СИНТЕТИЧЕСКИЙ ИММУНОГЕН ДЛЯ ЗАЩИТЫ ОТ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НАРКОТИЧЕСКИХ И ПСИХОАКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 2014 года по МПК A61K39/385 A61K47/42 A61K47/48 A61K47/30 A61P25/30 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может применяться при токсическом действии различных форм наркотических веществ, отравлений различными ядами в промышленности и быту, при техногенных катастрофах и т.п., для терапии и профилактики злоупотреблений наркотическими и психоактивными веществами.

Известен синтетический иммуноген для терапии и профилактики злоупотреблений наркотическими веществами (в частности, опиатной зависимости), представляющий собой конъюгат в виде носителя - природного или искусственного белка и гаптена - наркотического или психотропного соединения. Причем в качестве носителя он содержит бычий сывороточный альбумин или синтетические полипептиды и гликопротеины, а в качестве гаптена - морфин, или кодеин, или героин, или метадон, или т.п. ([см. Ковалев И.Е., Полевая О.Ю. ″Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным химическим соединениям″. М.: Наука, 1985).

Однако этот иммуноген имеет балластные примеси, снижающие его терапевтическую (иммуностимулирующую) активность, требует применения больших доз (до 20 мг/кг), кроме того, продолжительность иммунизации доходит до 6 месяцев, а достижение стабильного и/или пролонгированного иммунитета не всегда возможно.

Известен принятый за прототип синтетический иммуноген для терапии и профилактики злоупотреблений наркотическими и психоактивными веществами, представляющий собой комплекс конъюгата в виде макромолекулярного носителя - природного или искусственного белка (яичный альбумин, или человеческий гамма-глобулин, или микробные токсины) и гаптена - наркотического или психотропного соединения из следующих групп низкомолекулярных соединений: ароматические пропанамины, или изохинолины, или дифенилметаны, или индоламины, или производные барбитуровой кислоты, или производные замещенных пиперидинов с полимерной матрицей, в качестве которой берут иммунокомпетентный полиэлектролит - полиоксидоний. Соотношение, вес.%: конъюгат : полиоксидоний составляет 1:1,5-5,0. Этот иммуноген имеет высокую иммунологическую активность при сокращении доз и сроков лечения до 12 месяцев (патент РФ №2236257, МПК⁷ A61K 39/385, A61K 39/39, опуб. 20.09.2004).

Однако продолжительность иммунизации (стойкость гуморального иммунитета), обеспечиваемая применением этого иммуногена, является недостаточной.

Задачей настоящего изобретения является создание иммуногена, который в течение длительного времени позволяет сохранить в организме стабильный иммунный ответ и уменьшает токсическое действие наркотиков и психоактивных веществ за счет стойкого повышения титра специфических антител к ним.

Поставленная задача решается тем, что в известном синтетическом иммуногене для защиты от токсического действия наркотических и психоактивных веществ, представляющем собой конъюгат макромолекулярного носителя, выбранного из ряда: природный или искусственный белок, олиго- и полипептид, углевод, липид или нуклеотид, и гаптена - наркотического или психотропного соединения, новым является то, что он дополнительно содержит поли(4-нитрофенил)акрилат, который ковалентно связан с коньюгатом в диапазоне соотношений от 2-х до 7-ми молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата, при этом соотношение гаптена и макромолекулярного носителя в конъюгате составляет 2-17 молей гаптена на 1 моль носителя.

В качестве макромолекулярного носителя, выбранного из группы природных белков, он содержит соединение, выбранное из ряда: овальбумин, человеческий гамма-глобулин, альбумин, лизоцим, микробные токсины, белки сыворотки крови.

В качестве гаптена он может содержать наркотическое или психотропное соединение, выбранное из ряда опиатов, например морфин, героин, кодеин, каннабиноидов, например дельта-9-тетрагидроканнабинол, амфетамина, например метамфетамин, экстази, кокаина, например бензоилэкгонин, барбитуратов, например барбамил, фенобарбитал, бензодиазепинов, например гидезепам, метадона, фенциклидина, трициклических антидепрессантов, котинина и их производных и метаболитов.

Соотношение гаптена и макромолекулярного носителя в конъюгате, составляющее 2-17 молей гаптена на 1 моль носителя, является оптимальным для получения при иммунизации более аффинных и специфических антител к этому классу гаптенов. Если соотношение меньше чем 2:1, то антитела не вырабатываются, если больше 17:1, то вырабатываются низкоаффинные неспецифичные антитела, дающие перекрестные реакции с др. классами веществ.

Заявляемый синтетический иммуноген обеспечивает эффективную иммунную реакцию за счет ковалентной связи конъюгата с поли(4-нитрофенил)акрилатом, который в стандартных условиях позволяет воспроизводить структуру иммуногена в заданном диапазоне соотношений, добиваясь увеличения длительности стойкого гуморального иммунитета до 18 месяцев.

Диапазон соотношений от 2-х до 7-ми молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата обеспечивает стандартизацию и контроль фармакологического эффекта в заданных соотношениях при формировании и укрупнении структуры иммуногена. Проведенные нами исследования показали, что при соотношении 1:1 образуется комплекс небольшого размера, не способный индуцировать стойкий гуморальный ответ и обеспечивать выработку антител, а использование соотношения конъюгата и поли(4-нитрофенилакрилата) больше чем 1:7 не позволяет образоваться стойкой ковалентной связи. Соотношение 1:7 дает максимально возможное стабильное и воспроизводимое замещение полимерной матрицы конъюгатом с гаптеном.

Использование в предлагаемом синтетическом иммуногене конкретных носителей и гаптенов защищает организм человека от действия широкого спектра токсических веществ (в том числе наркотиков, промышленных ядов, различных канцерогенов).

Анализ известных технических решений позволяет сделать вывод о том, что предлагаемое изобретение не известно из уровня исследуемой техники, что свидетельствует о его соответствии критерию ″новизна″.

Сущность настоящего изобретения для специалистов не следует явным образом из уровня техники, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию ″изобретательский уровень″.

Возможность приготовления синтетического иммуногена из доступных промышленно выпускаемых компонентов на традиционном оборудовании с помощью известных методик с достижением поставленной задачи свидетельствует о соответствии изобретения критерию “промышленная применимость”.

