ПРОДУКТЫ И СПОСОБ ОБЕЗЗАРАЖИВАНИЯ ПРИОНОВ Российский патент 2015 года по МПК A61L2/16 C11D3/00 

Объектом настоящего изобретения являются продукты и способы для обеззараживания продуктов и материалов, инфицированных нестандартными трансмиссивными возбудителями (ATNC), ответственными за трансмиссивную губчатую подострую энцефалопатию.

Изобретение касается, в особенности, обеззараживания продуктов и материалов, инфицированных прионами, которые накапливаются главным образом в мозге хозяина, в частности, в виде аномальных изоформ PrP^SC (PrP^скрепи), являющихся результатом конформационного изменения белка PrP^C (клеточного PrP), кодируемого хозяином.

Появление нового варианта болезни Крейтцфельда-Якоба в Великобритании и возможная ее связь с губчатой энцефалопатией крупного рогатого скота выдвинуло на передний план возможную заразность болезни, в особенности, через инфицированные продукты животного происхождения, в частности, через пищу и зараженные медико-хирургические материалы.

Действительно, современные методы дезинфекции и санации не позволяют легко разрушать прионы, которые устойчивы к большей части обычно используемых способов. Административными Директивами предписаны правила, которые необходимо соблюдать в данном вопросе, но они очень трудноосуществимы, являются дорогостоящими и требуют использования токсичных продуктов.

В свете этого контекста авторы провели поиск соединений, которые позволили бы просто и эффективно производить обезвреживание патогенного возбудителя и которые могли бы быть использованы на подавляющем большинстве медико-хирургических поверхностей и материалов. Их работы показали эффективность в этом отношении некоторых металлических производных.

Изобретение имеет целью, таким образом, применение таких соединений для обеззараживания прионов. Оно касается также способа обработки зараженных материалов и продуктов, включающего использование этих соединений.

Изобретение касается, таким образом, применения Cu и ее производных для обезвреживания прионов.

Согласно дополнительному положению изобретения, эти производные используют совместно с H₂O₂.

Предпочтительно металлическим производным является CuSO₄. Одно или несколько соединений, используемых согласно изобретению, находятся преимущественно в виде водных растворов.

Изучение действия этих производных на обезвреживание патогенных возбудителей, ответственных за прионные заболевания, показало их высокую эффективность для очистки зараженных продуктов или материалов.

Предпочтительно эти соединения, кроме того, являются нетоксичными, биоразлагаемыми, легкими в использовании.

Изобретение касается, таким образом, также способа обеззараживания продуктов или материалов, инфицированных патогенными возбудителями, ответственными за прионные заболевания, отличающегося тем, что он включает приведение их в контакт с по меньшей мере одним соединением, определенным выше, или содержащим его раствором, или в случае необходимости с H₂O₂.

В предпочтительном способе осуществления изобретения производным металла является CuSO₄.

Обеззараживающую обработку осуществляют преимущественно с использованием раствора, содержащего указанное соединение из расчета по крайней мере 500 мкмоль, в частности от 500 до 1000 мкмоль.

H₂O₂, когда она используется, присутствует в растворе из расчета приблизительно 50 ммоль.

Удовлетворительные результаты получены воздействием при температуре окружающей среды в течение порядка 15-60 мин, в частности в течение приблизительно 30 мин.

Это или эти соединения и их растворы представляют, таким образом, большой интерес в рамках госпитального применения, где они позволяют, в частности, производить обеззараживание медицинских или медико-хирургических устройств группы риска, таких как материалы многократного использования, например эндоскопы, зонды (диализ), а также обеззараживание рабочих поверхностей типа лабораторного стола или пола, тоже находящихся в зонах риска.

Указанные соединения или их растворы также особенно полезны для обеззараживания, например, инфекционного материала мозгового происхождения и биологических продуктов, происходящих от носителей инфекционных форм болезни Крейтцфельда-Якоба. Изобретение касается также применения указанных соединений и их растворов для очистки продуктов кровяного происхождения или биологического материала, используемого при пересадках.

Предпочтительно эти соединения и растворы доказали свою эффективность на штамме приона, связанного с ESB (губчатая трансмиссивная энцефалопатия крупного рогатого скота или коровье бешенство). Они применимы, таким образом, к любому типу приона каким бы ни был его штамм и происхождение возбудителя.

Они также могут успешно использоваться в рамках продовольственного применения, в частности, для обезвреживания любого потенциально инфекционного соединения и, в особенности, животной муки или других продуктов, происходящих от зараженных животных.

Заслуживающие интереса применения включают также обеззараживание таких помещений, как бойни, поверхностей и аппаратов, рискующих оказаться в контакте с возбудителями инфекции. Можно назвать, например, особенно тех, которые происходят от жвачных животных.

Другие характеристики и преимущества изобретения даны в нижеследующих примерах, в которых дается ссылка на фиг. 1 и 2, которые представляют, соответственно.

Пример 1. Раствор для обеззараживания приона, содержащий CuSO₄ и H₂O₂

a) Изучение воздействия меди совместно с H₂O₂ на разрушение PrP^SC, присутствующего в гомогенатах инфицированного мозга мыши.

Растворы CuSO₄ и H₂O₂ в различных концентрациях были добавлены в образцы, состоящие из инфицированных вытяжек гомогената мозга крыс, и оставлены в контакте приблизительно на 30 мин при температуре окружающей среды. Затем образцы были помещены на гель полиакриламида SDS-PAGE после выравнивания концентраций протеинов и разложения с протеиназой K (PK) в концентрации 1 мг PK для 50 мг протеина. Присутствие PrP^SC обнаружено с помощью вестерн-блоттинга.

