СПОСОБЫ АККУМУЛЯЦИИ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ В БИОМАССЕ СО СЛЕЖЕНИЕМ В МАСШТАБЕ ВРЕМЕНИ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2014 года по МПК C12P7/62 C02F3/30 C02F9/00 

ПЕРЕКРЕСНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

Эта заявка притязает на приоритет следующей предварительной заявки на патент США: заявки с серийным № 61/285210, поданной 10 декабря 2009 года. Эта заявка включена сюда в ее полном объеме.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Это изобретение относится к аккумуляции полигидроксиалканоатов (PHA) в биомассе в связи с биологической обработкой органических отходов. Настоящее изобретение касается технологии объединения сточных вод с высоким содержанием легко биодеградируемой фракции с химическим потреблением кислорода (RBCOD) с биомассой, обогащенной аккумулирующими PHA бактериями (PAB) и слежения за процессом.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Полигидроксиалканоаты (PHA) являются биополимерами, из которых можно составить конструкционные полимеры или которые можно, кроме того, превратить в другие химикаты-платформы с дополнительным преимуществом, состоящим в полной биодеградируемости. Аккумуляция PHA может использоваться в качестве части общего принципа процесса получения топлива, электрической, тепловой энергии и химикатов из биомассы для процесса обработки сточных вод, включающего:

I. кислотогенную ферментацию органического материала в поступающих сточных водах для продуцирования летучих жирных кислот (VFA);

II. удаление органики из сточных вод и получение биомассы, из сточных вод или другого подходящего источника, с потенциалом в отношении значительной аккумуляции PHA;

III. продукцию и аккумуляцию PHA в полученной биомассе из порции с высоким содержанием RBCOD, происходящей из сточных вод или других внутренних или внешних источников поступления; и

IV. выделение и очистку PHA.

Настоящее изобретение может быть полезным для разрешения ряда проблем, связанных с технологическими качественными параметрами аккумуляции PHA в биомассе с высоким содержанием PAB и обработкой сточной вод, как объяснено далее ниже.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящим изобретением обеспечиваются способы продуцирования и аккумуляции PHA в биомассе с высоким содержанием PAB из RCBOD.

В одном аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ продуцирования полигидроксиалканоатов (PHA) в биомассе, включающий подачу органического углеродсодержащего субстрата в биомассу посредством периодической подачи субстрата в биомассу в течение периода времени и контролирование частоты периодической подачи и суммы периодических подач субстрата в биомассу так, чтобы средняя молекулярная масса продуцированных PHA составляла по крайней мере 400000 г/моль.

В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ стимуляции аккумуляции PHA в биомассе, включающий подачу органического углеродсодержащего субстрата в биомассу посредством смешивания субстрата, содержащего легко биодеградируемую фракцию с химическим потреблением кислорода, (RBCOD) с биомассой, с образованием смеси биомасса-субстрат, контролирование концентрации RBCOD в смеси биомасса-субстрат так, чтобы во время аккумуляции PHA концентрация RBCOD в смеси биомасса-субстрат в целом сохранялась между 1000 мг-COD/л и 10 мг-COD/л, и причем способ подачи RBCOD в биомассу и контролирования концентрации RBCOD в смеси биомасса-субстрат дает PHA со средней молекулярной массой, превышающей 400000 г/моль.

В третьем аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ продуцирования высокомолекулярных PHA в биомассе, включающий подачу органического углеродсодержащего субстрата в аккумулирующую PHA биомассу посредством периодической подачи субстрата в биомассу в течение периода времени и контролирование частоты и суммы подач субстрата так, чтобы интенсивность дыхания биомассы не опускалась более чем на 70% относительно максимальной интенсивности дыхания, которой достигла биомасса в ответ на самую последнюю подачу субстрата.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1. Нормализованные экспериментальные данные 6 исследований, что касается эмпирической модели (уравнения 1) для ответа биомассы на стимулирующее воздействие порции с высоким содержанием VFA.

Фиг 2. Репрезентативный сигнал в виде концентрации растворенного кислорода (DO), используемый для контролирования автоматического добавления субстрата (уравнение 3) в экспериментах по аккумуляции PHA в биомассе с высоким содержанием PAB с использованием импульсов для достижения постоянного стимулирующего воздействия, составляющего 100 мг-COD/л VFA.

Фиг 3. Результаты параллельных экспериментов по аккумуляции, в которых используются сконцентрированные ферментированные сточные воды молочной промышленности в качестве субстрата для подпитываемого процесса аккумуляции PHA.

Фиг. 4. Результаты параллельных экспериментов по аккумуляции, в которых используются сконцентрированные ферментированные сточные воды молочной промышленности в качестве субстрата для подпитываемого процесса аккумуляции PHA.

Фиг. 5. Типичные отклонения в растворенном кислороде в случае аккумуляции PHA в активированном иле с высоким содержанием PAB при использовании ферментированных сточных вод молочной промышленности в качестве субстрата для PHA.

Фиг. 6. В связи с фиг. 5 представлено фактическое значение δ_t в момент ввода в качестве подпитки, а также интенсивность дыхания при минимальном импульсном воздействии относительно максимальной интенсивности, достигаемой в случае соответствующих вводов субстрата.

Фиг. 7. Сводка относящихся к аккумуляции результатов многочисленных экспериментов, в которых рассматриваются результирующая оцененная средняя интенсивность дыхания при минимальном импульсном воздействии, представленная относительно интенсивности сохранившегося дыхания при максимальном импульсном воздействии, и средневзвешенная молекулярная масса аккумулированного РНА.

Фиг. 8. Репрезентативный результат аккумуляции PHA в полупромышленном масштабе (100 л) в биомассе с высоким содержанием PAB, используя в качестве субстрата ферментированные сточные воды молочной промышленности.

Фиг. 9. Репрезентативный пример аэробного процесса аккумуляции PHA с использованием непостоянного объема.

Фиг. 10. Репрезентативный пример аэробного процесса аккумуляции PHA с использованием непостоянного объема.

Фиг. 11. Репрезентативный пример аэробного процесса аккумуляции PHA с использованием постоянного объема.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретения включает новые, но практические технические решения для процесса аккумуляции PHA в биомассе. Задачи, которые могут быть выполнены в результате применения настоящего изобретения, включают:

• Стимуляцию, устойчивость и контролирование ответов в виде аккумуляции PHA при подаче субстратов, таких как сточные воды с высокими, средними и низкими концентрациями RBCOD;

• Контролирование процесса полимеризации PHA в биомассе для достижения высокой молекулярной массы PHA;

• Насыщение или почти насыщение биомассы PHA, где насыщение определяет максимальную аккумулирующую способность PAB в биомассе; и

• Минимальные уровни остающейся RBCOD-фракции и другой растворенной органики, остающейся в сточных водах к концу процесса аккумуляции.

Сточные воды часто характеризуются содержанием органических веществ через химическое потребление кислорода (COD). Общее химическое потребление кислорода (TCOD) сточных вод можно далее классифицировать с помощью стандартных способов в виде растворимой (SCOD) и биодеградируемой (BCOD) фракций. RBCOD образует часть SCOD в сточных водах и может в целом считаться теми органическими соединениями, включающими BCOD, которые могут ассимилироваться для роста биомассы без необходимости промежуточных стадий гидролиза. Соответствующие концентрации TCOD, SCOD, BCOD, RBCOD и так далее в сточных водах можно представить в перерасчете на мг-COD на литр или мг-COD/л, где представляемая масса COD находится в прямой связи с принимаемым во внимание компонентом органического содержания. Микробная активность и другие формы физико-химических процессов могут использоваться для увеличения растворимой, биодеградируемой фракции и даже RBCOD-фракции TCOD сточных вод. Когда сточные воды соответственно охарактеризованы, и известно химическое своеобразие RBCOD, то содержание RBCOD в сточных водах можно прямо представить, например, в виде всех VFA, определяемых в перерасчете на мг-COD/л. RBCOD-фракцию можно также в операционном порядке определить с помощью стандартизованных спирометрических методов, в которых учитывается фракция с COD в сточных водах, которая быстро утилизируется биомассой, когда аликвота сточных вод импульсно подается в биомассу в контролируемых условиях (Henze et al., 2000). Результаты такого операционного измерения RBCOD, основанного на спирометрических методах, могут варьировать в зависимости от того, насколько хорошо биомасса приспособилась к органическим соединениям, которые в противном случае, как можно в целом понять, будут легко внедряться в метаболизм прироста биомассы, например RBCOD. RBCOD-фракцией, представляющей интерес для настоящего изобретения, является RBCOD-фракция, которая после объединения с надлежащим образом приспособленной биомассой, может ассимилироваться этой биомассой и храниться внутриклеточно в виде PHA.

В RBCOD-фракции сточных вод часто доминируют VFA. VFA являются хорошо известными субстратами для продуцирования PHA, но другие формы RBCOD также являются, как известно, субстратами, которые смешанные культуры могут превратить в PHA. Настоящее изобретение включает продукцию PHA из VFA и RBCOD в общем.

Настоящим изобретением, кроме того, обеспечивается подпитываемый процесс обработки сточных вод для биологического удаления RBCOD, используя биомассу, обогащенную аккумулирующими РНА бактериями, и контролируемого превращения RBCOD в PHA. Добавление сточных вод к биомассе контролируют для достижения незначительного увеличения RBCOD в иловой смеси к концу процесса аккумуляции.