Таблице 1 представлены обобщенные данные по изучению специфичности антител, полученных при иммунизации кроликов синтетическими иммуногенами.

В Таблице 2 представлены данные по специфичности антител, выделенных аффинной хроматографией из сыворотки крови больных опийной наркоманией, где * - специфичность составляет менее 0,001.

В таблице 3 представлены данные по определению константы аффинности (Ка) для антител к морфину, выделенных из сыворотки крови доноров и больных опийной наркоманией.

В таблице 4 представлены составы предлагаемого синтетического иммуногена и известного взятого за прототип, а также их фармакологические действия.

В настоящем изобретении под термином ингибитор понимается вещество, которое используют в процедуре конкурентного ИФА для оценки специфичности и аффинности антител. В качестве ингибиторов использовали соединения, структурно родственные гаптену, входящему в состав заявленного иммуногена, а также наркотические вещества и ряд психотропных лекарственных препаратов другой химической природы. Это метадон, псевдоэфедрин, норэфедрин, барбамил, канабинол, морфин, героин, кодеин и др.

Приведенные примеры подтверждают, но не ограничивают заявляемое изобретение.

Синтез конъюгатов макромолекулярных носителей с гаптенами.

Введение карбоксилсодержащих производных, способствующих проведению реакции связывания гаптена с макромолекулярным носителем, для опиатов, кокаина, барбитуратов, бензодиазепинов осуществляли путем их взаимодействия с хлорпроизводными уксусной и янтарной кислот в абсолютированном растворителе.

Синтез карбоксильных производных каннабиноидов, амфетамина, метадона, фенциклидина, трициклических антидепрессантов, котинина проводили по реакции диазотирования с п-аминобензойной кислотой.

На основе модифицированных наркотикотических и психотропных веществ приготовлены конъюгаты, в которых эти вещества ковалентно связанны с макромолекулярными носителями.

Реакции конденсации карбоксилсодержащих производных гаптенов с макромолекулярным носителем осуществляли методом активированных эфиров либо с использованием водорастворимого карбодиимида, глутарового альдегида или изобутилхлорформиата. Макромолекулярные носители содержали перечисленные выше гаптены в диапазоне соотношений от 2:1 до 17:1 молей гаптена на моль макромолекулярного носителя. Методом очистки синтезированных конъюгатов была использована колоночная гель-хроматография (сефадекс G-25).

Количество молей гаптена, связавшихся с макромолекулярным белковым носителем, определяли с помощью сравнительного спектрального анализа в ультрафиолетовой и видимой областях.

Пример 1. Синтез конъюгата морфина с овальбумином

Раствор 50 мг (0,001 ммоль) овальбумина в 5,0 мл дистиллированной воды смешивали с 2,0 мл димтелформамида (ДМФА), содержащего 15,0 мг (0,039 ммоль) 6-(3-(аминогексиламинокарбонил)-пропионат)морфина и при охлаждении по каплям прибавляли раствор 15 мг (0,055 ммоль) водорастворимого карбодиимида в 3 мл дистиллированной воды. Реакционную смесь инкубировали в течение 5 час при 4°C. Полученный конъюгат выделяли гель-хроматографией на колонке с сефадексом G-25 и лиофильно высушивали.

Получено 25 мг конъюгата морфина с овальбумином (М-ОВА), содержащего 5 молей морфина на моль белка.

Пример 2. Синтез конъюгатов амфетамина с овальбумином

Производное d,1-1-фенил-2-аминопропан (5 мг; 0,112 ммоль) и (10 мг; 0,00022 ммоль) овальбумина растворяли в 3,0 мл 0,1 М фосфатного буфера. По каплям при перемешивании к реакционной смеси добавляли 70 мкл (0,3 ммоль) раствора глутарового альдегида при комнатной температуре. Постепенно реакционная смесь приобретала характерную желтую окраску, свидетельствующую об окончании реакции. Для остановки реакции к смеси добавляли 40 мкл 1М раствора лизина и инкубировали в течение 1 часа. Полученный конъюгат диализовали против фосфатного буфера в течение ночи при температуре 4°C. Выделение конъюгата проводили гель-хроматографией на колонке с сефадексом G-25 и лиофильно высушивали. Получено 5 мг конъюгата, содержащего 12 молей амфетамина на моль белка.

Пример 3. Синтез конъюгата кокаина с овальбумином

Конъюгат кокаина с овальбумином (Кок-ОВА) получали по методике примера 1 из 50 мг (0,001 ммоль) овальбумина и 2,0 мг (0,005 ммоль) бензоилэкгонина.

Получено 29 мг конъюгата Кок-ОВА, содержащего 14 молей кокаина на моль белка.

Пример 4. Синтез конъюгата тетрагидроканнабинола с овальбумином

К раствору 15 мг (3,3×10^-3 ммоль) овальбумина в 3 мл дистиллированной воды прибавили раствор 7,4 мг (0,02 ммоль) вещества дельта-9-тетрагидроканнабинола, модифицированного реакцией азосчетания с п-аминобензойной кислотой в 1 мл ДМФА, охладили реакционную смесь до 0°C и при перемешивании прибавили 5 мг водорастворимого карбодиимида. Реакционную смесь выдерживали в течение 12 час в холодильнике, выпавший осадок мочевины и выделили полученный конъюгат гель-хроматографией на Сефадексе G-25.

Получено 10 мг конъюгата тетрагидроканнабинола с овальбумином (Δ⁹-ТГК-ОВА), содержащего 15 молей гаптена на моль белка.

Пример 5. Получение конъюгата морфина с лизоцимом

К раствору 50 мг (3,57×10^-3 ммоль) лизоцима в 2,5 мл 0,3 М раствора NaHCO₃ прибавили при охлаждении 0,3 мл раствора смешанного ангидрида 6-сукцинилморфина, полученного из 19,2 мг (0,05 ммоль) 6-сукцинилморфина и 6,0 мкл изобутилхлорформиата. Реакционную смесь инкубировали в течение 18 час. При 4°C образующийся конъюгат морфина с лизоцимом выделяли гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25 и лиофильно высушивали.

Получено 30 мг конъюгата морфина с лизоцимом (М-Лиз).

