ШТАММ Lactobacillus delbrueckii, СНИЖАЮЩИЙ СОДЕРЖАНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА В КРОВИ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 A23C9/123 A61K35/74 C12R1/225 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Изобретение относится к новому штамму Lactobacillus delbrueckii, обладающему свойствами снижения содержания холестерина в крови.

Сообщалось, что определенные ферментированные молочные продукты могут вызывать действие снижения содержания холестерина в крови. Данное действие зависит, в частности, от наличия в данных продуктах специфичных штаммов молочнокислых бактерий, относящихся к определенным заданным видам. В частности, ими являются штаммы enterococci, такие как Enterococcus faecium (Заявка EP0101209) или Enterococcus mundtii (PCT Заявка WO 2007/108583), bifidobacteria (PCT Заявка WO 2007/029773) (Xiao et al., J Dairy Sci, 86, 2452-61, 2003) и lactobacilli.

Среди lactobacilli штаммы, снижающие содержание холестерина в крови, были идентифицированы только у нескольких видов, таких как Lactobacillus casei (Brashears et al., J Dairy Sci, 81, 2103-10, 1998; Kapila & Sinha, Indian J Med Sci, 60, 361-70, 2006; Kawase et al., J Dairy Sci, 83, 255-63, 2000), Lactobacillus fermentum (Gilliland & Walker, J Dairy Sci, 73, 905-11, 1990; Pereira et al., Appl Environ Microbiol, 69, 4743-52, 2003) и особенно Lactobacillus acidophilus (Gilliland et al., Appl Environ Microbiol, 49, 377-81, 1985; Lin et al., J Dairy Sci, 72, 2885-99, 1989; Gilliland & Walker, J Dairy Sci, 73, 905-11, 1990; Gupta et al., Int J Food Microbiol, 29, 105-9, 1996; Anderson & Gilliland, J Am Coll Nutr, 18, 43-50, 1999).

С другой стороны, другие виды lactobacilli и, в частности, Lactobacillus delbrueckii, который является одним из видов, наиболее широко применяемых для изготовления ферментированных молочных продуктов, поскольку он составляет, в комбинации со Streptococcus thermophilus, общепризнанный "йогуртный симбиоз", до сих пор считался лишенным эффектов снижения содержания холестерина в крови.

Таким образом, было показано, что общепризнанные йогурты (полученные посредством ферментации с Lactobacillus delbrueckii + Streptococcus thermophilus) не обладали действием снижения содержания холестерина в крови молочных продуктов, полученных посредством ферментации с Lactobacillus acidophilus и Streptococcus thermophilus (Akalin et al., J Dairy Sci, 80, 2721-5, 1997) или с Bifidobacterium longum (Xiao et al., J Dairy Sci, 86, 2452-61, 2003). Также сообщалось, что введение Lactobacillus delbrueckii аксеническим (стерильным) мышам индуцировало снижение фекальной экскреции холестерина, но не изменение уровня холестерина в крови или печени. Когда Lactobacillus delbrueckii вводили мышам, испытывающим недостаток аполипопротеина E (ApoE KO мыши), не наблюдалось никакого эффекта ни в отношении фекального холестерина, ни в отношении холестерина в печени или в крови (Portugal et al., Braz J Med Biol Res, 39, 629-35, 2006).

Авторы изобретения выделили штамм Lactobacillus delbrueckii, который, неожиданно, обладает свойствами снижения содержания холестерина в крови. Также данный штамм обладает способностью роста на молоке, причем способность размножения штаммов Lactobacillus delbrueckii обычно использовали для изготовления йогуртов, и, вследствие этого, он может быть используем обычным образом для изготовления ферментированных молочных продуктов и, в частности, йогуртов.

Соответственно, настоящее изобретение предоставляет штамм Lactobacillus delbrueckii подвид lactis, депонированный 6 апреля 2007 года под номером I-3741 с CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) [Французская Национальная Коллекция Культур Микроорганизмов], 25 rue du Docteur Roux, in Paris.

