ФУНГИЦИДНОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2012 года по МПК C07D239/545 A01N43/54 A01P3/00 A61P31/10 A61K9/06 A61K9/12 A61K9/70 A61P9/02 

Изобретение относится к средствам для уничтожения грибов и может быть использовано для лечения заболеваний, вызванных грибами, а также предотвращения порчи грибами различных материалов и сельскохозяйственных продуктов.

Как известно, одну из наиболее серьезных проблем современной медицины, ветеринарии и растениеводства представляют грибковые, а также бактериальные и вирусные заболевания, многие из которых крайне плохо поддаются лечению. Это связано как с недостаточной эффективностью существующих препаратов, так и их быстрой изменчивостью микробов, приводящей к появлению устойчивых форм, Fidel P.L. Jr, Vazquez J.A., Sobel J.D. Candida glabrata: review of epidemiology, pathogenesis and clinical disease with comparison to C.albicans 1999, 1:80-96. White Т. Antifungal drug resistance in Candida albicans ASM News 8:427-433.

Схожие проблемы актуальны для ветеринарии и промышленности, где широко распространена порча продуктов, связанная с развитием и распространением микроорганизмов. Наиболее известными препаратами для лечения грибковых заболеваний являются нистатин, амфотерицин В, флюконазол и тербинафин (Энциклопедия лекарств РЛС-2009, РЛС, 2009, Москва, стр.928). Вместе с тем, каждый из препаратов имеет определенные недостатки. Флюконазол, несмотря на широкий спектр действия, проявляет, главным образом, фунгистатический эффект [Pharmaceutical microbiology. Ed. by W.B.Hugo and A.D.Russel Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1987, 511 p.]. Флюконазол также применяется для предотвращения порчи грибами растений и сельскохозяйственных продуктов. Известно также применение флюконазола в архивном деле для обработки бумаги. Тербинафин не убивает дрожжеподобные грибы. Это крайне затрудняет использование этих препаратов для лечения людей с ослабленной иммунной системой. Другим распространенным препаратом является нистатин. Его главным недостатком следует считать низкую активность против многоклеточных грибов. Наиболее активным противогрибковым препаратом является амфотерицин В, однако он является крайне токсичным и плохо переносимым пациентами при лечении различных микозов.

В качестве прототипа настоящего изобретения принят препарат флюконазол - 2-(2,4-дифторфенил)-1,3-бис(1Н-1,2,4-триазол-1-ил)-2-пропанол) (http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A4%D0%BB%D1%83%D0% BA%D0%BE%D0%BD%D0%B0%D0%B7%D0%BE%D0%BB).

Задачей настоящего изобретения является создание эффективного препарата с противогрибковой активностью широкого спектра действия.

Согласно изобретению поставленная задача решается путем синтеза фунгицидного средства, которое представляет собой соль 2,4-диоксо-5-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензилидиен)амино-1,3-пиримидина общей формулы:

или ее димер:

,

где Х выбран из ряда: Na⁺, К⁺, Li⁺, NH₄ ⁺.

Заявителем не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «Новизна».

Синтез заявленного вещества.

К 21,5 г 5-аминоурацила (0.17 моль) прибавили 7 г едкого натра (0.175 моль), растворенного в 350 мл воды. Смесь нагрели на кипящей водяной бане до полного растворения 5-аминоурацила. Затем к реакционной массе при температуре кипящей водяной бани порциями при перемешивании добавили 32 г 3,5-дихлорсалицилового альдегида (0.17 моль), растворенного в 150 мл горячего этанола. Для количественного перенесения альдегида в реакционную колбу посуду, в которой его растворяли, обмыли 50 мл этанола. При этом в колбе выпадал осадок оранжево-красного цвета. Затем реакционную массу перемешивали еще в течение 30 минут на водяной бане, охлаждали постепенно до комнатной температуры. Полученный осадок отфильтровали, промыли последний 300 мл этанола и высушили. Из фильтрата на роторном испарителе отогнали 600 мл водного этанола. Из оставшейся смеси отфильтровали на фильтре Шотта 75,5 г целевого соединения.

Выход целевого продукта, от теоретически возможного, составил 98%.

Аналогично получают калиевую, литиевую и алюминиевую соли 2,4-диоксо-5-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензилидиен)амино-1,3-пиримидина.

Получение димера натриевой соли 2,4-диоксо-5-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензилидиен)амино-1,3-пиримидина осуществляется следующим образом.

