ФУНГИЦИДНОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2014 года по МПК C07D239/545 C07C215/10 A61P31/10 A01P3/00 

Изобретение относится к средствам для уничтожения грибов и может быть использовано для лечения заболеваний, вызванных грибами, а также предотвращения порчи грибами различных материалов и сельскохозяйственных продуктов.

Весьма серьезной проблемой современной медицины, ветеринарии и растениеводства является лечение грибковых, а также бактериальных и вирусных заболеваний, многие из которых крайне плохо поддаются терапии. Это объясняется недостаточной эффективностью известных препаратов, а также быстрая изменчивость микробов, приводящая к появлению устойчивых форм, Fidel P.L. Jr, Vazquez J.A., Sobel J.D. Candida glabrata: review of epidemiology, pathogenesis and clinical disease with comparison to C.albicans 1999, 1:80-96. White T. Antifungal drug resistance in Candida albicans ASM News 8:427-433.

Указанное выше актуально для ветеринарии и промышленности, поскольку происходит порча продуктов, связанная с развитием и распространением микроорганизмов.

Известен ряд препаратов для лечения грибковых заболеваний: нистатин, амфотерицин B, флюконазол и тербинафин (Энциклопедия лекарств РЛС - 2009. Москва, стр.928). Каждый из них имеет существенные недостатки. Флюконазол проявляет, главным образом, фунгистатический эффект и практически не обладает фунгицидными свойствами [Pharmaceutical microbiology. Ed. by W.B.Hugo and A.D.Rassel Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1987, 511 p.]. Флюконазол также может применяться для предотвращения порчи грибами растений и сельскохозяйственных продуктов. Известно также применение флюконазола в архивном деле для обработки бумаги.

Главным недостатком нистатина является низкая активность против многоклеточных грибов.

Амфотерицин B является активным противогрибковым препаратом, однако он весьма токсичен.

Известно фунгицидное средство, отличающееся тем, что представляет собой соль 2,4-диоксо-5-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензилидиен)амино-1,3-пиримидина:

или ее димер:

где X выбран из ряда: Na⁺, K⁺, Li⁺, NH₄ ⁺, RU 2448960 C1.

Данное техническое решение принято в качестве прототипа настоящего изобретения.

Препарат обладает выраженной противогрибковой активностью широкого спектра действия.

Однако это вещество очень плохо растворяется как в водной среде, так и в жирах. Растворимость известного препарата в воде составляет не более 0,002%, а в жирах - не более 0,001% (октанол, являющийся общепринятой моделью липидов). Низкая растворимость фунгицидного средства-прототипа обусловлена тем, что это вещество имеет большие размеры частиц: длина - 30 мкм, сечение - около 300 нм, что не способствует растворению вещества ни в водной среде, ни в жирах. Растворы с такой концентрацией активного вещества недостаточно эффективны. Вместе с тем чрезвычайно актуальна задача повышения эффективности использования фунгицидного препарата в виде растворов для применения в медицине и ветеринарии в форме ингаляций и инъекций и для обработки различных материалов и сельскохозяйственных продуктов.

Задачей настоящего изобретения является создание фунгицидного средства широкого спектра действия с более высокой растворимостью и тем самым повышение эффективности его использования в виде растворов.

Согласно изобретению поставленная задача решается путем синтеза фунгицидного средства, которое представляет собой ассоциат соли 5-[3,5-дихлор-2-гидроксибензилиден)амино]-4-гидрокси-1H-пиримидин-2-она с 1,2,3,4,5-пентагидрокси-6-метиламиногексаном.

Заявителем не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «Новизна».

Длина 70% частиц заявленного вещества не превышает 10 мкм, что обеспечивает важное новое свойство объекта (технический результат): повышение растворимости в воде до концентраций 0,3-0,4%, а в масляных растворах - до 0,25-0,3% (более чем в 100 раз), что позволяет существенно повысить эффективность использования растворов препарата.

Указанные обстоятельства доказывают, по мнению заявителя, соответствие заявленного технического решения условию патентоспособности «Изобретательский уровень».