Количество присоединенного морфина рассчитывали по данным УФ-спектров исходного белка и полученного конъюгата по изменению поглощения при 280 нм. По данным УФ-спектров в полученном конъюгате содержалось 12 молей морфина на моль белка.

Пример 6. Получение конъюгатов морфина с полилизином (М-ПолиЛиз)

Раствор 50 мг (0,001 ммоль) полилизина (полиструктура пептидов) в 5,0 мл дистиллированной воды смешивали с 2,0 мл ДМФА, содержащего 15,0 мг (0,039 ммоль) 6-сукцинилморфина, и при охлаждении по каплям прибавляли раствор 15 мг (0,055 ммоль) водорастворимого карбодиимида в 3 мл дистиллированной воды. Реакционную смесь инкубировали в течение 5 час при 4°C. Полученный конъюгат выделяли гель-хроматографией на колонке с сефадексом G-25 и лиофильно высушивали.

Получено 25 мг конъюгата морфина с полилизином (М-ПолиЛиз), содержащего 10 молей морфина на моль белка.

Пример 7. Получение конъюгатов морфина с полилизином (М-ПолиЛиз)

Раствор 27 мг (0,0006 ммоль) полилизина в 30 мл 0,25 М раствора NaHCO₃ добавляли к раствору смешанного ангидрида 3-О-карбоксиметилморфина. Смесь выдерживали при 0°C в течение ночи. Выделение конъюгата проводили гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25 и лиофильно высушивали.

Получено 20 мг конъюгата морфина с полилизином (М-ПолиЛиз), содержащего 2 моля морфина на моль белка.

Пример 8. Получение конъюгата Δ⁹-тетрагидроканнабинола с гамма-глобулином (Δ⁹-ТГК-гамма-глобулин)

К раствору 15 мг (3,3×10^-3 ммоль) гамма-глобулина в 3 мл дистиллированной воды прибавили раствор 7,4 мг (0,02 ммоль) вещества производного 4-карбосифенил-азо Δ⁹-тетрагидроканнабинола (каннабиноид) в 1 мл ДМФА, охладили реакционную смесь до 0°C и при перемешивании прибавили 5 мг водорастворимого карбодиимида. Реакционную смесь выдерживали в течение 12 час в холодильнике, выпавший осадок мочевины и выделили полученный конъюгат гель-хроматографией на Сефадексе G-25.

Получено 12 мг конъюгата Δ⁹-тетрагидроканнабинола с гамма-глобулином (Δ⁹-ТГК-гамма-глобулин), содержащего 5 молей Δ⁹-тетрагидроканнабинола на моль белка.

Пример 9. Синтез конъюгированных антигенов амфетамина с дифтерийным тосином (А-Дт)

Так же, как в примере 2, использовали производное d,1-1-фенил-2-аминопропан (2 мг; 0,06 ммоль) и 10 мг (0,00022 ммоль) белка дифтерийного токсина, которые растворяли в 2,0 мл 0,1 М фосфатного буфера. Далее проводили операции, описанные в примере 2. Получено 7 мг конъюгата, содержащего 6 молей амфетамина на моль белка.

Пример 10. Получение конъюгата барбамила с гамма-глобулином (Б-гамма-глобулин)

Так же, как в примере 8, с использованием раствора 15 мг (3,3×10^-3 ммоль) гамма-глобулина в 3 мл дистиллированной воды, к которому прибавили при охлаждении и перемешивании раствор 1 мл ДМФ, содержащего 5,2 мг (0,03 ммоль) барбамила, производного барбитуровой кислоты и 5 мг водорастворимого карбодиимида. Далее выполнили процедуру, как в примере 8.

Получено 10 мг конъюгата барбамила с гамма-глобулином (Б-гамма-глобулин), содержащего 6 молей барбамила на моль белка.

Получение синтетического иммуногена - комплекса, состоящего из конъюгата макромолекулярного носителя в виде природного или искусственного белка и гаптена - наркотического или психотропного соединения, ковалентно связанного с полимерной матрицей в виде поли(4-нитрофенил)акрилата.

Приготовление синтетических иммуногенов осуществляли по известным традиционным методикам, соблюдая соотношение гаптена и макромолекулярного носителя в соответствии с предлагаемым изобретением

Реакции осуществляли с помощью поли(4-нитрофенил)акрилата. Коньюгат содержал указанные выше макромолекулярные носители и гаптены в соотношениях от 2:1 до 17:1 молей гаптена на моль макромолекулярного носителя (Примеры 1-10).

Контроль за степенью ковалентного связывания поли(4-нитрофенил)акрилата с конъюгатом макромолекулярного носителя в виде природного или искусственного белка и гаптена - наркотического или психотропного соединения осуществляли спектрофотометрически по количеству образовавшегося в процессе реакции p-нитрофенола.

Пример 11. Получение иммуногена, состоящего из конъюгата овальбумина с морфином (М-ОВА), ковалентно связанного с поли(4-нитрофенил)акрилатом при соотношении 7 молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата

К раствору 6 мг поли(4-нитрофенил)акрилата (м.в. 40000) в 1,5 мл диметилсульфоксида (ДМС) добавляют 3,8 мг М-ОВА, полученного в примере №1, содержащего в качестве гаптена 6-(3-(аминогексиламинокарбонил)-пропионат)морфина выдерживают реакционную смесь в течение суток при 20°C, а затем добавляют 200 мкл 25% аммиака. Растворитель упаривают в вакууме. Оставшееся масло многократно промывают эфиром.

Получают комплекс, имеющий 7:1 замещение полимерной матрицы конъюгатом морфина со спейсером по 6-му положению молекулы морфина.

Пример 12. Получение иммуногена, состоящего из конъюгата овальбумин (М-ОВА) с морфином, ковалентно связанного с поли(4-нитрофенил)акрилатом при соотношении 5 молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата.

То же, что в примере 11, только в качестве исходного соединения берут 3,5 мг поли-(4-нитрофенил)акрилата в 1 мл ДМС и 2 мг М-ОВА, полученного в примере №1, содержащего в качестве гаптена (6-(3-(аминогексиламинокарбонил)-пропионат)морфина.

Получаемый комплекс имеет 5:1 замещение полимерной матрицы конъюгатом с производным морфина со спейсером по 6-му положению молекулы морфина.