В колбу помещали 0,4 г едкого натра и 100 мл 90%-ного этанола. Смесь нагревали при 40°C до полного растворения едкого натра. Для удаления нерастворенных карбоната и хлорида натрия реакционную массу очищали фильтрованием. К полученному раствору добавляли порциями 12.7 г 5-аминоурацила при температуре 40°C. Полученную реакционную массу перемешивали на кипящей водяной бане до полного растворения аминоурацила. Параллельно в 400 мл 90%-ного этанола растворяли 19.1 г 3.5-дихлорсалицилового альдегида. Полученный раствор по каплям при перемешивании и температуре кипящей водяной бани добавляли к раствору натриевой соли 5-аминоурацила. Практически сразу начинал выпадать осадок оранжево-красного цвета. После прибавления всего спиртового раствора альдегида реакционную массу продолжали нагревать на кипящей водяной бане в течение 0.5 ч. После охлаждения реакционной массы до комнатной температуры осадок отфильтровывали, промывали 100 мл 96%-ного этанола и высушивали. Выход целевого продукта составлял 98%.

Аналогично получают димеры других солей 2,4-диоксо-5-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензилидиен)амино-1,3-пиримидина.

Для воздействия на грибы используют различные растворы или другие формы, приготовленные на основе заявленного фунгицидного средства.

Фармацевтические соединения для лечения заболеваний, вызываемых грибами, которые можно изготовить из заявленного вещества, включают их фармацевтически приемлемые соли, фармацевтически приемлемые наполнители, адъюванты и транспортеры. Вещества, которые можно использовать в соединениях с заявленным веществом, могут включать поливинилпирролидон, метилцеллюлозу, оксипропилметилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, натрийкарбоксиметилцеллюлозу и некоторые другие вещества: кукурузный крахмал, тальк, каолин, бентониты, аэросил, сахар свекловичный, сахар молочный, натрия хлорид, натрия гидрокарбонат и некоторые другие.

Фармацевтически приемлемые соли, фармацевтически приемлемый наполнитель, адъювант, транспортер могут включать обменные ионы, окись алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, буферные растворы, такие как фосфаты, глицин, сорбиновую кислоту, сорбат калия, частичную смесь глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли и электролиты, такие как сульфат протамина, Na₂HPO₄, K₂HPO₄, хлорид натрия, соли цинка, коллоидную двуокись кремния, трисиликат магния, поливинила пирилидон, полиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу натрия, воск, полиэтилен-полипропилен блок-полимеры и ланолин.

Фармацевтические препараты, включающие заявленное вщество, можно применять перорально, парэнтерально при помощи спрея, местно, ректально, назально, лингвально, вагинально или при помощи имплантатов.

Фармацевтические средства на основе изобретения могут быть изготовлены в виде стерильного препарата для инъекций как в виде водного раствора, так и в виде масляной суспензии. Эта суспензия может быть создана известным способом, применяющимся для изготовления подобных лекарственных форм, с использованием любых подходящих детергентов и других вспомогательных веществ (твин-80). Для стерильного препарата как в виде раствора, так и в виде суспензии растворителем или жидкой основой может служить любое нетоксичное парэнтерально приемлемое вещество, например, 1,3-бутанедиол. Приемлемыми транспортерами и растворителями могут быть маннитол, вода, раствор Рингера и изотонический раствор натрия хлорида. Для создания масляного раствора вещества нужно использовать нелетучие растительные масла, которые традиционно применяют для создания масляных растворов или суспензий. Для этой цели подходит любое нейтральное нелетучее масло, включая синтетические моно- и диглицериды, жирные кислоты. Для создания инъекционных препаратов можно использовать олеиновую кислоту и глицериды, оливковое или касторовое масла, особенно их полиоксиэтилированные производные. В состав масляных растворов и суспензий могут также входить в качестве стабилизаторов и детергентов длинноцепочечные спирты или другие схожие с ними вещества.

Фармацевтические препараты на основе изобретения могут назначаться пероорально в любой без ограничения приемлемой для перорального применения дозировке и форме, включая капсулы, таблетки, водные растворы и суспензии. В случае таблеток в качестве наполнителя можно использовать лактозу и кукурузный крахмал. В качестве технологической добавки можно использовать стеарат магния. Если препарат для перорального применения производится в виде капсулы, то в качестве наполнителей применяют лактозу и кукурузный крахмал. Если лекарственная форма производится в виде водной суспензии, то к действующему веществу можно добавить эмульгаторы и вещества, придающие препарату сладкий вкус, приятный запах и цвет.