Под иловой смесью специалистами, осведомленными об осуществлении на практике биологической обработки сточных вод, обычно подразумевается смесь неочищенных или осветленных сточных вод и активированного ила, содержащегося в аэрационном бассейне, в процессе с использованием активированного ила. Взвешенные твердые вещества в иловой смеси (MLSS) являются концентрацией всех взвешенных твердых веществ (TSS) в иловой смеси, определяемой с помощью стандартных методов, обычно представляемой в миллиграммах на литр (мг/л). Летучие взвешенные твердые вещества в иловой смеси (MLVSS) являются концентрацией летучих взвешенных твердых веществ (VSS), определяемой с помощью стандартных методов, также представляемой в мг/л. В контексте этого изобретения термин «иловая смесь» используется для отображения жидкого содержимого процесса аккумуляции, включающего, но без ограничения, взвешенные твердые вещества активной биомассы и растворенные твердые вещества RBCOD. Поскольку при осуществлении на практике этого изобретения биомассой может быть отработанный активированный ил из процесса биологической обработки сточных вод, иловой смесью процесса аккумуляции считают иловую смесь даже до добавления какой-либо RBCOD-фракции с целью аккумуляции PHA, и ее представляют так же.

Скорость добавления сточных вод, содержащих RBCOD, контролируют, используя процесс слежения в масштабе времени. Процесс слежения может включать стратегии прямого определения качества воды, активности биомассы или свойств биомассы. Процесс слежения может также включать так называемые сигналы «виртуального» сенсора, которые в сочетании со знаниями о конкретном процессе могут использоваться для непрямой интерпретации качества воды, активности биомассы, роста биомассы, аккумуляции PHA и свойств биомассы. Примерами параметров процесса слежения для контролирования процесса являются следующие:

• Спектроскопия в ультрафиолетовой/видимой области (UV/Vis) для непрямого выявления концентрации субстрата (COD) и/или концентрации биомассы (TSS);

• Автоматизированный анализ общего (или растворенного) органического углерода, или химического потребления кислорода, для определения концентрации растворенного субстрата, и/или концентрации биомассы (VSS);

• Спирометрия, основанная, например, на измерениях растворенного кислорода, углекислого газа и/или окислительно-восстановительного потенциала, для контролирования аэрации процесса и для слежения за изменениями интенсивности сохранившегося дыхания биомассы во время последовательных вводов сточных вод в качестве подпиток и ответа на них;

• Концентрация ионов водорода (pH) в качестве «виртуального» сенсора ответа биомассы и метаболической активности на вводы RBCOD в качестве подпиток;

• Турбидиметрические измерения, основанные на методах отражения ближней ИК-области, для определения коэффициента отражения биомассы, который дает косвенное указание на кинетику аккумуляции PHA;

• Рамановская ИК-спектроскопия для непосредственной оценки содержания PHA в биомассе.

Не только количество, но также качество полимера, что касается ряда химических, физических и механических свойств, важно для практического осуществления процесса. Молекулярная масса и распределение по ней являются основными показателями качества, которые влияют на механические свойства полимера. Обычно желательны более высокие молекулярные массы и более узкие распределения по молекулярной массе. Потеря в молекулярной массе может быть жертвой, присущей рентабельному или более экологически безвредному получению полимеров из биомассы. Также известно, что переработка полимеров в расплав приносит дополнительные потери в свойствах материала вследствие снижения молекулярной массы. Поэтому более высокая исходная молекулярная масса после аккумуляции обеспечивает большую гибкость при последующей манипуляции с биополимером, поскольку намного легче разработать контролируемое снижение молекулярной массы, чем противоположное изменение. Одним вариантом осуществления настоящего изобретения является способ продуцирования PHA со средней молекулярной массой (M_w), составляющей по крайней мере 400000 г/моль, предпочтительно более чем 600000 г/моль и более предпочтительно более чем 1000000 г/моль.

Аккумуляция PHA при ферментации на чистых культурах, а также в процессах с использованием непрерывных смешанных культур при использовании VFA является результатом сложной цепи метаболических процессов. Полагают, без ограничения какой-либо конкретной теорией, что посредством контролирования скорости одного или более из этих метаболических процессов в биомассе можно продуцировать РНА с высокой средней молекулярной массой. Можно рассматривать, что, например, кинетика аккумуляции PHA контролируется:

1. R_t, скоростью переноса внеклеточных VFA в клетку,

2. R_c, скоростью превращения VFA в предшественники-мономеры PHA, и

3. R_p, скоростью полимеризации этих предшественников в РНА.

Ведутся споры в отношении степени, в которой бактерии активно контролируют R_t или поток VFA в клетку. Несмотря на эти споры, на скорость переноса через клеточную стенку будет влиять градиент концентрации между внеклеточной и внутриклеточной концентрациями VFA. Внутриклеточная концентрация VFA будет зависеть от баланса между переносом через мембрану в клетку и скоростью «сброса» внутриклеточных VFA.

VFA, поступающие в цитоплазму клетки, могут использоваться для трех возможных метаболических функций. На внутриклеточную концентрацию VFA могут влиять следующие скорости таких функций:

1. R_c, вышеотмеченная скорость превращения VFA в предшественники-мономеры PHA;

2. R_g, скорость анаболического преобразования VFA для прироста не являющейся PHA биомассы. Не являющаяся PHA биомасса может быть в форме активных микроорганизмов, а также других продуктов накопления, таких как внеклеточные полисахариды.

3. R_e, скорость катаболического превращения VFA в H₂O и CO₂ для запуска метаболической активности для непрерывного поддержания, роста и дыхания для аккумуляции PHA.

Следует принять к сведению, что, когда другая не являющаяся PHA органика в качестве предшественников подается в биомассу вместе с RBCOD, такой как VFA, этот источник не являющихся РНА предшественников может удовлетворить требования в отношении R_e вплоть до 100% требований в отношении энергии для биомассы. Однако в случае подачи только RBCOD можно допустить, что R_r, или скорость удаления VFA из сточных вод, зависит от R_g, R_p и R_e, когда R_t и R_c являются довольно быстрыми:

R _r=ƒ(R _g ,R _p ,R _e)

Поскольку энергетические требования для роста и полимеризации соединены со скоростью роста биомассы и/или продукцией PHA, можно считать, что скорость катаболизма VFA ограничивается зависимостью от скоростей роста и полимеризации:

R _e=ƒ(R _g ,R _p)

Поэтому R_r зависит от R_g и R_p, или

R _r=ƒ(R _g ,R _p)

Этот результат означает, что, когда R_t и R_c являются относительно быстрыми, ограничивающими скорость стадиями для удаления VFA являются R_p и/или R_g. Если R_g является незначительной из-за, например, периода голодания и/или недостатка необходимого для роста элемента вроде азота или даже кислорода, то ограничивающей скорость стадией или «узким местом» для удаления VFA является скорость полимеризации PHA или R_p. Предельные для R_p условия создаются, когда условия являются таковыми, что R_t и R_c, собственно говоря, являются значительно более быстрыми, чем R_p, так что R_p не зависит от R_t и/или R_c. Иными словами, в теории предельные для R_p условия или «предельная кинетика полимеризации PHA», как здесь используется, создаются, когда биомасса способна сохранять внутриклеточный пул PHA-мономеров (субстрата), которые питают процесс полимеризации для создания PHA (продукта), так что на скорость полимеризации (R_p) не влияет концентрация PHA-мономеров. Кроме того, когда R_p является ограничивающей скорость стадией, кинетика удаления VFA из иловой смеси является кинетикой нулевого порядка, т.е. не зависит от концентрации VFA в иловой смеси.

Принимая во внимание вышеприведенные теории кинетики полимеризации PHA, предсказывают, что молекулярные массы PHA, продуцированных в биомассе, увеличиваются по мере уменьшения вероятности реакций обрыва цепи во время процесса аккумуляции. В соответствии с этой моделью, вероятность обрыва цепи минимизируется посредством поддержания уровня предшественников в виде PHA-мономеров во время процесса аккумуляции, чтобы не ограничивать скорость полимеризации PHA. На такой уровень предшественников в виде PHA-мономеров может указывать кинетика удаления VFA нулевого порядка, или также максимальная спирометрическая величина, достигаемая в биомассе и сохраняемая в биомассе во время процесса аккумуляции. Кинетика удаления VFA, потребление кислорода, продукция углекислого газа и изменение pH являются примерами параметров, за которыми можно следить в процессе аккумуляции, в качестве средства определения максимальной спирометрической величины, которая была достигнута в биомассе, и того, на какой процент она уменьшается после каждой подачи RBCOD. Несмотря на эти теоретические представления и возможность для других таких представлений, настоящим изобретением обеспечивается выбор времени и подача количества RBCOD в иловую смесь, достаточного для стимуляции максимального ответа биомассы ради аккумуляции PHA для успешного получения полимеров PHA с высокой молекулярной массой параллельно с обработкой сточных вод.

В одном аспекте настоящее изобретение включает продукцию PHA с использованием непрерывных смешанных культур биомассы для обработки органики отходов. Тем не менее, принципы и методы, используемые в настоящем изобретении, могут использоваться в процессах, включающих чистые или смешанные культуры с ограничением бактерий и/или более очищенная RBCOD-фракция или другое исходное сырье для продукции биомассы и/или PHA.

Можно приготовить собираемую из устройств для обработки сточных вод биомассу для аккумуляции PHA после подачи RBCOD-содержащих сточных вод. Биомасса, обогащенная аккумулирующими PHA бактериями, может обычно аккумулировать более 50% PHA от своего общего сухого остатка (активная биомасса плюс PHA). Должна подаваться порция RBCOD для достижения достаточно высокой исходной концентрации, чтобы стимулировать ответ в виде накопления РНА в биомассе, но не слишком высокой концентрации, чтобы привести к какой-либо форме ингибирования метаболизма, которое, возможно, будет наносить ущерб процессу, что касается выхода полимера и продуктивности.