Полученные результаты проиллюстрированы на фиг. 1. Видно, что при концентрации 100 мкмоль CuSO₄ и 50 ммоль H₂O₂ инфицированные образцы имеют сниженное содержание PrP^SC. При концентрации 500 мкмоль CuSO₄ и 50 ммоль H₂O₂ содержание PrP^SC, присутствующего в инфицированных гомогенатах, оказывается не поддающимся обнаружению с помощью вестерн-блоттинга (дорожки 7 и 8). При этой концентрации эффект усиливается действием H₂O₂.

При использовании более высоких доз CuSO₄ от 1 ммоль до 10 ммоль одна только медь позволяет устранить сигнал PrP^SC и добавок H₂O₂ больше не требуется.

Эти результаты были подтверждены при повторении этих испытаний на гомогенатах, происходящих из мозга мышей, зараженных штаммом приона 22L. Сходные результаты были получены на гомогенатах, происходящих из мышиного штамма Чандлер и ESB, что свидетельствует о том, что обеззараживающий эффект не является зависящим от штамма.

б) Изучение инфективности гомогенатов инфекционных мозгов, обработанных растворами с высокой концентрацией меди в in vitro.

Гомогенаты мозгов 22L были обработаны в течение приблизительно 30 мин имеющими разную концентрацию растворами CuSO₄, ассоциированной или нет с H₂O₂ в различных концентрациях. Эти инфекционные гомогенаты подвергали диализу, затем помещали на клетки мышиных нейробластов, имеющих способность давать отпор возбудителю инфекции.

Гомогенаты необработанного мозга были использованы как контроль.

Вестерн-блоттинг осуществлялся после 6 пассажей на клеточных лизатах и после разложения с PK для того, чтобы обнаружить присутствие PrP^SC, означающее, что тестированные образцы остаются еще инфекционными.

Полученные результаты приведены на фиг. 2. Можно констатировать, что инфицирование сокращено в результате обработки.

Пример 2. Тесты in vivo

Было получено подтверждение результатов, наблюдаемых in vitro. Гомогенаты мозга, инфицированные 22L, были обработаны, в частности, раствором 500 мкмоль CuSO₄ и 100 ммоль H₂O₂. Гомогенаты, обработанные или нет, были привиты мышам интрацеребральным путем. Контрольные животные, зараженные необработанными гомогенатами, все заболели за 168 дней +/-2 дня. Некоторые животные, зараженные обработанными гомогенатами, были живы даже после более 300 дней. Этот результат доказывает, что сокращение титра инфекции по крайней мере на 7 порядков может быть получено этим методом обеззараживания.

Пример 3. Обезвреживание хирургических материалов

Такие материалы, например, как эндоскопы, погружались в раствор, содержащий l мг CuSO₄ на 20 мин. Тесты, осуществленные, чтобы идентифицировать присутствие приона после такой обработки, оказались отрицательными.

Пример 4. Изучение эффективности обеззараживания

Далее приводятся данные, касающиеся эффективности обеззараживания, проверенные in vivo после прививки мышам. Для этого контрольные и обеззараженные гомогенаты мозгов были привиты интрацеребральным способом мышам (C57B1).

Время выживания мышей имеет следующие значения:

1) Прививка контрольных инфекционных гомогенатов: 167,6 +/-0,5 дней.

2) Гомогенаты, обработанные в CuSO₄ (0,5 ммоль, 30 мин, окружающая температура): 200,2 +/-8,9 дней.

3) Гомогенаты, обработанные в CuSO₄ (1 ммоль, 30 мин, окружающая температура): 217,2 +/-13,4 дней.

4) Гомогенаты, обработанные в CuSO₄ (1 ммоль) + H₂O₂ (100 ммоль, 30 мин, окружающая температура): 266,4 +/-15,6 дней.

Принимая во внимание такие сроки инкубационных периодов в этих различных условиях и кривую титрования возбудителя инфекции, полученные на этих мышах, можно сделать оценку, что достигнутое обеззараживание превосходит 10⁴ в гомогенатах, обработанных только CuSO₄, и выше 10⁵ в гомогенатах, обработанных в CuSO₄ + H₂O₂.

Группа изобретений касается способа обеззараживания продуктов или материалов, инфицированных прионами, и предназначено для обеззараживания медицинских или медико-хирургических устройств группы риска, дезинфекции рабочих поверхностей, обеззараживания животной муки или других зараженных продуктов животного происхождения. Стадия обеззараживания продуктов или материалов, инфицированных патогенными возбудителями, ответственными за прионные заболевания, состоит в их введении в контакт с раствором, содержащим медь (Cu) и/или ее производные. Причем указанная медь и/или ее производные присутствуют в количестве по меньшей мере 500 мкМ. Использование группы изобретений позволяет повысить эффективность обеззараживания зараженных продуктов или материалов. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 4 пр.

1. Способ обеззараживания продуктов или материалов, инфицированных патогенными возбудителями, ответственными за прионные заболевания, отличающийся тем, что стадия обеззараживания состоит в их введении в контакт с:
- раствором, содержащим медь (Cu) и/или ее производные, причем указанная медь и/или ее производные присутствуют в количестве по меньшей мере 500 мкМ.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что Cu и/или ее производные присутствуют в количестве от 500 до 1000 мкМ.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что Cu и/или ее производные используют совместно с H₂O₂.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что H₂O₂ присутствует в количестве приблизительно 50 мМ.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что производным меди является CuSO₄.

6. Применение способа по одному из пп.1-5 для обеззараживания медицинских или медико-хирургических устройств группы риска, таких как материалы многократного использования, таких как эндоскопы, или для обеззараживания рабочих поверхностей типа лабораторного стола или пола.

7. Применение способа по одному из пп.1-5 для обеззараживания животной муки или других зараженных продуктов животного происхождения.