Пример 13. Получение иммуногена, состоящего из конъюгата полилизин (М-ПолиЛиз) с морфином, ковалентно связанного с поли(4-нитрофенил)акрилатом при соотношении 3 молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата.

То же, что в примере 11, только в качестве исходного соединения берут 5 мг поли(4-нитрофенил)акрилата в 2 мл ДМФ и 3 мг конъюгата М-ПолиЛиз, полученного в примере №7.

Получаемый комплекс имеет 3:1 замещение полимерной матрицы конъюгатом полилизина со спейсером (3-О-карбоксиметилморфина) по 3-му положению молекулы морфина.

Пример 14. Получение иммуногена, состоящего из конъюгата гамма-глобулина с Δ⁹-тетрагидроканнабинолом (Δ⁹-ТГК-гамма-глобулин), ковалентно связанного с поли(4-нитрофенил)акрилатом при соотношении 2 молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата.

То же, что в примере 11, только в качестве исходного соединения берут 3,5 мг поли(4-нитрофенил)акрилата в 1 мл ДМС и 2 мг конъюгата Δ⁹-ТГК-гамма-глобулин, полученного в примере 8.

Получаемый комплекс имеет 2:1 замещение полимерной матрицы конъюгатом Δ⁹-ТГК-гамма-глобулин.

Пример 15. Получение иммуногена, состоящего из конъюгата дифтерийного токсина с амфетамином, ковалентно связанного с поли(4-нитрофенил)акрилатом при соотношении 4 молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата.

То же, что в примере 11, только в качестве исходного соединения берут 3,5 мг поли(4-нитрофенил)акрилата в 1 мл ДМС и 2,5 мг конъюгата амфетамин-дифтерийный токсин, полученного в примере №9.

Получаемый комплекс имеет 4:1 замещение полимерной матрицы поли(4-нитрофенил)акрилата конъюгатом амфетамин-дифтерийный токсин.

Пример 16. Получение иммуногена, состоящего из конъюгата гамма-глобулина с барбамилом, ковалентно связанного с поли(4-нитрофенил)акрилатом при соотношении 2 моля конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата.

То же, что в примере 11, только в качестве исходного соединения берут 3,5 мг поли(4-нитрофенил)акрилата в 1 мл ДМС и 3 мг конъюгата барбамил-гамма-глобулин, полученного в примере №10.

Получаемый комплекс имеет 6:1 замещение полимерной матрицы конъюгатом барбамил-гамма-глобулин.

Фармакологическое действие синтетических иммуногенов с различными указанными выше макромолекулярными носителями и гаптенами характеризуется синтезом антител, специфичных для каждого гаптена. Эти результаты основаны на многократных испытаниях, выполненных на мышах, кроликах, а также на группах добровольцев (в соответствии со ст.124 УК РФ, ст.43 Основ законодательства об охране здоровья граждан и ст.21, ч.2 Конституции РФ). Для этих целей использовали составы предлагаемого синтетического иммуногена, представленные в примерах 11-16 с различными вариантами макромолекулярных носителей и гаптенов и соотношениями (конъюгат: поли(4-нитрофенил)акрилат) в заявляемых пределах

Синтетический иммуноген вводили пациентам в виде раствора подкожно в количестве 0,5 мл. Через две недели процедуру повторяли и затем продолжали введение иммуногена 1 раз в неделю еще в течение шести недель. Время нарастания активной иммунной реакции определяли стандартными методами иммуноферментного анализа (ИФА). Пациенты находились под регулярным наблюдением за изменением состояния их здоровья в течение 3 лет.

Для получения сыворотки, содержащей специфические антитела, использовали 6 кроликов-самцов массой 2,5 кг. Иммунизацию проводили введением синтетического иммуногена, состоящего из конъюгата гаптена с макромолекулярным носителем, ковалентно связанным с поли(4-нитрофенил)акрилатом в заданном соотношении, в расчете 1 мг на кролика. В течение месяца с интервалом 7 дней проводили инъекции по 0,2 мл в 4 точки вблизи позвоночника - в области лопаток и в области крестца. Иммунизация кроликов препаратом по приведенной схеме приводила к появлению в сыворотке крови высоких титров антител к иммуногену. Результаты оценивали методом ИФА. В реакции прямого ИФА установлено, что образующиеся антитела имеют титр от 1:6000 до 1:12000. В конкурентном ИФА происходит связывание гаптена. Титр антител к иммунокомплексу уменьшался до 1:400 при использовании концентрации гаптена 0,001 моль, что свидетельствует о наличии антител к этому соединению.

Доклинические исследования

В экспериментах на животных показано, что полученные синтетические иммуногены способны индуцировать иммунные ответы с появлением антител, специфически взаимодействующих с гаптеном и нейтрализующие их активность в организме. В серии опытов была выяснена возможность нейтрализации токсического действия морфина на животных.

Пример 17. Группе контрольных животных, состоящей из шести неиммунизированных кроликов, и опытной группе, включающей шесть кроликов, предварительно иммунизированных синтетическим иммуногеном морфин-овальбумин-поли(4-нитрофенил)акрилат по указанной выше схеме, внутривенно вводили абсолютно летальную дозу морфина 100 мг/кг (LD100). Было установлено, что все шесть кроликов контрольной группы погибли от указанной летальной дозы.

Среди иммунизированных кроликов гибели не зарегистрировано ни в одном из шести случаев, т.е. наблюдалась четкая иммунологическая защита образовавшимися в процессе иммунизации специфическими антителами.

Пример 18. Аналогично описанному выше Примеру 17 проводили исследования в двух группах по шесть половозрелых беспородных крыс обоего пола. Одну группу иммунизировали синтетическим иммуногеном амфетамин-дифтерийный токсин-поли(4-нитрофенил)акрилат из расчета 30 мг/кг. Вводили летальную дозу психоактивного вещества первитина животным первой и второй группы. Установлено, что погибли животные контрольной группы, не получавшие иммуноген.

Среди иммунизированных крыс гибели не зарегистрировано ни в одном из шести случаев, т.е. наблюдалась четкая иммунологическая защита образовавшимися в процессе иммунизации специфическими антителами.