Хотя использование спирометрии биомассы и подпитываемых реакторов стало нормой при исследованиях для определения аккумуляции PHA в системах с использованием смешанных культур, за практическое осуществление технологии в достаточной мере не брались, и оно не было продемонстрировано. Все еще требуется, например, способ спирометрического контроля для точной манипуляции молекулярной массой PHA в подпитываемой структуре и ее оптимизации.

Настоящим изобретением обеспечивается контролируемое добавление RBCOD в биомассу для оптимизации распределения в сторону более высокой молекулярной массы полимера. Одним аспектом настоящего изобретения является способ продуцирования PHA с высокой молекулярной массой в биомассе, включающий:

• подачу органического углеродсодержащего субстрата в аккумулирующую PHA биомассу посредством периодической подачи субстрата в биомассу в течение периода времени, и

• контролирование частоты и суммы подач субстрата так, чтобы интенсивность дыхания биомассы не опускалась более чем на 70% относительно максимальной интенсивности дыхания, которой достигла биомасса в ответ на самую последнюю подачу субстрата.

Можно следить за тем, что определяет достаточно большую величину импульса, и регулировать его в реальном времени на основе наблюдаемой кинетики ответа биомассы. Рабочим диапазоном будут такие вводы массы RBCOD, которые будут периодически подвергать биомассу воздействию максимальных стимулирующих концентраций, предпочтительно в диапазоне между 20 и 500 мг-COD/л и более предпочтительно в диапазоне между 40 и 200 мг-COD/л.

Вводимые количества RBCOD могут быть постоянными, но предпочтительно они будут выше вначале и уменьшаться со временем по мере замедления кинетики полимеризации во время процесса аккумуляции PHA.

Вводы RBCOD в биомассу обеспечивают с достаточной частотой, так чтобы интенсивность сохранившегося дыхания биомассы не опускалась более чем на 70% и предпочтительно более чем на 30% относительно интенсивности дыхания, которая была достигнута в ответ на самый последний ввод RBCOD сточных вод.

Приемлемое снижение интенсивности дыхания для биомассы между вводами RBCOD зависит от суммы случаев ввода. Чем больше сумма случаев ввода или прерываний, тем меньше может снизиться сохранившиеся дыхание между этими случаями, если должна быть максимизирована молекулярная масса.

Высокая исходная концентрация биомассы и низкие концентрации поступающей RBCOD-фракции могут привести к необходимости увеличения суммы случаев стимулирующего воздействия.

Концентрация биомассы увеличивается во время процесса аккумуляции PHA вследствие аккумуляции массы PHA и/или роста микроорганизмов или другой не являющейся PHA биомассы в ходе процесса. Можно провести различие между общей биомассой и активной биомассой. Концентрация активной биомассы в процессе аккумуляции может определяться как общая концентрация биомассы (определяемая в виде летучих взвешенных твердых веществ) минус концентрация PHA.

На среднюю молекулярную массу PHA может оказывать меньшее влияние частота случаев стимулирующего воздействия, когда сохранившиеся дыхание не уменьшается более чем на 30 процентов от существующего максимального потенциала для него.

После насыщения биомассы PHA и в отсутствие одного или более других питательных веществ, необходимых для роста, биомасса может потреблять RBCOD лишь для поддержания клеток и эндогенного дыхания. В этот момент времени продуктивность PHA уменьшается, и становится значительно уменьшенной скорость удаления RBCOD. Обычно именно в этот момент времени прекращают процессы аккумуляции в смешанных культурах. Взвешенную фазу в виде биомассы и водную фазу разделяют, и продукт представляет собой биомассу с высокими уровнями аккумулированных PHA. Однако сток из такого процесса аккумуляции может содержать высокие уровни остаточной RBCOD, что делает необходимой дополнительную обработку, прежде чем конечный сброс стока будет дозволен.

Если биомасса становится насыщенной PHA в присутствии всех других питательных веществ, необходимых для роста, биомасса может потреблять RBCOD для поддержания процессов не относящегося к PHA роста и сохранения, помимо происходящего одновременно накопления PHA. На этой стадии возможно поддержание процесса аккумуляции до такого момента, когда масса PHA в реакторе достигнет оптимального уровня, и/или увеличение остающейся растворимой фракции COD в иловой смеси достигнет выбранного максимального уровня.

Одним вариантом осуществления настоящего изобретения является запуск процесса аккумуляции PHA в непрерывных смешанных культурах, когда сброс вод от процесса аккумуляции биологически обрабатывают, по крайней мере что касается содержания в них RBCOD. Другим осуществлением настоящего изобретения является запуск процессов аккумуляции PHA с использованием реальных сточных вод, когда уровни питательных веществ, отличных от RBCOD, используемые для продукции PHA, стимулируют процесс накопления PHA, объединенного с метаболическими активностями биомассы, не относящимися к приросту PHA.

При практических применениях объем является предельным и представляет значительные затраты на строительство для процесса аккумуляции. Исходное сырье, подходящее для аккумуляции PHA, может не всегда быть в значительной степени сконцентрированным, и поэтому может существовать проблема в достижении концентраций RBCOD, достаточных для достижения оптимальных скоростей аккумуляции PHA и качества PHA. В любом случае более желательными являются более низкие вводимые количества подачи, поскольку, чем выше частота подачи, тем больше существует возможностей для более жесткого контроля процесса, связанных с манипуляцией изменений состава подачи, а также избегания избыточного количества RBCOD в растворе в конце серийного цикла аккумуляции PHA. Подпитываемый процесс с использованием большей частоты ввода в качестве подпитки начинает приближаться к условиям стратегии непрерывной подачи. По мере увеличения частоты подачи различие между стратегией подпитки и стратегией непрерывной подачи становится размытым. Поэтому объемная скорость подачи, а не частота ввода дозы становится эквивалентным параметром при контролировании и в технологическом процессе.

Подпитываемый процесс можно выполнять посредством вводов отдельных доз выбранного объема, применяемых ко всей биомассе в реакторе с полным смешиванием. Подпитываемый процесс можно также выполнять посредством приведения биомассы в боковом потоке или в индивидуальных зонах реактора в контакт с вводом RBCOD, так что организмы в биомассе подвергаются различным стимулам от подачи субстрата и различным периодам прерывания подачи субстрата. Когда биомассу приводят в контакт с субстратом либо в реакторе с полным смешиванием, либо в зонах или в боковых потоках, подача может осуществляться импульсно или постоянно. Прерывание подачи может определяться условиями, когда микроорганизмы в биомассе испытывают снижение питания во времени или пространстве из-за подвергания воздействию среды, в которой существует отрицательный градиент концентрации субстрата. Таким образом, принцип, воплощенный в способе настоящего изобретения для аккумулирования PHA в биомассе, влечет за собой импульсную подачу, а также прерывания подачи. Определенные термины используются здесь для описания как импульсной подачи, так и прерываний подачи. Например, «периодическая подача субстрата в биомассу» или «периодическая подача» включает импульсную подачу, а также обеспечение прерываний подачи и, в частности, включает импульсную подачу субстрата в биомассу или циркуляцию части биомассы из зоны с относительно низкой концентрацией субстрата в зону с относительно высокой концентрацией субстрата при непрерывной или не являющейся непрерывной подаче субстрата. В любом случае способом или процессом является периодическая подача субстрата в биомассу.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения процесс аккумуляции PHA продолжают, пока не достигнуты ограничения практического характера, не достигнуты цели подачи, не видны признаки насыщения в отношении аккумуляции PHA, и/или общая масса PHA в реакторе не достигла намеченного уровня. Признаки этих случаев включают:

• Ограничения практического характера, включающие физические ограничения реактора, такие как имеющийся в распоряжении объем бака для подпитываемого процесса с непостоянным объемом жидкости в реакторе.

• Ограничения практического характера, включающие ограничения в кинетике отделения биомассы от сбрасываемых сточных вод в случае подпитываемого процесса с использованием постоянного объема жидкости в реакторе.

• Цели подачи, включающие добавление RBCOD сточных вод на основе установленных или присущих определенному случаю, зарегистрированных норм выходов в результате превращения биомассы, которые могут меняться от сточных вод к сточным водам. Например, обычно регистрируемый выход в результате превращения в случае ферментированных сточных вод молочной промышленности составляет 0,4 кг-PHA, продуцированные на каждый кг-VFA-COD, который был потреблен. Следовательно, если биомассой является биомасса с известной емкостью аккумуляции PHA до 100% от исходного сухого остатка биомассы, то намеченное добавление сточных вод будет составлять 2,5 кг-COD на килограмм исходной биомассы.

• Признаки насыщения или точка окончания аккумуляции PHA, включающие любые или всякие из следующих определяемых сигналов:

• Начало увеличения RBCOD в используемом для аккумуляции реакторе, остающегося после каждого ввода в качестве подпитки.

• Замедление кинетики поглощения субстрата ниже установленного порогового значения, которое будет специфическим для типа используемых сточных вод.

• Насыщение PHA в биомассе, регистрируемое, используя определение в масштабе времени коэффициента отражения для биомассы в качестве индикаторного параметра.

• Намеченная цифра объемной продуктивности PHA, регистрируемая, используя определение в масштабе времени содержания PHA в биомассе (коэффициента отражения) в сочетании с концентрацией биомассы (мутности иловой смеси) в тех случаях, когда рост биомассы и накопление PHA происходят одновременно.

• Снижение спирометрической величины для биомассы ниже установленного порогового значения, которое будет специфическим для типа используемых сточных вод.