Фармацевтические препараты на основе изобретения могут назначаться в форме суппозиториев для ректального или вагинального применения. Эти лекарственные формы могут быть приготовлены путем смешивания заявленного вещества с подходящим нераздражающим наполнителем, твердым при комнатной температуре, но размягчающимся при ректальной или вагинальной температуре. В качестве наполнителей могут быть использованы масло какао, пчелиный воск, полиэтиленгликоли.

В фармацевтических препаратах для нанесения на кожу действующее вещество следует сочетать с подходящей мазевой основой, в которой это вещество может находиться в растворенном состоянии или в виде суспензии. Мазевая основа может включать минеральные масла, жидкий вазелин, белый вазелин, пропиленгликоль, смесь полиоксиэтилена и полиоксипропилена, эмульгирующий воск и воду, а также кремы. Фармацевтические препараты на основе заявленного вещества могут также быть применимы к нижним отделам кишечника в виде ректальных суппозиториев или другой подходящей лекарственной формы.

На основе заявленного вещества могут также быть созданы такие лекарственные формы для наружного применения, как пластырь, назальные аэрозоли или ингаляторы. Такие формы можно создать, используя уже существующие технологии, применяемые для производства подобных форм. В качестве жидкой фазы для растворения заявленного вещества можно использовать изотонический раствор хлорида натрия (физиологический раствор), при этом стабилизатором может служить бензиловый спирт или любое подходящее для этого вещество, активатором всасывания, чтобы увеличить биодоступность, могут служить фторкарбоны.

Препарат, приготовленный на основе заявленного вещества, может быть использован в дозах от 0,01 до 25 мг активного вещества на 1 кг веса пациента от 1 до 5 раз в сутки.

Пролонгированные формы с эффектом усиления действия активного вещества могут быть получены на основе липосом или комплексов с полимолочной кислотой.

Заявленное фунгицидное вещество может также использоваться для лечения животных и борьбы с грибами, поражающими различные материалы, сельскохозяйственные культуры и продукты.

Примеры изучения биологической активности препаратов, приготовленных на основе заявленного фунгицидного вещества.

Пример 1. Определение минимальной подавляющей концентрации заявленного вещества (формы А и Б) на одноклеточные грибы.

Грибы выращивали на среде Сабуро. Действие вещества оценивали методом серийных разведении.

Вещество Минимальная подавляющая концентрация (мкг/мл) C.albicans С.glabrata C.krusei C.parapsilosis S.cerevisiae Флюконазол 2 64 32 0.250 0,125 А 1 0,125 1 0.250 0,125 Б 1 0,250 1 0.125 0,125

Полученные данные указывают, что заявляемое средство превосходит по активности препарат сравнения.

Пример 2. Определение минимальной подавляющей концентрации заявляемого средства на многоклеточные грибы.

Вид многоклеточных грибов Минимальная подавляющая концентрация (МПК) (мкг/мл) Флюконазол А Б Aspergillus 64 2 2 Mucor 64 1 1

Показанные данные свидетельствуют о высокой активности заявленного средства, значительно превосходящей активность препарата сравнения.

Пример 3. Оценка фунгицидного действия.

В качестве тест-микроорганизмов использовали устойчивые к дезинфицирующим средствам штаммы грибов рода кандида (Candida albicans штамм 15) и трихофитон (Trichophiton gypseum), которые выращивали на среде Сабуро.

Формы А и Б растворяли в стерильной дистиллированной воде.

Использовали метод серийных разведении в микропланшетах. Растворенное вещество титровали в питательной среде, затем вносили тест-микроорганизмы и через определенные промежутки времени обеззараживания добавляли нейтрализатор - 0,1%-ный раствор лимонной кислоты. После экспозиции 1-2 мин проводили высевы из каждой лунки на твердые питательные среды.

Изучены концентрации вещества: 0,1-0,05-0,025-0,0125% по препарату при времени действия 1, 3, 5, 10, 20, 30 минут и 1,0-1,5-3,0 и 24 ч.

Все посевы инкубировали при оптимальной температуре в течение 24 часов.

Фунгицидный эффект оценивали по наличию или отсутствию роста микроорганизмов на питательных средах.

Установлено, что заявленное вещество в формах А и Б обеспечивает гибель грибов рода трихофитон в концентрации 0,1% и кандида в концентрации 0,025% при времени воздействия 24 ч.