Пример 19. Аналогично описанному выше Примеру 17 шесть половозрелых беспородных крыс обоего пола иммунизировали синтетическим иммуногеном барбамил-гамма-глобулин-поли(4-нитрофенил)акрилат (гаптен из группы производных барбитуровой кислоты) из расчета 30 мг/кг. Вводили летальную дозу снотворного - барбитурата. Погибли животные контрольной группы, не получавшие иммуноген.

Среди иммунизированных крыс гибели не зарегистрировано ни в одном из шести случаев, т.е. наблюдалась четкая иммунологическая защита образовавшимися в процессе иммунизации специфическими антителами.

Исследования по указанной выше схеме, выполненные для гаптенов, входящих в заявленный состав иммуногена, показали аналогичные результаты. Таким образом, синтезированный иммунокомплекс специфически связывает гаптен не только in vitro, но и в целом организме.

Пример 20. Определение специфичности антител, образующихся при иммунизации синтетическим иммуногеном, состав которых представлен в таблице 1.

Следующим этапом работы явилась оценка иммунохимических свойств антител, образующихся в процессе иммунизации. Специфичность была изучена в тесте конкуренции ИФА. Для этого в твердофазном ИФА в качестве ингибиторов использовали соединения, структурно родственные гаптену, входящему в состав заявленного иммуногена, а также наркотические вещества и ряд психотропных лекарственных препаратов другой химической природы.

Для каждого из этих соединений определяли концентрацию, при которой происходит 50% торможение взаимодействия антигаптеновых антител, с антигеном на твердой фазе. Специфичность рассчитывали как выраженное в процентах отношение молярных концентраций исследуемого вещества и исходного гаптена. Результаты изучения специфичности антител представлены в таблице 1.

По данным таблицы 1 видно, что только иммунные кроличьи антитела к гаптенам, входящим в состав заявляемого иммуногена, не давали перекрестных реакций с соединениями других классов и в меньшей степени реагировали со структурно родственными веществами, а взаимодействовали только с гаптенами, включенными в комплекс конъюгата с макромолекулярным носителем. Так, для иммуногена, состоящего из конъюгата овальбумина с морфином (М-ОВА), ковалентно связанного с поли(4-нитрофенил)акрилатом при соотношении 7 молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата (пример 11), образуются антитела, специфически реагирующие с морфином, героином и в чуть меньшей степени с кодеином. Перекрестные реакции отсутствуют с метадоном, амфетамином, каннабиноидами, кокаином и др. веществами, не относящимися к классу опиатов. Аналогичные результаты получены и для иммуногена, состоящего из конъюгата полилизин (М-ПолиЛиз) с морфином, ковалентно связанного с поли(4-нитрофенил)акрилатом при соотношении 3 молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата (пример 13). Для иммуногена, состоящего из конъюгата гамма-глобулина с Δ⁹-тетрагидроканнабинолом (Δ⁹-ТГК), ковалентно связанного с поли(4-нитрофенил)акрилатом при соотношении 2 молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата, специфическая реакция антител наблюдается только для каннабиноидов (пример 14). Для иммуногена, состоящего из конъюгата дифтерийного токсина с амфетамином, ковалентно связанного с поли(4-нитрофенил)акрилатом, при соотношении 4 молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата антитела реагируют с амфетамином и в меньшей степени с метамфетамином при отсутствии реакции со структурами эфедрина, а также с соединениями других классов (пример 15). Для иммуногена, состоящего из конъюгата гамма-глобулина с барбамилом, ковалентно связанного с поли(4-нитрофенил)акрилатом при соотношении 2 моля конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата, полученные антитела взаимодействуют с барбамилом и в меньшей степени с фенобарбиталом, не давая перекрестных реакций с соединениями других классов (пример 16).

Проведен расчет константы аффинности (Ка) для специфических антител иммунной сыворотки. На основании кривых конкурентного ИФА, используя в качестве ингибитора гаптен из состава иммуногена, Ка определяли как обратную величину концентрации свободного ингибитора, необходимую для 50% торможения антител (I₅o), связавшихся с иммобилизованным на планшете антигеном. Ка=I/I_50.

Ка антител из сыворотки кроликов составила 10⁸-10¹⁰ М^-1.

Клинические исследования.

Аналогичные исследования специфичности были проведены с антителами, выделенными аффинной хроматографией из сыворотки крови добровольцев - больных наркоманией, иммунизированных синтезированным иммуногеном - комплекс с конъюгатом овальбумин-морфин-поли(4-нитрофенил)акрилат.

Иммуноген вводили 10 добровольцам, страдающим опийной наркоманией, возраст: 20-30 лет. Продолжительность приема наркотиков: 2-10 лет. Иммуноген вводили подкожно в верхнюю треть плеча правой и левой руки попеременно, один раз в неделю, 8-10 инъекций на курс.

Эффект иммуногена начинает развиваться после латентного периода, который наступает от момента первой инъекции и длится в течение 2-3-х недель. Формирование клеточного и гуморального иммунного ответов, необходимых для нейтрализации препаратов, происходит к концу 8-10 недели от начала иммунизации. При этом происходит интенсивное созревание клона иммунокомпетентных клеток, вызывающих продукцию высокоаффинных, специфических антител, стимулируются под действием факторов процессы реагирующих клеток иммунной системы, приводящие к взаимодействию T- и B-лимфоцитов, функционированию макрофагов, индуцируется образование мононуклеарных клеток. В организме человека накапливаются антитела, способные связывать дозы наркотических или других токсических веществ, многократно (в 8-12 раз) превышающие летальные. Таким образом, иммунизация пациента предлагаемым препаратом приводит к развитию продолжительной толерантности к конкретным веществам при отсутствии любых отрицательных явлений.

Из исходных 10 сывороток наркоманов антиопиатные антитела выделены во всех образцах. По данным ИФА в сыворотках содержатся антитела IgG- и IgM-класса против морфина, героина и кодеина, реагирующие с каждым из метаболитов. Обобщенные данные по специфичности антиморфиновых антител, выделенных из сыворотки крови больных опийной наркоманией, представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы, все выделенные из сыворотки крови антитела индивидуальны по своей специфичности и не дают перекрестных реакций с исследованными ингибиторами, веществами других классов: метадон, псевдоэфедрин, норэфедрин, барбамил, канабинол - процент перекрестного связывания, указывающего на специфическое взаимодействие, меньше 0,001. Соединения опийной группы морфин, героин показывают 100 процентное связывание с выделенными у больных антителами.