• Регистрируемое смещение спирометрической величины для биомассы в направлении ответа на вводы органических веществ в подпитываемые сточные воды к ответу, например, на вводы азота в сточные воды.

Время, необходимое для максимально возможной аккумуляции PHA в биомассе, может изменяться от партии к партии. Колебания могут иметь место в кинетике и других характеристиках процесса с использованием смешанной культуры вследствие, например, динамики микробной популяции, изменений метаболического состояния (физиологического состояния) и вариаций характеристик подачи поступающих сточных вод. Подходящее для аккумуляции PHA исходное сырье может включать исходное сырье, выбираемое из источников RBCOD, отличных от RBCOD, присущих сточным водам, используемым для получения аккумулирующей PHA биомассы. Такое в корне отличное исходное сырье может повысить экономику всего процесса и может приспособить состав RBCOD к продукции различных видов PHA.

Определение условий подпитки для аккумуляции PHA

Были проведены эксперименты с использованием биомассы в виде активированного ила, который был обогащен в отношении PAB на основе отбора в аэробных условиях с использованием пира-голодания, в двух 4-литровых лабораторных последовательных реакторах периодического действия (SBR). SBR эксплуатировали в виде параллельных процессов биологической обработки сточных вод. Ферментированные сточные воды молочной промышленности использовали в качестве подачи для продуцирования биомассы с высоким содержанием PAB. COD в ферментированных сточных водах молочной промышленности составляла приблизительно 90% от VFA. Ферментированные сточные воды дополняли макро- и микроэлементами сверх метаболических требований для активированного ила. SBR эксплуатировали с использованием равного 1 дню времени гидравлического задержания (HRT) и равного 4 дням времени задержания твердых веществ (SRT). Равное 1 дню HRT основывалось на 2×12-часовых циклах в день, где цикл определялся исходной точкой = 2-л объему иловой смеси в реакторе. В начале цикла 2 л сточных вод быстро подавали в аэробных условиях. Сточные воды и иловую смесь подвергали аэробной реакции с использованием уровня растворенного кислорода свыше 1 мг-О₂/л в течение приблизительно 11 часов. Впоследствии аэрацию и перемешивание прекращали, и допускали оседание активированного ила в иловой смеси в течение 30 минут в режиме покоя. После оседания сливали 2 л супернатанта. В одном из каждых 2 циклов 500 мл иловой смеси откачивали (отбрасывали) для контролирования SRT непосредственно перед тем, как аэрацию и перемешивание прекращали для осаждения. Когда активированный ил отбрасывали из реактора, сливали лишь 1,5 л супернатанта. Цикл пир-голодание представлял собой не более 2 часов пира непосредственно после подачи, а затем не менее 9 часов голодания, как определено благодаря как параллельным и детальным экспериментальным исследованиям цикла, так и обычному слежению за уровнем растворенного кислорода. Реакторы поддерживали неизменяющуюся концентрацию, составляющую приблизительно 2 г/л активированного ила. Схожую систему также использовали в полупромышленном масштабе, в соответствии с чем использовали один SBR с рабочим объемом, равным 400 л.

В одном ряду повторных экспериментов, охватывающем приблизительно 3 месяца работы SBR, отработанную биомассу подвергали импульсным вводам либо концентрированной уксусной кислоты, либо ферментированных сточных вод молочной промышленности. Цель состояла в определении ответа биомассы на стимул «пир» в условиях, когда сохранившееся содержание PHA в биомассе было незначительным. За ответом биомассы на эти вводы субстрата следили на основе отклонений в растворенном кислороде, а также на основе более детальных анализов качества воды в ходе ответа биомассы на соответствующие импульсные вводы органического субстрата. Ответ биомассы можно было смоделировать с помощью зависимости от формы (фиг. 1):

где

q_s = скорость потребления конкретного субстрата (мг-COD/г-биомассы/минуту)

k_s = коэффициент ответа биомассы на стимулирующее воздействие субстрата

s = исходная концентрация субстрата, обеспечивающая стимулирующее воздействие (мг-COD/л)

s_f = оцененная пороговая концентрация субстрата для определяемого ответа биомассы

s_m = концентрация субстрата, при которой достигается максимальный ответ в потреблении субстрата

q_m = максимальная оцененная скорость потребления конкретного субстрата

X = концентрация биомассы

R_r = скорость удаления субстрата из раствора

Полагают, что отклонения от модели при более высоких концентрациях стимула обусловлены аккумуляцией PHA в биомассе после ряда стимулов. После стимуляции биомассы импульсным вводом VFA наблюдали, что скорость удаления VFA (R_r) подчиняется кинетике нулевого порядка до значительно ниже оцененной концентрации s_f, и поэтому q_s была приблизительно постоянной после каждого из уровней соответствующего стимулированного ответа (s). Этот результат означал, что для стимуляции определяемого ответа на пир требуется достаточное количество субстрата (s_f), и метаболический ответ был чувствительным к уровню стимула (s) в случае стимулов, которые были ниже концентрации s_m. Однако после установления ответа он был устойчивым до тех пор, пока не были потреблены по существу все добавленные VFA.

Хотя наблюдаемые в результате таких экспериментов тенденции неуклонно воспроизводились, установлено, что величина ответа в повторных исследованиях в различные дни была непостоянной. Концентрация s_m колебалась от 40 до 115 мг-COD/л. Прямо пропорционально s_f колебалась от 3 до 9 мг-COD/л, а q_m колебалась от 8 до 21 мг-COD/г-биомассы/минуту. Если эти экспериментальные результаты должны считаться типичными, то добавления VFA в качестве подпитки, достигающие свыше приблизительно 150 мг-COD/л, должны быть достаточными для запуска процесса аккумуляции PHA, так что кинетика процесса аккумуляции ограничивается лишь внутриклеточной скоростью полимеризации PHA.

Однако добавления VFA в качестве подпиток в более низких количествах, достигающие вплоть до только 40 мг-COD/л, могут также быть соответствующими в зависимости от сохранившегося физиологического состояния биомассы в отношении полимеризации PHA. Добавления в более низких количествах будут также возможны, когда биомасса содержит значительные уровни PHA, поскольку кинетика полимеризации может замедляться на стадии с содержанием PHA в биомассе. Поскольку q_m, как отмечается, связана с s_m, кинетику ответа биомассы на исходный импульс, составляющий, например, 200 мг-COD/л, можно было использовать для определения в реальном времени минимальных добавлений массы VFA, необходимых для достижения ограниченной полимеризацией кинетики аккумуляции PHA. Следовательно, кинетики спирометрических величин могут использоваться в качестве прямой ответной реакции на требуемые добавления массы в случае подпитываемого процесса аккумуляции PHA.

Количество VFA, используемое для стимуляции теоретической предельной кинетики полимеризации PHA, может варьировать. Основываясь на полученной авторами настоящего изобретения текущей массе экспериментальных результатов, традиционным RBCOD-импульсным вводом, возможно, будет ввод, с помощью которого достигается исходный уровень стимула, составляющий 200 мг-COD/л, для биомассы с незначительным количеством накопленной PHA.

Поскольку s_m и q_m непосредственно связаны, кинетику потребления субстрата можно использовать для установления s_m в реальном времени благодаря слежению в масштабе времени во время процесса аккумуляции. Ожидают, что концентрация s_m, которую необходимо добавлять для поддержания теоретической предельной кинетики полимеризации PHA, уменьшится на стадии с процессом аккумуляции, поскольку по мере аккумуляции PHA в биомассе теоретическая скорость полимеризации PHA уменьшается.

Использование спирометрии для контролирования подпитки

Авторы настоящего изобретения провели несколько рядов экспериментов по аккумуляции, используя сконцентрированные ферментированные сточные воды молочной промышленности и чистой смеси VFA в качестве подачи в аэробных подпитываемых реакторах, используемых для лаборатории, и полупромышленное продуцирование PHA с использованием биомассы, обогащенной аккумулирующими PHA бактериями, происходящей из систем обработки сточных вод с использованием SBR. Подпитываемые реакторы эксплуатировали с использованием последовательных вводов сточных вод с высоким содержанием VFA с использованием стратегии контроля на основе растворенного кислорода (DO), порождающих типичные отклонения в растворенном кислороде, как показано на фиг. 2.

Используя стратегию контроля на основе DO, допускали теоретическую предельную кинетику полимеризации PHA в соответствии с ранее отмеченными экспериментальными результатами для условий аккумуляции РНА в импульсном подпитываемом процессе. Первоначальная концентрация VFA после каждого ввода составляла номинально 200 мг-COD/л. Вводы в качестве подпиток контролировали в результате слежения в масштабе времени за концентрациями растворенного кислорода (DO). В случае условий постоянного перемешивания, постоянной аэрации и постоянного газо-жидкостного перехода массы кислорода изменения DO можно было связать с лежащими в основе изменениями интенсивности дыхания биомассы. Уменьшение DO указывало на относительное увеличение интенсивности дыхания биомассы, а увеличение DO указывало на относительное снижение интенсивности дыхания биомассы. Стратегией контроля была следующая стратегия:

a. Неизменяющийся уровень DO устанавливали до первого ввода VFA. Этот уровень DO (DO_r) в исходной точке создавал точку для исходной фоновой (эндогенной) интенсивности дыхания биомассы с незначительным содержанием PHA.

b. В случае каждого соответствующего стимула в виде VFA-ввода в качестве подпитки на максимальную интенсивность дыхания биомассы указывал достигнутый минимальный уровень DO (DO_m).

c. Последующий VFA-импульсный ввод инициировали при относительном увеличении DO, отображающем снижение интенсивности дыхания биомассы вследствие истощения субстрата. После определения каждого DO_m относительное повышение DO в момент времени (DO_t) выше заранее определенного критического порогового значения (δ*) использовали для инициирования последующего одиночного импульсного ввода из насоса для подачи VFA, как указано далее:

$$очередная\text{ подача}{\text{, после оценки DO}}_{\text{m}\text{, }}когда{\delta }_t=\frac{D{O}_t-D{O}_m}{D{O}_r-D{O}_m}\text{ превышает }\delta \ast \text{(уравнение 3)}$$

d. Аккумуляции выполняли в течение установленных периодов времени и с использованием меняющейся величины исходных концентраций биомассы. В этих экспериментах периоды времени аккумуляции колебались от 5 до 20 часов.

