на стадии (iii) медленное охлаждение и выдерживание полученной на стадии (ii) смеси при температуре не выше +2°С до получения стабильной кристаллической фазы.

8. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию отделения полученной на стадии (ii) кристаллической фазы, ее фильтрования, освобождения от растворителя и воды в постоянном токе воздуха.

9. Способ по п.1, в котором выход продукта на стадии (iii) молекулярного комплекса в кристаллической фазе составляет не менее 34.5%.

10. Способ по п.1, в котором суммарный выход продукта на стадии (iii) в кристаллической и жидкой фазах составляет не менее 90%.

11. Способ по п.1, дополнительно включающий на стадии (iii) полное освобождение от растворителя и высушивание надкристаллической жидкой фазы, содержащей 53.9% убихинола.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что позволяет получить комплексы «восстановленный коэнзим Q₁₀ - β-циклодекстрин» в форме сухих порошков, способных к солюбилизации в воде.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что позволяет получить молекулярные комплексы «восстановленный коэнзим Q₁₀ - β-циклодекстрин» в удобной для таблетирования и капсулирования форме сухих порошков с содержанием восстановленного коэнзима Q₁₀, соответствующего одноразовой дозе приема.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что достаточно прост технологически и не требует сложного технического оснащения и оборудования.

15. Субстанция, полученная по способу п.1, отличающаяся тем, что представляет собой биологически активную, порошковую форму достаточно стабильных молекулярных комплексов включения восстановленного коэнзима Q₁₀ в β-циклодекстрине с размерами частиц до 70-100 мкм, обладающую в 10 раз меньшей способностью к окислению по сравнению со свободным восстановленным коэнзимом Q₁₀ и легко переходящую в водном растворе в солюбилизированную форму с размерами частиц 200-700 нм.