Характеристики данного штамма состоят в следующем.

- Морфология: Грамм-положительный микроорганизм, более или менее длинные, зернистые бациллы (палочковидные бактерии), достаточно небольшие.

- Ферментация следующих сахаров (результаты получили на API 50 CH стрипе - среда API MRS при 37°C в течение 48 ч): D-глюкоза, D-фруктоза, D-манноза, N-ацетилглюкозамин, мальтоза, лактоза, сахароза, трегалоза.

Настоящее изобретение также предоставляет содержащий молочный фермент штамм Lactobacillus delbrueckii подвид lactis CNCM 1-3741, объединенный с одним или более другими штаммами (штаммом) молочнокислых бактерий.

Указанный другой штамм (штаммы) может, в частности, относиться к следующим видам: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei подв. casei, Lactobacillus casei подв. rhamnosus, Lactobacillus zeae, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasein Lactobacillus cremoris, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus delbrueckii подв. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii подв. lactis, Lactobacillus delbrueckii подв. delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii подв. bulgaricus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis подв. lactis, Lactococcus lactis подв. cremoris, Enterococcus faecium, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium animalis sp. lactis, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis.

Согласно одному предпочтительному варианту осуществления штамма, содержащего молочный фермент, в соответствии с настоящим изобретением, штамм Lactobacillus delbrueckii подвид lactis CNCM 1-3741 объединяют, по меньшей мере, с одним штаммом Lactobacillus delbrueckii bulgaricus и, по меньшей мере, одним штаммом Streptococcus thermophilus.

Настоящее изобретение также предоставляет способ получения ферментированного продукта, причем данный способ отличается тем, что он включает ферментацию подходящей среды штаммом CNCM 1-3741 или молочным ферментом в соответствии с изобретением, содержащимся в указанном штамме. Согласно одному предпочтительному варианту осуществления данного способа средой, используемой для ферментации, является молоко, или основанная на молоке среда, или растительный сок (фруктовый и/или овощной сок) или смесь данных сред.

Настоящее изобретение также предоставляет ферментированные продукты, в частности ферментированные молочные продукты, содержащие в себе бактерии штамма CNCM 1-3741 и необязательно бактерии одного или более других штаммов молочнокислых бактерий.

Согласно одному предпочтительному варианту осуществления ферментированного продукта в соответствии с изобретением он содержит, после ферментации, по меньшей мере, 1×10⁶ КОЕ (колониеобразующих единиц), предпочтительно, по меньшей мере, 1×10⁷ КОЕ и более предпочтительно между 1×10⁷ и 1×10⁹ КОЕ на мл бактерий штамма CNCM 1-3741.

Настоящее изобретение также относится к применению штамма CNCM 1-3741, или молочных ферментов или ферментированных продуктов, содержащихся в указанном штамме, для получения продуктов, которые вызывают снижение уровня холестерина в крови, в частности уровня холестерина ЛНП.

Настоящее изобретение станет более понятным с помощью описания, которое следует далее и которое относится к примерам, иллюстрирующим свойства снижения содержания холестерина в крови штамма CNCM 1-3741. Однако необходимо четко понимать, что данные примеры даны только в качестве иллюстрации предмета изобретения и никоим образом не составляют его ограничения.

ПРИМЕР 1: СНИЖАЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ШТАММА CNCM 1-3741 НА СОДЕРЖАНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА В КРОВИ IN VIVO

Действие потребления штамма CNCM 1-3741 (также упоминаемого здесь и далее как DN 111 244), и, в качестве положительного контроля, штамма 1-2273 Lactobacillus acidophilus, описанного в патенте EP1251860 (также здесь и далее упоминаемого как DN 112 001), было оценено in vivo у мышей с дефицитом аполипопротеина E (АpoE KO). Штамм 1-2273 представляет собой штамм, который обладает снижающей содержание холестерина в крови активностью in vitro, но который не может быть легко использован для получения ферментированных молочных продуктов, поскольку он очень плохо растет на молоке.