В одном ряду экспериментов процесс аккумуляции контролировали с использованием δ*, номинально равного 0,35. Сумму импульсов регулировали, используя различные концентрации импульсов (20-500 мг-COD/л) и различные концентрации DO (0,1-3,0 мг/л) при максимальной интенсивности дыхания.

Было отмечено, что сумма вводов в качестве подпиток влияет на результирующую молекулярную массу полимера PHA (фиг. 3). В то же самое время была отмечена степень вариабельности молекулярной массы в области уменьшенных вводов в качестве подпиток. Эту вариабельность можно было объяснить различными условиями аэрации, которые, возможно, приводят к различным результатам в отношении смещения спирометрической величины на фоне одного и того же номинального δ*, используемого в соответствии с контролированием процесса. Следовательно, точное сохранение дыхания биомассы (в противоположность DO в уравнении 3) при контролировании подпиток является значимым и становится даже более значимым по мере увеличения суммы вводов в качестве подпиток. Для сохранения ввода порции из условия, чтобы концентрации RBCOD были как можно меньше, необходимо больше случаев ввода в качестве подпитки. Так же, чем выше концентрация активной биомассы в реакторе, тем больше потребуется вводов в качестве подпиток для поддержания желаемого дыхания биомассы.

В другом ряду экспериментов цикл в схожих условиях, но на основе диапазона выбранных δ*, более низких значений δ* для аккумуляции с использованием подпиток, включающей множество вводов в качестве подпиток в биомассу, имел тенденцию к даче в результате большей молекулярной массы PHA к концу аккумуляции. Порционно-импульсные вводы достигали зарождающиеся с помощью импульсов концентрации, составляющие 200 мг-COD/л, и контрольный параметр определяли по уравнению 3 (фиг. 4). Как и в случае результатов, представленных на фиг. 3, более высокая степень вариабельности отмечалась в области δ* между 0,3 и 0,4 (фиг. 4).

Как правило, чем больше сумма вводов в качестве подпиток, тем более значительным является сохранение кинетики полимеризации для достижения более высокой конечной средней молекулярной массы PHA, представляемой как M_w. В тех экспериментах, в которых можно было оценить кинетику переноса массы кислорода при аэрации, было проведено уравновешивание масс кислорода, и были точно определены смещения дыхания биомассы в результате порционно-импульсной стимуляции и прерывания. Таким образом, средние снижения сохранившегося дыхания, соответствующие выбранным пороговым значениям δ*, были определены для каждого эксперимента по аккумуляции с использованием подпиток (фиг. 5, 6 и 7). На фиг. 5 каждый ввод в качестве подпитки соответствует отклонению уменьшенного DO к минимальному значению. Инициирование каждого ввода в качестве подпитки было в соответствии с уравнением 3, и для этой аккумуляции использовали заданное значение δ*, равное 0,3.

Хотя отмеченная вариабельность указывает на то, что другие факторы вносят вклад в конечную среднюю молекулярную массу PHA, среднее значение снижения интенсивности дыхания биомассы между случаями ввода-подпитки является важным параметром для контролирования. В одном варианте осуществления настоящего изобретения интенсивность дыхания биомассы поддерживают на уровне, составляющем более 30 процентов от существующего максимума. В предпочтительном варианте осуществления интенсивность дыхания биомассы поддерживают на уровне, превышающем 40 процентов от существующего максимума. В более предпочтительном варианте осуществления среднее значение интенсивности дыхания биомассы поддерживают на уровне, превышающем 70 процентов от существующего максимума. Составляющее вплоть до 30 процентов снижение относительных интенсивностей дыхания между случаями ввода в качестве подпитки является предпочтительным для того, чтобы уменьшить отрицательное влияние увеличенной теоретической вероятности обрыва цепи во время процесса аккумуляции PHA. Как правило, подразумевается, что высокая вероятность обрыва цепи во время аккумуляции PHA в биомассе приводит к более низкой средней молекулярной массе.

В одном варианте осуществления контроль вводов в качестве подпиток основан на критической точке для дыхания, а не только на растворенном кислороде. На фиг. 6 иллюстрируется, каким образом выбор инициирования ввода в качестве подпитки, основанный на уравнении 3, переносился на соответствующее относительное уменьшение относительного дыхания между случаями стимулирующего воздействия RBCOD. Заданное значение δ* занижало фактического значение δ* после подачи из-за задержки ответной реакции и контроля (♦). Различия между заданным и фактическим значениями δ* были наибольшими в начале аккумуляции вследствие того факта, что биомасса более активна в начале аккумуляции. Соответствующее фактическим значениям δ* результирующее относительное снижение интенсивностей сохранившегося дыхания перед следующим вводом порции было установлено (▪).

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения контроль вводов в качестве подпиток подвергают количественной калибровке до фактических смещений спирометрических величин для биомассы.

Определение молекулярной массы PHA

Средняя молекулярная масса отражает средний размер длин цепей полимеров. В большинстве случаев PHA представляет собой полимер с относительно широким распределением по молекулярной массе. M_n является среднечисловой молярной массой, и ее определяют как:

где N_i является числом молекул с молярной массой M_i. Средневзвешенную молярную массу, M_w, определяют как:

Коэффициент полидисперсности (PDI), показатель распределения по молекулярной массе, определяют как:

M_w всегда больше M_n, следовательно PDI будет всегда больше 1. PDI для смолы на основе PHA обычно составляет приблизительно 2, и M_w, как было отмечено, обычно колеблется от 10000 до 3000000 Да. На распределение по молекулярной массе может влиять способ аккумулирования PHA в биомассе, способ получения смолы на основе PHA и способ дальнейшей переработки смолы в продукты для конечных потребителей.

PHA экстрагировали из промытой дистиллированной водой и высушенной биомассы ацетоном (20 мг-биомассы, содержащей номинально 10 мг-PHA на мл ацетона) при 125°C в течение 2 часов. Экстрагированный полимер в ацетоне сливали с осадка остальной биомассы, и растворитель выпаривали.

Распределение по молекулярной массе (с обращением к полистироловым стандартам) экстрагированного полимера определяли с помощью гель-хроматографии (SEC). SEC выполняли с использованием насоса (Viscotek VE 1122), двойного детектора рефрактометр/вискозиметр (Viscotek Model 250) и трех продольных колонн, соединенных в ряд (Shodex KF-805, Shodex KF-804 и Shodex KF802.5). Температура детектора составляла 37^οC, в то время как исследования проводили при комнатной температуре. Используемым растворителем был хлороформ (Merck в каждом анализе >99%) со скорость потока, равной 1 мл/мин. Объем инъекции составлял 100 мкл.

Калибровку молекулярной массы выполняли относительно четырех различных полистироловых стандартов с известными средними молекулярными массами, составляющими 1800, 650, 96 и 30,3 кг/моль, соответственно. Для исследования сигнала от стандартов и образцов использовали детектор, определяющий показатель преломления.

Исследуемый с помощью SEC образец растворяли в хлороформе до концентрации, равной 5 мг/мл, при 100°C в течение 10 минут. Перед инъекцией образца в колонку раствор полимера подвергали фильтрованию (PALL Life Sciences Acrodisc ® CR 25 мм Syringe Filter с размером пор=0,45 мкм). Исходя из результирующего распределения по молекулярной массе PHA из каждого образца рассчитывали характеристические величины M_w, M_n и PDI.

Средневзвешенная молярная масса, M_w, была принятым показателем для молекулярной массы PHA в случае настоящего изобретения.

Определение максимальной молекулярной массы и скорости аккумуляции

Как кратко изложено выше, проблемой аккумуляции PHA с использованием подпиток является достижение максимальной молекулярной массы при поддержании высокой скорости полимеризации с низкой вероятностью обрыва цепи. Следующую методику можно использовать для определения ожидаемой молекулярной массы и скорости аккумуляции, которые можно получить для конкретной биомассы в конкретной совокупности условий окружающей среды. Этот максимум может служить в качестве точки сравнения для аккумуляций с использованием подпиток, которые проводят с использованием одной и той же комбинации биомассы и RBCOD в более легко достижимых подпитываемых условиях в крупномасштабной системе.

Используют биомассу с большим потенциалом аккумуляции PHA, но с низким исходным содержанием PHA (ниже 5% от всех взвешенных твердых веществ). Биомассу соответственно перемешивают, и обеспечивают аэрацию из условия, чтобы концентрация растворенного кислорода всегда составляла приблизительно 2 мг/л.

К биомассе добавляют углеродный субстрат в форме RBCOD из условия, чтобы продуцировалось значительное количество PHA без необходимости более чем трех вводов субстрата в качестве подпиток. Таким образом, концентрация RBCOD, воздействию которой подвергается биомасса, не будет опускаться ниже 100 мг/л более чем максимум три раза в ходе эксперимента по аккумуляции. Методично соблюдают минимальные прерывания подачи, используя, например, стратегию контроля уравнения 3. Соответствующие концентрации RBCOD в вводе-подпитке находятся в диапазоне от 0,5 до 2 г/л.