0,1% раствор заявленного вещества получали следующим образом.

В колбу поместили 0,04 г едкого натра и 10 мл 96% этанола. Смесь нагревали до полного растворения едкого натра. К полученному раствору добавили порциями 0,127 г 5-аминоурацила при температуре 40°C. Затем полученную массу нагревали на кипящей водяной бане до полного растворения аминоурацила. Кроме того, в 40 мл 96% этанола растворяли 0,191 г 3,5-дихлорсалицилового альдегида. Полученный раствор по каплям при перемешивании добавили к раствору натриевой соли 5-аминоурацила. После образования осадка оранжево-красного цвета реакционную массу продолжали нагревать в течение 1,5 ч, после охлаждения реакционной массы до комнатной температуры осадок отфильтровывали, промывали 10 мл 96% этанола и высушивали. Полученный осадок переносили в колбу, содержащую заранее приготовленный раствор 0,195 1,2,3,4,5-пентагидрокси-6-метиламиногексана в 300 мл воды. Реакционную смесь перемешивали при t=40°C до полного растворения осадка. Полученный раствор охлаждали до комнатной температуры.

Получение растворов заявленного вещества большей концентрации аналогично.

Для воздействия на грибы в медицинских, ветеринарных и сельскохозяйственных целях использовали водные и масляные растворы препарата с концентрацией 0,1%.

Для предотвращения порчи грибами различных материалов использовали водные растворы с концентрацией 0,3%.

Приемлемыми растворителями и транспортерами, кроме воды, могут быть изотонический раствор хлорида натрия, раствор Рингера и т.п., при этом стабилизатором может служить бензиловый спирт или любое подходящее для этого вещество, активатором всасывания, чтобы увеличить биодоступность, могут быть фторкарбоны. Для создания масляного раствора препарата нужно использовать нелетучие растительные масла, которые обычно применяют для создания масляных растворов или суспензии.

Для этой цели подходит любое нейтральное нелетучее масло, включая синтетические моно- и диглицериды, жирные кислоты. Для создания инъекционных препаратов можно использовать олеиновую кислоту и глицериды, оливковое или касторовое масла, особенно их полиоксиэтилированные производные. В состав масляных растворов и суспензий могут также входить в качестве стабилизаторов и детергентов длинноцепочечные спирты или другие схожие с ними вещества. Если лекарственная форма производится в виде водной суспензии для ингаляции или назальных спреев, то к действующему веществу можно добавить эмульгаторы и вещества, придающие препарату сладкий вкус, приятный запах и цвет.

Пример 1

Лечение заболеваний дыхательных путей

Исследования проводили на белых беспородных мышах (самки, 6-8 нед.), полученных из питомника «Рапполово» (Ленинградская обл.), которых содержали до начала экспериментов под наблюдением в течение двух недель на стандартном рационе в регламентированных условиях вивария. Подбор животных в группы опыта проводили методом случайной выборки.

Для воспроизведения аспергиллезной пневмонии белые беспородные мыши получали однократно внутрибрюшинно раствор циклофосфана (150 мг/кг). Через 3 суток мышам вводили однократно внутрибрюшинно раствор гидрокортизона (250 мг/кг). Через сутки после введения гидрокортизона мышей интраназально под эфирным наркозом инфицировали суспензией Aspergillus niger (приблизительно 10⁷ кл/мл).

На 5 сутки после инфицирования по 5 животных из каждой группы брали для изучения микробного обсеменения легких (эвтаназию у грызунов осуществляли передозировкой эфира). Из тканей легких готовили гемогенаты, в которых определяли титр грибов рода Aspergillus. Наблюдение за оставшимися мышами проводили в течение 14 суток после инфицирования для учета смертности.

В эксперименте были сформированы следующие группы животных, инфицированных Aspergillus niger.

1. Контрольные группы: K1, K2, K3; животные получали аэрозоль изотонического раствора хлорида натрия.

2. Группы E1, E2, E3; животные получали водный раствор 0,1% заявленного препарата в форме ингаляций.