Расчет константы аффинности (Ка) (таблица 3) проводили на основании кривых ингибиторного ИФА, используя в качестве ингибитора морфин. Ка определяли как обратную величину концентрации свободного ингибитора, необходимую для 50% торможения антител (I₅o), связавшихся с иммобилизованным на планшете антигеном. Ка=I/I₅₀.

Как и в случае иммунных кроличьих антител, антиопиатные антитела, выделенные из сыворотки крови наркоманов, практически не взаимодействовали с наркотическими веществами другого класса. Антитела, выделенные из сыворотки крови больных наркоманией, по сравнению с антителами из кроличьих иммунных сывороток обладают более низкой константой аффинности и более широким спектром специфичности.

Таким образом, антитела, полученные иммунизацией животных или человека искусственными синтетическими иммуногенами, могут быть использованы для нейтрализации вредного воздействия психоактивного вещества, что в свою очередь может быть использовано для защиты от токсического действия при злоупотреблениях наркотическими и психоактивными веществами.

Для подтверждения данных, приведенных в таблице ″Составы синтетических иммуногенов и их фармакологическое действие″, приведены дополнительные сведения.

Составы предлагаемого синтетического иммуногена и известного, взятого за прототип, а также их фармакологические действия, подтвержденные в примерах 21-27, приведены в табл.4.

Пример 21

Пациент - 20 лет, 4 года опийная наркомания.

Исходные лабораторные данные: 1 мл плазмы крови содержит 2000 пмоль героиносвязывающих антител, определяемых ингибиторным ИФА.

Пациента иммунизировали синтетическим иммуногеном: комплекс с конъюгатом овальбумин:морфин:поли(4-нитрофенил)акрилат (7:1), полученным в примере 11.

Лабораторные данные (через 6 недель от начала лечения иммуногеном): ИФА 1 мл - 80000 пмоль героиносвязывающих антител. Через 9 недель созревают Т-лимфоциты и стимулируется образование антител, вызывающих созревание В-лимфоцитов, возникает пожизненный клеточный иммунитет; аллергические реакции отсутствуют.

Контрольные лабораторные данные (через 14 месяцев от начала лечения иммуногеном): ИФА 1 мл - 50000 пмоль. Количество специфических антител в 25 раз превышает исходные данные, что свидетельствует о стойком иммунитете.

За указанный период времени (14 месяцев) рецидивов заболевания не наблюдалось.

Данные зафиксированы документально в историях болезни пациентов.

Пример 22

Пациент - 30 лет, 3 года опийная наркомания.

Исходные лабораторные данные: 1 мл плазмы крови содержит 2100 пмоль героиносвязывающих антител, определяемых ингибиторным ИФА.

Пациента иммунизировали синтетическим иммуногеном: комплекс с конъюгатом овальбумин:морфин:поли(4-нитрофенил)акрилат (5:1), полученным в примере 12.

Лабораторные данные (через 6 недель от начала лечения иммуногеном): ИФА 1 мл - 70000 пмоль героиносвязывающих антител. Через 9 недель созревают Т-лимфоциты и стимулируется образование антител, вызывающих созревание В-лимфоцитов, возникает пожизненный клеточный иммунитет; аллергические реакции отсутствуют.

Контрольные лабораторные данные (через 13 месяцев от начала лечения иммуногеном): ИФА 1 мл - 60000 пмоль. Количество специфических антител примерно в 30 раз превышает исходные данные, что свидетельствует о стойком иммунитете.

За указанный период времени (13 месяцев) рецидивов заболевания не наблюдалось.

Данные зафиксированы документально в историях болезни пациентов.

Пример 23

Пациент 25 лет, 4 года опийная наркомания.

Исходные лабораторные данные: ИФА 1 мл - 1600 пмоль; у пациента в момент поступления в клинику определили конкурентным ИФА интоксикацию и наличие наркотических веществ группы опиатов и каннабиноидов.

Пациента иммунизировали синтетическим иммуногеном: комплекс с конъюгатом полилизин:морфин:поли(4-нитрофенил)акрилат (3:1), полученным в примере 13,

Лабораторные данные (через 6 недель после начала иммунизации): ИФА 1 мл - 75000 пмоль специфических антител; определение конкурентным ИФА содержания опиатов, каннабиноидов - отрицательно, т.е. усиливается сорбция метаболитов и ксенобиотиков. Через 9 недель созревают Т-лимфоциты и стимулируется образование антител, вызывающих созревание В-лимфоцитов, возникает пожизненный клеточный иммунитет; аллергические реакции отсутствуют.

Контрольные лабораторные данные (через 16 месяцев от начала лечения иммуногеном): ИФА 1 мл - 60000 пмоль. Количество специфических антител более, чем в 35 раз превышает исходные данные, что свидетельствует о стойком иммунитете.

За указанный период времени (16 месяцев) рецидивов заболевания не наблюдалось.

Данные зафиксированы документально в историях болезни пациентов.

Пример 24

Пациент - 32 года, 10 лет гашишная наркомания.

Исходные лабораторные данные: в ИФА определили, что 1 мл содержит 1500 пмоль антител.

Пациента иммунизировали синтетическим иммуногеном: комплекс с конъюгатом гамма-глобулина с Δ⁹-тетрагидроканнабинолом: поли(4-нитрофенил)акрилат (2:1), полученным в примере 14.

Лабораторные данные: ИФА1 мл - 91000 пмоль (после 6 недель от начала иммунизации) усиление детоксикационной функции организма установлено в тесте конкурентного ИФА. Усиление продукции антител; стойкость гуморального иммунитета; отсутствие аллергических реакций; пожизненный клеточный иммунитет.

Контрольные лабораторные данные (через 18 месяцев от начала лечения иммуногеном): ИФА 1 мл - 50000 пмоль (увеличение специфических антител более, чем в 30 раз и их сохранение в организме).

За указанный период времени (18 месяцев) рецидивов заболевания не наблюдалось.

Данные зафиксированы документально в историях болезни пациентов.

Пример 25

Пациент - 27 лет, 5 лет - злоупотребление психостимуляторами амфетаминового ряда.