Молекулярная масса PHA, экстрагированного из биомассы в конце такого эксперимента, может обозначать практически достижимый максимум, который можно получить с использованием конкретной комбинации биомассы и субстрата. Наибольшая удельная скорость аккумуляции PHA, наблюдаемая в ходе такого эксперимента, (представляемая в виде g-PHA на g-активной биомассы в час) может использоваться для показа максимальной скорости аккумуляции PHA в биомассе в репрезентативных условиях окружающей среды. (Смотрите, например, Lemos et al., 2006, Serafim et al., 2004, Serafim et al., 2008). Более высокая молекулярная масса, как представляется, связана с сохранением, в среднем, более высоких интенсивностей дыхания между случаями порционно-импульсных стимулирующих воздействий, как продемонстрировано на фиг. 7.

Определение точки окончания процесса аккумуляции

После того как непрерывные смешанные культуры биомассы с высоким содержанием PAB аккумулировали PHA, продуцированный с использованием RBCOD-фракции, происходящей из сточных вод, не всегда возможно сохранение накопления PHA в качестве доминирующей метаболической активности. Если сточные воды содержат другие весьма важные питательные вещества, необходимые для не связанного с PHA микробного роста, то фракция RBCOD может потребляться для увеличения количества активной биомассы. Следовательно, во время процессов аккумуляции PHA и внутриклеточное накопление PHA, и микробный рост могут происходить одновременно. Ответ в виде микробного роста может увеличиваться в ходе процесса аккумуляции PHA, но ответ в виде увеличенного роста не обязательно означает уменьшение аккумуляции PHA в биомассе. Например, в некоторых экспериментах процесс аккумуляции PHA был выполнен с использованием биомассы с высоким содержанием PAB и ферментированных сточных вод молочной промышленности, в которых содержание азота является ограниченным, но которые, тем не менее, содержат достаточное количество азота, фосфора и других микроэлементов для поддержания ответа в виде не связанного с PHA роста в биомассе во время процесса аккумуляции PHA. Биомасса достигала номинального содержания PHA, составляющего 50% от всех взвешенных твердых веществ, но после этого момента времени рост в сочетании с накоплением PHA приводит к общему увеличению как активной биомассы, так и содержания PHA. Относительное содержание PHA в биомассе оставалось неизменным или слегка увеличивалось. В таких случаях высокая спирометрическая величина биомассы остается долгое время после достижения максимального содержания PHA, поскольку общая биомасса в процессе продолжает увеличиваться. В противоположность этому, когда в эту же биомассу подаются сточные воды, содержащие лишь RBCOD, дыхательный ответ биомассы на ввод RBCOD, как было отмечено, значительно снижается после аккумуляции максимального количества PHA. Поскольку при осуществлении на практике продукции PHA из RBCOD в сточных водах должны обеспечиваться сточные воды с RBCOD, а также присутствие других питательных веществ, сама по себе интенсивность дыхания может не обеспечить достаточный показатель для определения точки окончания или критерия прекращения. Было отмечено, что биомасса с высоким содержанием PAB может проявлять одну и ту же способность в отношении аккумуляции PHA, но с изменяющейся кинетикой аккумуляции, поэтому заданная продолжительность может также не быть достаточным критерием для этого подпитываемого процесса.

Авторы настоящего изобретения обнаружили изменения коэффициента отражения или цвета биомассы при аккумуляции PHA. Это изменение цвета, как представляется, находится в прямой зависимости от количества PHA, содержащегося в биомассе. Поэтому в одном варианте осуществления способ настоящего изобретения включает слежение за концентрацией взвешенных твердых веществ в иловой смеси, а также относительным изменением коэффициента отражения (цвета) взвешенных твердых веществ, чтобы следовать за процессом аккумуляции PHA. В предпочтительном варианте осуществления за изменением коэффициента отражения или цвета биомассы следят с помощью метода обратного рассеивания света при длинах волн ближней ИК-области спектра. Пример данных от такого слежения представлен на фиг. 8. На фиг. 8 исходная концентрация биомассы составляла 1,5 г-VSS/л, и порционно-импульсные вводы приводили к теоретической номинальной максимальной концентрации RBCOD, равной 55 мг-COD/л, в случае каждого случая подачи. Всего 81 ввод в качестве подпиток был осуществлен со средним фактическим значением δ*, равным 0,22 (уравнение 3), которое служило для сохранения интенсивностей дыхания в среднем на уровне 59% от существующего максимума. Шесть разовых проб было взято во время аккумуляции, и концентрацию PHA в этих образцах определяли с помощью широко известных способов количественного определения GCMS (♦). Линия общего направления сообщает об используемом для контролирования в масштабе времени сигнале определения мутности методом обратного рассеивания света, используя свет ближней ИК-области спектра при 880 нм.

Для максимизации извлечения желаемых PHA из процесса аккумуляции PHA процесс можно прекратить после достижения одной или нескольких пороговых величин. Посредством определения спирометрической величины в процессе в сочетании с определением содержания PHA в реакторе и остающейся фракции RBCOD можно установить критерии прекращения, связанные с практической возможностью технологического процесса, ограничениями сброса сточных вод, объемной продуктивностью PHA, выходами PHA, исходя из субстрата, и т.п. Квалифицированный в данной области техники специалист может осознать практические, технические, экономические и/или экологические ограничения в отношении выполнения для определения того, когда прекращать процесс аккумуляции PHA.

Примеры

Следующие примеры являются иллюстрацией способов и процессов настоящего изобретения и не должны рассматриваться как его ограничение.

Процесс аккумуляции PHA, описываемый в этих примерах и на всем протяжении этого описания изобретения, можно выполнить в качестве части процесса биологической обработки сточных вод или в качестве дополнения к процессу обработки сточных вод, или полностью обособленно от процесса обработки сточных вод. В типичном процессе биологической обработки сточных вод поступающие сточные воды или поток сточных вод направляют в систему обработки сточных вод, которая обычно включает один или более реакторов, сепаратор твердых веществ и другие дополнительные компоненты. Активированный ил используют для биологической обработки поступающих сточных вод. Обычно активированный ил смешивают с поступающими сточными водами с образованием иловой смеси, и иловую смесь подвергают биологической обработке. Обычно иловую смесь подвергают аэробным условиям, условиям кислородного голодания и/или анаэробным условиям для выполнения различных процессов биологической обработки. Например, известна биологическая обработка сточных вод для удаления BOD, COD, фосфора, азота и других загрязнений. Сепаратор твердых веществ, такой как отстойник, используют для отделения активированного ила от сточных вод, и отделенный активированный ил используют повторно и смешивают с входящим потоком сточных вод, в то время как часть активированного ила отбрасывают.

Биомассу, которая образует часть активированного ила или отработанного активированного ила, можно затем использовать в процессах аккумуляции PHA, описываемых здесь. Здесь биомассу отделяют от активированного ила или отработанного активированного ила и направляют в один или более реакторов, в которых применяется процесс аккумуляции PHA. Пищу для биомассы можно взять из поступающих сточных вод, которые обычно включают RBCOD. Существуют случаи, когда концентрация RBCOD или тип RBCOD поступающих сточных вод являются не подходящими для процесса аккумуляции PHA. Поэтому в некоторых случаях в биомассу подают альтернативный или дополненный поток сточных вод или другой пищевой поток с подходящей концентрацией и типом RBCOD.

Первым примером является подпитываемый процесс аккумуляции PHA, в котором объем активной жидкости (иловой смеси) увеличивается в ходе цикла (фиг. 9 и 10). Второй пример является аналогичным за исключением того, что конфигурацией реактора объясняется, где объем активной жидкости является постоянным в течение цикла аккумуляции (фиг. 11). Цикл аккумуляции кратко описан ниже.

Оба примера включают стратегии слежения для определения удельной скорости потребления субстрата (q_s, уравнение 2). Например, q_s можно определить посредством определения:

1. Концентрации биомассы, X, на основе спектроскопии в ультрафиолетовой/видимой области;

2. Скоростей удаления RBCOD, рассчитанных на основании:

a. спектроскопии в ультрафиолетовой/видимой области и/или

b. промежутка времени увеличения и уменьшения интенсивностей дыхания биомассы.

Массу RBCOD, подаваемую в процесс с каждым вводом сточных вод, можно подсчитать. Если известна только концентрация RBCOD, масса, подаваемая в процесс, равна подаваемому объему, умноженному на концентрацию RBCOD.

В соответствии с уравнением 1, стимулирующая концентрация RBCOD, s, в случае каждого ввода в качестве подпитки должна превышать или быть равной s_m. Способы применения этого принципа могут включать следующие стадии:

1. Использование постоянного традиционного ввода в качестве подпитки для достижения теоретической предельной кинетики полимеризации PHA. Например, первоначальная стимуляция, s, составляющая 200 мг-RBCOD/л, является традиционной на основе имеющихся в настоящее время экспериментальных данных.

2. Оценку имеющейся s_m на основе ответа биомассы на каждый ввод в качестве подпитки. Принимая во внимание оцененную q_s для стимулирующего воздействия в результате ввода в качестве подпитки - s, s_m можно оценить благодаря отмеченной взаимосвязи между s_m и k_s (уравнение 1). Можно осуществить калибровку связи, в частности, для различных подач сточных вод, как это было сделано для получения результатов, представленных на фиг. 1.