3. Группы П1, П2; животные получали водный раствор фунгицидного средства-прототипа в форме ингаляций в концентрациях соответственно 0,002% и 0,001%).

Животных помещали в аэрозольные камеры (12 л) сроком на 30 минут, в течение которых через легкие проходит 500 мл воздуха.

В качестве генератора аэрозоля использовали ультразвуковой распылитель «OMRON U1» (Япония). Для поддержания постоянной концентрации аэрозоля в объеме камеры использовали импульсный режим распыления с помощью вихревого пневматического генератора, получая стойкий аэрозоль с размером частиц 3 мкм. Животных помещали в иммобилизационые контейнеры и экспонировали с полученным аэрозолем в течение 30 минут раз 1 в сутки в течение 3 дней, начиная с 1 суток после инфицирования.

Из образцов гемогенизированных тканей легкого готовили ряд последовательных разведений с последующим высевом на среду Сабуро. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1 Группы животных Число колоний (в разных разведениях) 10^-2 10^-4 10^-6 K1 75 2 - K2 64 2 - K3 48 - - E1 4 - - E2 4 - - T3 2 - - П1 26 1 - П2 37 2 -

Указанные выше результаты подтверждают эффективное противогрибковое действие заявленного фунгицидного средства.

Пример 2

Лечение грибкового заболевания кожи - Разноцветный лишай (tinea versicolor, pityriasis versicolor)

Заболевание вызвано грибом Pityrosporum orbiculare - Malassezia furfur (мицелиалъная форма).

Для исследования были приготовлены: масляный (оливковое масло) 0,1% раствор заявленного препарата и водный 0,002% раствор вещества-прототипа. В качестве контроля использовано оливковое масло. В исследовании участвовали 3 группы пациентов. Каждая группа включала по 2 пациента с данной патологией. Продолжительность лечения составила 7 дней. Препарат наносили ватным тампоном 2 раза в сутки - утром и вечером.

Критерием микологической излеченности считали отсутствие дрожжевой и мицелиальной форм грибков рода Malassezia, а критерием полной излеченности - отсутствие клинической симптоматики и грибов рода Malassezia в кожных чешуйках, полученных с поверхности кожи на месте разрешившихся очагов поражения.

Результаты исследования приведены в таблице 2.

Таблица 2 Препарат Микологическая излеченность Полная излеченность 1 2 3 Контроль Отсутствует Отсутствует

1 2 3 Заявленный препарат Дрожжевая и мицелиальная формы грибов рода Malassezia отсутствуют Достигнута Прототип Незначительное уменьшение дрожжевой и мицелиальной форм грибов рода Malassezia Отсутствует

Таким образом, выраженный положительный эффект достигнут только при использовании заявленного препарата.

Пример 3

Лечение кандидозного вульвовагинита

В эксперименте проводили лечение лиц с кандидозным вульвовагинитом, вызванным грибами рода Candida, с использованием водных растворов: 1) заявленного препарата - 0,1% раствор (3 человека), 2) средства-прототипа - 0,002% раствор (3 человека).

Лечение в виде двукратных (утром и вечером) спринцеваний проводили в течение 7 дней. Эффективность терапии оценивали по клинической картине и результатам микологического обследования (посевы на среду Сабуро).

Результаты исследования приведены в таблице 3.

Таблица 3 Препарат Микологическая излеченность Полная излеченность Заявленный Десятикратное снижение количества грибов, высеваемых на плотную среду. Достигнута Прототип Снижение количества грибов, высеиваемых на плотную среду в 1,7 раза. Не достигнута

Таким образом, применение заявленного препарата позволяет достичь полной излеченности кандидозной инфекции, в то время как у больных, получавших водный раствор вещества-прототипа, зарегистрировано некоторое снижение обсемененности грибом при сохранении основных жалоб и проявлений инфекции.

Пример 4

Лечение грибковых поражений растений

Исследование проведено на бегонии клубневой (Begonia tuberosa hybridum), зараженной мучнистой росой. Мучнистая роса поражает многие растения, в том числе деревья и кустарники. Мучнистая роса поражает хризантемы, бегонии, розы, при этом на зеленых частях растений появляется белый, порой темнеющий, налет. Болезнь передается спорами по воздуху.