Исходные лабораторные данные: в ИФА определили, что 1 мл содержит 1500 пмоль антител.

Пациента иммунизировали синтетическим иммуногеном комплекс с конъюгатом:дифтерийный токсин:амфетамин и поли(4-нитрофенил)акрилат, полученным в примере 15.

Лабораторные данные: ИФА 1 мл - 91000 пмоль специфических антител (после 6 недель от начала иммунизации), усиливается продукция антител. Через 8 недель созревают Т-лимфоциты и стимулируется образование антител, вызывающих созревание В-лимфоцитов, возникает пожизненный клеточный иммунитет; стойкость гуморального иммунитета; отсутствие аллергических реакций;

Контрольные лабораторные данные: (через 15 месяцев от начала лечения иммуногеном) ИФА 1 мл - 52000 пмоль антител (увеличение специфических антител более, чем в 30 раз и их сохранение в организме).

За указанный период времени (15 месяцев) рецидивов заболевания не наблюдалось.

Данные зафиксированы документально в историях болезни пациентов.

Пример 26

Пациент - 30 лет, 8 лет злоупотребление препаратами барбитуровой кислоты. Исходные лабораторные данные: в ИФА определили, что 1 мл содержит 1900 пмоль антител.

Пациента иммунизировали синтетическим иммуногеном: комплекс с конъюгатом гамма-глобулин:барбамил:поли(4-нитрофенил)акрилат, полученным в примере 16.

Лабораторные данные: ИФА 1 мл - 85000 пмоль (после 6 недель от начала иммунизации). Усиление продукции антител; стойкость гуморального иммунитета; отсутствие аллергических реакций; пожизненный клеточный иммунитет.

Контрольные лабораторные данные: (через 18 месяцев от начала лечения иммуногеном) ИФА 1 мл - 50000 пмоль (увеличение специфических антител более, чем в 25 раз и их сохранение в организме).

За указанный период времени (18 месяцев) рецидивов заболевания не наблюдалось.

Данные зафиксированы документально в историях болезни пациентов.

Пример 27

6 половозрелых крыс обоего пола иммунизировали синтетическим иммуногеном комплекс с конъюгатом: дифтерийный токсин:амфетамин и поли(4-нитрофенил)акрилат, полученным в примере 15, из расчета 40 мг/кг.

Лабораторные данные: ИФА 1 мл - 75000 пмоль (через 5 недель после начала иммунизации).

Вводили летальную дозу психоактивного вещества первитина.

Контрольные лабораторные данные: ИФА 1 мл - 54000 пмоль. Синтез антител; отсутствие аллергических реакций.

Пример 28

6 половозрелых крыс обоего пола иммунизировали синтетическим иммуногеном комплекса с конъюгатом гамма-глобулин:барбамил:поли(4-нитрофенил)акрилат, полученным в примере 16, из расчета 50 мг/кг.

Лабораторные данные: ИФА 1 мл - 76000 пмоль (через 5 недель после начала иммунизации).

Вводили летальную дозу снотворного - барбитурата.

Контрольные лабораторные данные: ИФА 1 мл - 57000 пмоль. Синтез антител; отсутствие аллергических реакций.

Пример 29

6 половозрелых крыс обоего пола иммунизировали синтетическим иммуногеном комплекс с конъюгатом овальбумин:морфин:поли(4-нитрофенил)акрилат, полученным в примере 12, из расчета 30 мг/кг.

Лабораторные данные: ИФА 1 мл - 85000 пмоль специфических антител к героину (через 4 недели после начала иммунизации). Вводили летальную дозу наркотического вещества героина 100 мг/кг.

Контрольные лабораторные данные: ИФА 1 мл - 60000 пмоль Синтез антител; отсутствие аллергических реакций.

Как видно из приведенных примеров и данных таблицы 4, использование заявляемого синтетического иммуногена позволяет любым способом введения синтезировать в организме антитела при отсутствии аллергических реакций; при этом обеспечивается пожизненный клеточный иммунитет; усиление детоксикационной функции организма, сорбция метаболитов и ксенобиотиков. Стойкость гуморального иммунитета по сравнению с прототипом возрастает с 12 до 18 месяцев.

Таблица 1 СИНТЕТИЧЕСКИЙ ИММУНОГЕН ДЛЯ ТЕРАПИИ И ПРОФИЛАКТИКИ ЗЛОУПОТРЕБЛЕНИЙ НАРКОТИЧЕСКИМИ И ПСИХОАКТИВНЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ Соединение, используемое в качестве ингибитора в конкурентном ИФА Специфичность, % Состав синтетического иммуногена овальбумин морфин поли(4-нитрофенил) акрилат гамма-глобулин каннабиноид поли(4-нитрофенил) акрилат дифтерийны токсин амфетамин поли(4-нитрофенил) акрилат гамма-глобулин барбамил поли(4-нитрофенил акрилат полилизин морфин поли(4-нитрофенил) крилат 1 Амфетамин менее 0,001 0,01 100 0,7 0,01 2 Метамфетамин менее 0,001 0,07 56 0,002 0,1 3 Эфедрин 0,8 1,0 0,7 0,004 0,8 4 Псевдоэфедрин 0,004 0,03 менее 0,001 0,05 0,004 5 Норэфедрин 0,003 0,05 0,002 0,05 0,003 6 Центедрин 0,007 менее 0,001 менее 0,001 менее 0,001 0,009 7 Пиридитол 0,005 менее 0,001 менее 0,001 менее 0,001 0,004 8 Морфин 100 0,1 0,04 0,6 100 9 Δ⁹ тетрагидрокан набинол 0,8 100 0,01 0,7 0,8 10 Кокаин 0,004 0,02 0,1 од 0,004 11 Фенобарбитал менее 0,001 менее 0,001 0,8 74 0,003 12 Барбамил 0,2 менее 0,001 0,004 100 0,05 13 Кодеин 78 0,1 0,003 0,01 59 14 Героин 100 0,1 0,009 0,009 100 15 Метадон 0,007 менее 0,001 0,004 0,1 0,8 16 Бензоилэкгонин 0,005 менее 0,001 0,001 0,03 0,004