Протокол эксперимента состоит в следующем.

Сорок АpoE KO мышей, в возрасте от 9 до 10 недель, были разделены на 4 группы по 10 мышей. Данные мыши были предоставлены Charles River Laboratories, L'Arbresle (Франция).

Все мыши получали в течение 28 дней посредством принудительного кормления обогащенный липидами корм с добавлением:

- 300 мкл/день культуры, содержащей 6 × 10⁸ КОЕ штамма DN 111 244, полученного в условиях культивирования на MRS-молочной среде (группа 1);

- 300 мкл/день культуры, содержащей 6 × 10⁸ КОЕ штамма DN 112 001, полученного с применением таких же условий культивирования на MRS-молочной среде, как и условия, описанные для штамма DN 111 244 (группа 2);

- 300 мкл/день контрольного молока, композиция которого состоит в следующем: снятое молоко (контроль).

Штаммы DN 112 001 и DN 111 244 (CNCM 1-3741) культивировали на среде MRS. В дальнейшем их ресуспендировали в молоке таким образом, чтобы получилось молоко, содержащее 6 × 10⁸ КОЕ бактерий.

Суточное потребление пищи животными в трех группах было идентичным. Животных взвешивали в начале эксперимента и затем с 5-дневными интервалами на протяжении курса лечения. Значительной разницы между различными группами не наблюдалось.

Общий уровень холестерина в плазме и уровень холестерина ЛНП измеряли в начале эксперимента и после 28 дней лечения.

Анализ липидов плазмы

Результаты показаны на Фигурах 1 и 2. Данные результаты демонстрируют, что после 28 дней лечения снижение общего холестерина и холестерина ЛНП ("плохого" холестерина) наблюдается у животных групп 1 и 2 по сравнению с контрольной группой.

ПРИМЕР 2: РОСТ НА МОЛОКЕ ШТАММА CNCM 1-3741

Свойства, связанные с ростом на молоке штамма CNCM 1-3741, исследовали, используя следующий протокол.

Среду, полученную из восстановленного снятого молока (120 г порошка снятого молока в одном литре дистиллированной воды, дополненной 2 г/л дрожжевого экстракта), инокулировали штаммом CNCM 1-3741 или, в качестве сравнения, L. Delbrueckii подвидом bulgaricus штамма CNCM 1-1519 (данный штамм, который описан в Заявке EP 0858501, обладает обычными свойствами в показателях ферментации).

Ферментативную активность штаммов, связанную с их ростом, измеряли с помощью постоянного контролирования рН ростовой среды.

Результаты даны на Фигуре 3.

Данные результаты показывают, что штамм CNCM 1-3741 способен эффективно расти на молоке и что вследствие этого он может быть использован для изготовления ферментированных молочных продуктов.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен штамм Lactobacillus delbrueckii подвид lactis CNCM I-3741, снижающий содержание холестерина в крови. Штамм используют для получения ферментированных молочных продуктов. Изобретения обеспечивают эффективное снижение содержания холестерина в крови. 3 н.п. ф-лы, 3 ил., 2 пр.

1. Штамм Lactobacillus delbrueckii подвид lactis, снижающий содержание холестерина в крови, депонированный 6 апреля 2007 года под номером I-3741 в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes).

2. Ферментированный молочный продукт, снижающий содержание холестерина в крови, содержащий бактерии штамма CNCM I-3741 по п.1 в среде, используемой для ферментации и выбранной из: молока, среды, основанной на молоке, растительного сока или смеси данных сред, и содержащий после ферментации по меньшей мере 1×10⁶ КОЕ указанного штамма.

3. Применение штамма CNCM I-3741 по п.1 для получения ферментированного молочного продукта, который вызывает снижение уровня холестерина в крови, в частности уровня холестерина ЛНП.