Испытуемые растения были заражены спорами гриба (Leveillula taurica) при выдерживании до появления на листьях белого налета. Заражены были три листа на каждом растении. После появления налета растения контрольной группы (три растения) изолировали от трех растений, получавших терапию в виде обработки спреем, представляющим собой 0,1% водный раствор заявленного препарата. Обработку проводили один раз в день в течение 7 дней. После завершения обработки наблюдение за растениями было продолжено еще в течение трех недель. В ходе наблюдения у контрольных растений зарегистрировано увеличение количества налета, представляющего собой мицелий гриба, и количество пораженных листьев увеличилось в среднем до 5-7, при этом налет покрывал и стебли растения. У растений, обработанных испытуемым веществом, увеличение и распространение гриба на другие части растения не происходило. При смыве с листа и посеве на питательную среду роста грибов не зарегистрировано.

Пример 5

Лечение грибковых поражений животных

Препарат использован при лечении дерматомикоза кошек (два животных), вызванного грибом рода Microsporum и характеризующегося появлением на мордочке и ушках небольших округлых залысин. Препарат в виде водного 0,1% раствора наносили на пораженную область 3 раза в день в течение 6 дней.

В результате лечения зоны поражения перестали увеличиваться, зарегистрировано исчезновение проявлений воспаления. Высевы смывов с пораженного участка после проведенного лечения роста на питательных средах не дали.

Таким образом, использование заявленного препарата оказалось эффективным для лечения дерматомикоза, вызванного грибом Microsporum.

Пример 6

Защита строительной древесины от грибкового поражения

Для испытания препарата были использованы доски размером 20x40x2 см. Доски были разделены на три группы. Группа 1: доски пропитаны водным 0,3% заявленного препарата. Пропитку проводили двухкратным нанесением раствора распылителем с промежуточной просушкой. Группа 2: доски пропитаны водным 0,02% раствором препарата-прототипа. Пропитку проводили двухкратным нанесением раствора распылителем с промежуточной просушкой. Группа 3 (контроль): доски пропитаны дистиллированной водой. Пропитку проводили двухкратным нанесением воды распылителем с промежуточной просушкой.

Высушенные после обработки доски замачивали в течение двух часов в воде, после чего на них на разных концах одной стороны наносили культуры грибов Aspergillus niger и Penicillium notatum. Доски помещали на 5 дней в термостаты при температуре 30°C во влажной среде. После инкубации доски подвергали визуальному контролю и с их поверхности делались высевы на питательную среду (Сабуро).

В результате установлено, что на досках контрольной группы или обработанных водным 0,02% раствором вещества-прототипа можно обнаружить рост засеянных тест-микробов, которые затем давали рост на питательной среде. На досках, пропитанных 0,3% раствором заявленного фунгицидного средства, рост тест-микробов не зарегистрирован, а контрольные высевы не дали роста на питательной среде.

Изобретение относится новому фунгицидному средству, представляющему собой ассоциат соли, указанной ниже структурной формулы. Средство может быть использовано для уничтожения грибов и при лечении заболеваний, вызванных грибами, а также для предотвращения порчи грибами различных материалов и сельскохозяйственных продуктов. Фунгицидное средство представляет собой ассоциат 5-[3,5-дихлор-2-гидроксибензилиден)амино]-4-гидрокси-1H-пиримидин-2-она с 1,2,3,4,5-пентагидрокси-6-метиламиногексаном и соответствует следующей формуле:

Указанное фунгицидное средство обладает широким спектром действия и высокой растворимостью, что повышает эффективность его использования в виде растворов. Соединения были выделены в кристаллическом виде, и их структура доказана спектрами протонного магнитного резонанса в диметилсульфоксиде. 2 табл., 6 пр.

Фунгицидное средство, представляющее собой ассоциат соли 5-[3,5-дихлор-2-гидроксибензилиден)амино]-4-гидрокси-1H-пиримидин-2-она с 1,2,3,4,5-пентагидрокси-6-метиламиногексаном