Таблица 2 СИНТЕТИЧЕСКИЙ ИММУНОГЕН ДЛЯ ТЕРАПИИ И ПРОФИЛАКТИКИ ЗЛОУПОТРЕБЛЕНИЙ НАРКОТИЧЕСКИМИ И ПСИХОАКТИВНЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ № сыворотки Изотип Ig Специфичность.     морфин героин кодеин метадон, псевдоэфедрин, норэфедрин, барбамил, канабинол 1 IgG 100 100 -* -   IgM 100 - - - 2 IgG 100 100 - -   IgM 100 - - - 3 IgG 12 100 17 -   IgM 100 0,9 34 - 4 IgG 100 10 0.1 -   IgM 100 0,2 1,4 - 5 IgG 100 1 0.1 -   IgM 100 од 56 - 6 IgG 100 61 0.1 -   IgM - 10 100 - 7 IgG 100 0,14 0,11 -   IgM 100 25 1 - 8 IgG 100 100 100 -   IgM 100 85 10 - 9 IgG 100 100 100 -   IgM 100 0,1 - - 10 IgG 100 - - -   IgM 100 - - -

Таблица 3 Исследуемый антиген Диапазон Ка, М^-1   Группа больных Группа доноров   IgG IgM IgG IgM Амфетамин 10⁶-10⁷ 10⁷-10¹⁰ 10³-10⁴ 10³-10⁴

Таблица 4 СИНТЕТИЧЕСКИЙ ИММУНОГЕН ДЛЯ ТЕРАПИИ И ПРОФИЛАКТИКИ ЗЛОУПОТРЕБЛЕНИЙ НАРКОТИЧЕСКИМИ И ПСИХОАКТИВНЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ № при-мера Состав иммуногена: 1. макромолекулярный носитель 2. гаптен 3. поли (4-нитрофенил)акрилат Соотношение конъюгат: поли (4-нитрофени л)акрилат Фармакологическое действие 21 овальбумин морфин поли (4-нитрофенил) акрилат 7:1 Синтез антител; стойкость гуморального иммунитета -14 месяцев, любой способ введения; отсутствие аллергических реакций; пожизненный клеточный иммунитет 22 овальбумин морфин поли (4- нитрофенил)акрилат 5:1 Синтез антител; стойкость гуморального иммунитета -13 месяцев, любой способ введения; отсутствие аллергических реакций; пожизненный клеточный иммунитет 23 полилизин морфин поли (4-нитрофенил) акрилат 3:1 Синтез антител; стойкость гуморального иммунитета -16 месяцев; любой способ введения; отсутствие аллергических реакций; пожизненный клеточный иммунитет; усиление детоксикационной функции организма 24 гамма-глобулин Δ⁹-тетрагидро-каннабинол поли (4-нитрофенил) акрилат 2:1 Синтез антител; стойкость гуморального иммунитета -18 месяцев; любой способ введения; отсутствие аллергических реакций; пожизненный клеточный иммунитет; усиление детоксикационной функции организма, сорбция метаболитов и ксенобиотиков 25 дифтерийный токсин амфетамин поли (4-нитрофенил) акрилат 4:1 Синтез антител; стойкость гуморального иммунитета -15 месяцев; любой способ введения; отсутствие аллергических реакций; пожизненный клеточный иммунитет; усиление детоксикационной функции организма, сорбция метаболитов и ксенобиотиков 26 гамма-глобулин барбамил поли(4- нитрофенил)акрилат 6:1 Синтез антител; стойкость гуморального иммунитета -18 месяцев; любой способ введения; отсутствие аллергических реакций; пожизненный клеточный иммунитет; усиление детоксикационной функции организма, сорбция метаболитов и ксенобиотиков. Прототип 1. человеческий гамма-глобулин 2. налтрексон 3 лолиоксидоний 1: 1,5 Синтез антител; стойкость гуморального иммунитета -12 месяцев; любой способ введения; отсутствие аллергических реакций; пожизненный клеточный иммунитет; усиление детоксикационной функции организма, сорбция метаболитов и ксенобиотиков

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может применяться для лечения наркоманий, отравлений различными ядами в промышленности и быту, при техногенных катастрофах и т.п. Изобретение представляет собой синтетический иммуноген для защиты от токсического действия наркотических и психоактивных веществ. Иммуноген выполнен в виде конъюгата макромолекулярного носителя, выбранного из ряда: природный или искусственный белок, олиго- и полипептид, углевод, липид или нуклеотид, и гаптена - наркотического или психотропного соединения, и дополнительно содержит поли(4-нитрофенил)акрилат, который ковалентно связан с конъюгатом в диапазоне соотношений от 2-х до 7-ми молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата, при этом соотношение гаптена и макромолекулярного носителя в конъюгате составляет 2-17 молей гаптена на 1 моль носителя. Применение изобретения приводит к созданию в течение длительного времени стабильного иммунного ответа в организме и обеспечению защиты его от токсического воздействия наркотических и психотропных веществ за счет вырабатываемых специфических антител к гаптену. 2 з.п. ф-лы, 4 табл., 29 пр.

1. Синтетический иммуноген для защиты от токсического действия наркотических и психоактивных веществ, представляющий собой конъюгат макромолекулярного носителя, выбранного из ряда: природный или искусственный белок, олиго- или полипептид, углевод, липид или нуклеотид, и гаптена - наркотического или психотропного соединения, отличающийся тем, что он дополнительно содержит поли(4-нитрофенил)акрилат, который ковалентно связан с коньюгатом в диапазоне соотношений от 2-х до 7-ми молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата, при этом соотношение гаптена и макромолекулярного носителя в конъюгате составляет 2-17 молей гаптена на 1 моль носителя.

2. Иммуноген по п.1, отличающийся тем, что в качестве макромолекулярного носителя, выбранного из группы природных белков, он содержит соединение, выбранное из ряда: овальбумин, человеческий гамма-глобулин, альбумин, лизоцим, микробные токсины, белки сыворотки крови.

3. Иммуноген по п.1, отличающийся тем, что в качестве гаптена он содержит наркотическое или психотропное соединение, выбранное из ряда опиатов, каннабиноидов, амфетамина, кокаина, барбитуратов, бензодиазепинов, метадона, фенциклидина, трициклических антидепрессантов, котинина и их производных и метаболитов.