3. Оценку имеющейся s_m на основе ответа биомассы на каждый ввод в качестве подпитки посредством использования ожидаемой связи уравнения 1, используя небольшое, но значительное смещение в сторону увеличения и/или уменьшения s от одного ввода к следующему. Можно использовать алгоритм для контролирования подходящей оптимизации, чтобы следовать за s_m в ходе цикла аккумуляции.

Пример аэробного процесса аккумуляции PHA с использованием непостоянного объема представлен на фиг. 9 и 10. Система представлена в начале процесса аккумуляции до первой подачи сточных вод из P2. На фиг. 10 представлен только бак T2. Система представлена в конце процесса аккумуляции (A), когда порция из DAF подается (B) для отделения стока от концентрируемой биомассы (C).

T1 - аэрируемый бак постоянного объема, используемый для быстрого объединения поступающих сточных вод (P2) с рециркуляционной иловой смесью (P3). Этот бак является баковым реактором с полным смешиванием при перемешивании, который может быть аэрируемым.

T2 - аэрируемый бак, который может обеспечить увеличение объема вследствие потока сточных вод, добавляемого в T1. Здесь осуществляют рециркуляцию иловой смеси обратно в реактор T2 из T1. Этот бак является аэрируемым баковым реактором с полным смешиванием при перемешивании.

DAF - резервуар для поставки растворенного воздуха для достижения флотации растворенного воздуха (DAF) в T2. DAF позволяет сконцентрировать иловую смесь в реакторе T2 после или под конец процесса аккумуляции PHA.

P5 - монтаж насоса и клапана для сброса стока и/или уплотненной биомассы после отделения биомассы с помощью DAF.

P1 - средство для добавления химических веществ. Химические вещества могут использоваться для кондиционирования биомассы ввиду улучшенного разделения с помощью DAF и/или кондиционирования биомассы ввиду улучшенного извлечения PHA после аккумуляции.

M1 - слежение в масштабе времени за качеством воды, дыханием биомассы и коэффициентом отражения биомассы в баке T1 постоянного объема.

M2 - слежение в масштабе времени за качеством воды, дыханием биомассы, коэффициентом отражения биомассы и объемом жидкости в баке T2 непостоянного объема.

В одном варианте осуществления процесс аккумуляции развивается следующим образом:

1. Отработанный активированный ил (WAS) биомассы с высоким содержанием PAB со станции обработки сточных вод (WWTP) подается в T2 с помощью P4.

2. Смешивание и аэрацию в T2 прекращают. Биомассу не подвергают рециркуляции (P3), так что весь объем поступившего WAS удерживается в T2.

3. WAS далее концентрируют с помощью DAF, и реактор освобождают от расположенного внизу осветленного стока (P5). Таким образом, объем иловой смеси в реакторе T2 меняется.

4. Начинают аэрацию в T2 и T1, как и запуск насоса для рециркуляции P3. Исходные условия в отношении концентрации биомассы, концентрации растворенной органики и интенсивностей дыхания определяют на основе слежения M1 и M2.

5. Начинают введение доз в качестве подпиток поступающих сточных вод (P2) из условия, чтобы:

а. Достигалась намеченная максимальная концентрация в T1 для обеспечения достаточного для аккумуляции стимулирующего воздействия на биомассу.

b. Стимулирующее воздействие поддерживалось так, чтобы интенсивность дыхания биомассы сохранялась на своем существующем максимуме благодаря выбранным для Р2 и Р3 скоростям подачи с помощью насосов со слежением в масштабе времени M1 и M2.

c. Скорости ввода поступающих сточных вод и рециркуляционного потока могут основываться на определяемом уменьшении концентрации растворенной органики, оцененных скоростях уменьшения концентрации растворенной органики и/или уменьшении интенсивностей дыхания на основе M1 и M2.

6. Ввод сточных вод продолжают до тех пор, пока не исчерпан имеющийся в распоряжении объем реактора T2, не подана целевая масса RBCOD, и/или биомасса не проявляет признаки насыщения PHA вследствие, например, достижения плато или цели в отклонениях коэффициента отражения биомассы.

7. В конце подпитываемого процесса аэрацию в T1 и T2 прекращают, но смешивание и рециркуляцию в двух баках можно продолжать. В этот момент времени можно добавить химические вещества (P1) для ингибирования деградации накопленного PHA и для улучшения разделения с помощью DAF.

8. Биомассу в реакторе Т2 концентрируют с помощью DAF. Как правило, после того, как процесс аккумуляции PHA начался и достиг стационарного состояния, объем иловой смеси в реакторе T1 сохраняют, в целом, на постоянном уровне, в то время как объем иловой смеси в реакторе T2 меняется. Также следует принять к сведению, что реактор T1 в этом варианте осуществления меньше реактора T2, и поэтому объем иловой смеси в реакторе T1 меньше объема иловой смеси в реакторе T2.

9. Процесс освобождают от сконцентрированной с помощью DAF биомассы и стока.

10. Реактор готов к следующему циклу аккумуляции PHA.

Пример аэробного процесса аккумуляции PHA с использованием постоянного объема представлен на фиг. 11.

A - внутренний аэролифт, обеспечивающий быстрое смешивание поступающих сточных вод и реакторной иловой смеси в ограниченной зоне уменьшенного объема. Аэролифт обеспечивает аэрацию и смешивание в реакторе. В этом примере аэролифт представляет собой внутренний открытый цилиндр.

B - циркуляционная труба, которая на этой иллюстрации представляет собой коаксиальный цилиндр в случае, когда содержимое реактора рециркулируется обратно вниз во вход аэролифта.

C - неподвижная зона в реакторе, в которую газ аэролифта не поступает, и в которой взвешенные твердые вещества, поступающие в эту зону, будут оседать и вновь поступать в зону B.

M1 - слежение в масштабе времени за качеством воды, дыханием биомассы и коэффициентом отражения биомассы в аэролифте.

M2 - слежение в масштабе времени за качеством воды, дыханием биомассы, коэффициентом отражения биомассы и объемом жидкости в циркуляционной трубе.

P1-P4. Наносы для контролирования потока WAS, потока сточных вод, добавления химических веществ, освобождения от конечного стока (стока-2), сбора биомассы.

Сливная труба (сток-1) для освобождения от избытка осветленной жидкости из реактора для поддержания постоянного общего объема жидкости в реакторе.

В этом варианте осуществления процесс аккумуляции развивается следующим образом:

1. Вначале пустой реактор заполняют WAS с помощью насоса (P2).

2. Начинают аэрацию. Исходные условия в отношении концентрации биомассы, концентрации растворенной органики и интенсивностей дыхания определяют на основе слежения M1 и M2.

3. Начинают введение доз в качестве подпиток поступающих сточных вод (P3) из условия, чтобы:

a. Достигалась намеченная максимальная концентрация в А для обеспечения достаточного для аккумуляции стимулирующего воздействия на биомассу.

b. Стимулирующее воздействие поддерживалось так, чтобы вся биомасса подвергалась воздействию на основе слежения в масштабе времени M1 и M2 и/или определяемой скорости внутренней рециркуляции.

c. Последующие вводы поступающих сточных вод в качестве подпиток могут основываться на определяемом уменьшении концентрации растворенной органики, оцененных скоростях уменьшения концентрации растворенной органики и/или уменьшении интенсивности дыхания на основе M1 и M2.

4. Ввод сточных вод продолжают до тех пор, пока не подана целевая масса RBCOD, и/или биомасса не проявляет признаки насыщения PHA вследствие, например, достижения плато в отклонениях коэффициента отражения биомассы.

5. В конце подпитываемого процесса аэрацию можно ненадолго продолжить для сохранения перемешивания при добавлении химических веществ (P1). Химические вещества можно добавлять для ингибирования деградации накопленного PHA и для улучшения отделения биомассы с помощью осаждения под действием силы тяжести.

6. Биомассу концентрируют в реакторе с помощью осаждения под действием силы тяжести.

7. Процесс освобождают от сконцентрированной биомассы и стока (D и P4).

8. Реактор готов к следующему циклу аккумуляции PHA.

Изобретения относятся к биотехнологии. Предложены подпитываемые способы продуцирования высокомолекулярных полигидроксиалканоатов (PHA) в биомассе (варианты). Направляют биомассу в реактор, имеющий по крайней мере одну зону стимуляции с высокой средней концентрацией субстрата и по крайней мере одну зону сохранения с меньшей средней концентрацией субстрата. Периодически и неоднократно подают органический углеродсодержащий субстрат в биомассу в по крайней мере одной зоне стимуляции. Причем концентрация субстрата в зоне стимуляции находится между 10 и 1000 мг-COD/л. Осуществляют слежение за интенсивностью дыхания биомассы и определение концентрации субстрата в зоне сохранения. Циркулируют биомассу туда и обратно между зоной стимуляции и зоной сохранения так, чтобы интенсивность дыхания биомассы в зоне сохранения не уменьшалась на более чем 70% от достижимой максимальной интенсивности сохранившегося дыхания биомассы. После аккумуляции биомассой требуемого уровня РНА или достижения уровня насыщения PHA собирают биомассу из реактора. В другом варианте способа используют иловую смесь, содержащую биомассу. Способы позволяют получать РНА со средней молекулярной массой по меньшей мере 400000 г/моль. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 11 ил.