Препарат сравнения в указанных условиях не вызывал гибели микробов. Это соответствует данным о том, что препарат сравнения обладает только фунгистатическим эффектом.

Пример 4. Исследование концентрации заявленного вещества в плазме крови экспериментальных животных при введении заявленного вещества (формы А и Б) в виде вагинальных суппозиториев.

Усредненная динамика концентрации «С» заявленного вещества как в форме А, так и Б в плазме крови экспериментальных животных при вагинальном введении препарата (в линейных координатах) не зависит от формы (А или Б).

Разброс индивидуальных значений умеренный: коэффициент вариации CV составил 18-42% (см. фиг.1).

Таким образом при вагинальном введении вещества можно достичь не только местного действия препарата, но и его поступления в системный кровоток.

Пример 5. Концентрация заявленного вещества в плазме крови экспериментальных животных при энтеральном введении в виде капсул.

Результаты измерения концентрации «С» вещества в плазме крови кроликов при его пероральном введении (капсулы 0.15 г) в виде усредненных фармакокинетических кривых отображены на чертеже и не зависят от формы заявленного вещества.

После введения вещество начинало проникать в системный кровоток примерно через 15 минут, достигало максимального уровня через 2 часа (около 160 мкг/мл), после чего постепенно выводилось из организма и через 24 часа после введения определялось в плазме крови в минимальных количествах (около 20 мкг/мл). Разброс индивидуальных значений умеренный: коэффициент вариации CV составил 8-22% (см. фиг.2)

Пример 6. Действие заявленного фунгицидного средства на грибы, вызывающие болезни растений, а также порчу сельскохозяйственных продуктов.

В экспериментах использованы различные грибы - вегетативные формы и споры Alternaria alternata, Fusarium moniliforme, Botrytis spp. вызывающие заболевания растений, а также порчу сельскохозяйственных продуктов.

Биоцидные свойства испытаны на спорах культур грибов, оптическая плотность посевной дозы - p Е=0,310.

Споры грибов (смесь) Минимальная подавляющая (биоцидная) концентация вещества (мкг/мл) А Б Флюконазол A.alternata 4,0 2.0 32 F.moniliforme 8.0 4.0 64 Botrytis spp. 8.0 4.0 64

Пример 7. Действие заявленного фунгоцидного средства на грибы, вызывающие порчу бумаги, древесины и их красителей.

В экспериментах использованы различные грибы - вегетативные формы и споры Aspergillis niger, Penicillium ochro-chloron, вызывающие порчу бумаги, древесины и их красителей.

Биоцидные свойства испытаны на спорах культур грибов, оптическая плотность посевной дозы - p E=0,310.

Споры грибов (смесь) Минимальная подавляющая (биоцидная) концентация (МПК) вещества (мкг/мл). А Б Флюконазол Aspergillis niger 2,0 1.0 64 Penicillium ochro-chloron 8.0 4.0 64

Приведенные выше примеры подтверждают высокую активность заявленного фунгицидного средства в обеих формах (соль 2,4-диоксо-5-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензилидиен)амино-1,3-пиримидина или ее димер) в отношении грибов, вызывающих заболевания животных, растений, а также порчу сельскохозяйственных продуктов и различных материалов.

Таким образом, результаты изучения заявленного вещества показали, что оно обладает широким спектром противогрибковой активности, действует на одно- и многоклеточные грибы и их споры (трихофитоны и аспергиллы), действует на штаммы, устойчивые к дезинфектантам, оказывает фунгицидное действие. Вещество обеспечивает не только местное действие, но и поступление его в системный кровоток при использовании разных форм введения.

Изобретение относится к новому фунгицидному средству широкого действия, которое представляет собой соль 2,4-диоксо-5-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензилидиен)амино-1,3-пиримидина общей формулы:

или ее димеру:

,

где Х выбран из ряда: Na⁺, K⁺, Li⁺, NH₄ ⁺. Средство может быть использовано для лечения грибковых заболеваний, а также для предотвращения порчи грибами различных материалов и сельскохозяйственных продуктов. 2 ил.,4 табл., 7 пр.

Фунгицидное средство, отличающееся тем, что представляет собой соль 2,4-диоксо-5-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензилидиен)амино-1,3-пиримидина:

или ее димер:
,
где Х выбран из ряда: Na⁺, K⁺, Li⁺, NH₄ ⁺.