1. Подпитываемый способ продуцирования высокомолекулярных полигидроксиалканоатов (PHA) в биомассе, включающий
направление биомассы в реактор, имеющий по крайней мере одну зону стимуляции и по крайней мере одну зону сохранения;
периодическую и неоднократную стимуляцию интенсивности дыхания биомассы во время процесса аккумуляции РНА посредством подвергания по крайней мере части биомассы в по крайней мере одной зоне стимуляции воздействию повышенной концентрации субстрата, в то время как по крайней мере часть оставшейся биомассы подвергают воздействию случаев повышенной концентрации субстрата в зоне сохранения, которая меньше средних концентраций субстрата в зоне стимуляции;
слежение за интенсивностью дыхания биомассы в зоне сохранения, в которой концентрация субстрата в среднем ниже концентрации субстрата в зоне стимуляции, и ее определение, по крайней мере опосредованно;
циркуляцию биомассы туда и обратно между зоной стимуляции и зоной сохранения;
контролирование частоты рециркуляции биомассы или скорости добавления субстрата так, чтобы интенсивность дыхания биомассы в зоне сохранения не уменьшалась на более чем 70% от достижимой максимальной интенсивности сохранившегося дыхания биомассы;
сохранение биомассы в реакторе до аккумуляции биомассой требуемого уровня РНА или достижения уровня насыщения PHA;
сбор из реактора биомассы с высоким содержанием РНА;
причем неоднократное подвергание биомассы воздействию повышенной концентрации субстрата достигают направлением субстрата в зону стимуляции и смешиванием поступающего субстрата с подвергаемой рециркуляции биомассой;
причем повышенная концентрация субстрата в зоне стимуляции, используемая для неоднократной стимуляции интенсивности дыхания биомассы, находится между 10 и 1000 мг-COD/л;
причем вышеуказанная комбинация стадий способа обеспечивает аккумуляцию РНА, и причем аккумулированный РНА, после отделения от биомассы, включает среднюю молекулярную массу, составляющую по крайней мере 400000 г/моль.

2. Способ по п.1, включающий определение интенсивности дыхания биомассы в зоне сохранения с помощью методов слежения, таких как спектроскопия в ультрафиолетовой/видимой области, проводимости, ионных электродов, других химических сенсоров или их комбинации.

3. Способ по п.1, в котором субстрат и биомассу смешивают вместе с образованием смеси субстрата и биомассы с повышенной концентрацией субстрата, и который включает контролирование частоты, с которой любая конкретная часть биомассы подвергается стимулирующему воздействию повышенной концентрации субстрата, в зависимости от концентрации растворенного органического углерода или концентрации растворенной фракции COD в зоне сохранения.

4. Способ по п.1, в котором субстрат и биомассу смешивают вместе с образованием смеси субстрата и биомассы с повышенной стимулирующей концентрацией субстрата, и который, кроме того, включает контролирование частоты, с которой биомасса или ее части подвергаются стимулирующему воздействию повышенной концентрации субстрата, на основе интенсивности дыхания биомассы, вытекающей из слежения за концентрациями растворенного кислорода и/или углекислого газа.

5. Способ по п.1, в котором реактор включает реактор периодического действия и по крайней мере один отдельный бак, и в котором биомассу направляют в реактор периодического действия и смешивают с иловой смесью в реакторе периодического действия, и который включает направление биомассы и иловой смеси из реактора периодического действия в по крайней мере один отдельный бак и подачу субстрата в биомассу в отдельном баке, и в котором отдельный бак включает объем иловой смеси, который меньше объема иловой смеси в реакторе периодического действия, и в котором средняя концентрация субстрата в отдельном баке выше средней концентрации субстрата в реакторе периодического действия.

6. Способ по п.1, включающий концентрирование биомассы до, во время или после аккумуляции РНА в биомассе.

7. Способ по п.1, в котором контролирование частоты, с которой биомасса или ее части подвергаются стимулирующему воздействию повышенной концентрации субстрата, включает:
(i) периодическую подачу насосом субстрата в реактор, который включает биомассу;
(ii) циркуляцию биомассы из зоны сохранения с относительно низкой средней концентрацией субстрата в зону стимуляции с относительно высокой средней концентрацией субстрата.

8. Способ по п.1, в котором биомасса содержится в иловой смеси, а субстрат периодически подается в биомассу в зоне стимуляции; и в котором частоту подачи субстрата в биомассу контролируют посредством измерения концентрации растворенного кислорода в иловой смеси в течение выбранного периода времени и подачи субстрата в биомассу в ответ на увеличение концентрации растворенного кислорода в иловой смеси, которая превышает выбранное пороговое значение.

9. Способ по п.8, включающий контролирование частоты подачи субстрата в биомассу посредством соотношения концентрации растворенного кислорода в иловой смеси с интенсивностью дыхания биомассы и подачи субстрата в биомассу в ответ на уменьшение интенсивности дыхания в течение выбранного периода времени, которая меньше выбранного порогового значения.

10. Способ по п.1, который включает обработку потока сточных вод, и получение смешанной культивируемой биомассы, и сбор смешанной культивируемой биомассы, и подачу смешанной культивируемой биомассы в реактор периодического действия; и который влечет за собой использование по крайней мере части потока сточных вод или альтернативы потоку сточных вод в качестве источника субстрата, подаваемого в смешанную культивируемую биомассу.

11. Способ по п.1, в котором реактор включает первый бак, имеющий зону стимуляции, и второй бак, имеющий зону сохранения; и в котором биомасса содержится в иловой смеси; и способ включает циркуляцию иловой смеси и биомассы между первым и вторым баками и неоднократное подвергание воздействию случаев повышенной концентрации субстрата в первом баке, в то время как во втором баке биомассу подвергают воздействию концентраций субстрата, которые меньше концентраций субстрата в первом баке.

12. Способ по п.1, в котором зона стимуляции образована внутренним аэролифтом, обеспечивающим быстрое смешение поступающего субстрата и реакторной биомассы и циркуляцию биомассы между зоной сохранения и зоной стимуляции.

13. Способ по п.1, в котором повышенные концентрации субстрата в зоне стимуляции находятся между 20 и 500 мг-COD/л.

14. Подпитываемый способ продуцирования высокомолекулярных полигидроксиалканоатов (PHA) в биомассе, включающий
направление иловой смеси, содержащей биомассу, в реактор, включающий по крайней мере одну зону стимуляции биомассы и по крайней мере одну зону сохранения биомассы;
направление субстрата в зону стимуляции;
периодическую и неоднократную стимуляцию интенсивности дыхания биомассы во время процесса аккумуляции PHA для по крайней мере части биомассы в реакторе посредством подвергания части биомассы воздействию повышенной концентрации субстрата в зоне стимуляции;
после подвергания части биомассы воздействию повышенных концентраций субстрата в зоне стимуляции перемещение части биомассы из зоны стимуляции в зону сохранения, в которой концентрация субстрата меньше повышенной концентрации субстрата в зоне стимуляции;
слежение за интенсивностью дыхания биомассы в зоне сохранения и ее определение, по крайней мере опосредованно;
поддержание интенсивности дыхания биомассы в зоне сохранения так, чтобы интенсивность дыхания не уменьшалась на более чем 70% от достижимой максимальной интенсивности сохранившегося дыхания биомассы, посредством контролирования частоты, с которой биомасса неоднократно подвергается стимулирующему воздействию повышенной концентрации субстрата в зоне стимуляции;
циркуляцию иловой смеси, содержащей биомассу, туда и обратно между зоной стимуляции и зоной сохранения так, чтобы части биомассы неоднократно подвергались воздействию случаев повышенной концентрации субстрата в зоне стимуляции, и причем части биомассы в зоне сохранения неоднократно подвергают воздействию более низкой концентрации субстрата;
причем повышенная концентрация субстрата в зоне стимуляции находится между 10 и 1000 мг-COD/л; и
причем вышеуказанная комбинация стадий способа обеспечивает получение РНА, и причем полученный РНА включает среднюю молекулярную массу, составляющую по крайней мере 400000 г/моль.

15. Способ по п.14, в котором периодическая и неоднократная стимуляция интенсивности дыхания биомассы включает прекращение подачи субстрата в по крайней мере части биомассы множество раз и контролирование частоты подачи субстрата так, чтобы интенсивность дыхания биомассы не уменьшалась на более чем 70% от достижимой максимальной интенсивности сохранившегося дыхания биомассы.

16. Способ по п.14, в котором реактор включает первый бак, имеющий зону стимуляции, и второй бак, имеющий зону сохранения; и способ включает циркуляцию иловой смеси и биомассы между первым и вторым баками и неоднократное подвергание биомассы воздействию повышенной концентрации субстрата в первом баке, в то время как во втором баке биомассу подвергают воздействию концентраций субстрата, которые меньше концентраций субстрата в первом баке.

17. Способ по п.14, в котором зона стимуляции образована внутренним аэролифтом, обеспечивающим быстрое смешение поступающего субстрата и реакторной биомассы и циркуляцию биомассы между зоной сохранения и зоной стимуляции.

18. Способ по п.14, в котором подпитываемый способ продуцирования высокомолекулярных PHA в биомассе включает:
направление отработанного активированного ила, происходящего в результате процесса обработки сточных вод, в реактор, причем отработанный активированный ил включает аккумулирующую PHA биомассу;
циркуляцию биомассы из зоны сохранения в зону стимуляции и продолжение рециркуляции биомассы между зоной сохранения и зоной стимуляции;
подачу органического углеродсодержащего субстрата в аккумулирующую PHA биомассу в зоне стимуляции посредством периодической или постоянной подачи субстрата в зону стимуляции в течение периода времени; и
причем интенсивность дыхания биомассы стимулируют и поддерживают во время процесса аккумуляции PHA посредством подвергания биомассы в зоне стимуляции воздействию повышенной концентрации субстрата, в то время как концентрация субстрата в зоне сохранения меньше повышенной концентрация субстрата, достигаемой в зоне стимуляции.