СПОСОБ УДАЛЕНИЯ ЭТИОЛОГИЧЕСКОГО ФАКТОРА (ФАКТОРОВ) ТРАНСМИССИВНЫХ ГУБЧАТЫХ ЭНЦЕФАЛОПАТИЙ ИЗ БЕЛКОВЫХ РАСТВОРОВ Российский патент 2003 года по МПК C07K1/14 C07K14/47 B01D15/00 

Изобретение относится к способу удаления этиологического (причинного) фактора (факторов) трансмиссивных (передаваемых) губчатых энцефалопатий (TSE) из белковых растворов, в частности, из продуктов крови, которые будут использоваться для терапевтических и других медицинских целей. Белковый раствор приводят в контакт с адсорбентом, с которым будет связываться этот фактор (факторы).

В годы Второй мировой войны в США был разработан способ выделения белков из плазмы крови человека. Эти выделенные белки используются в медицине в качестве терапевтических агентов. Примерами продуктов данного способа являются альбумин, иммуноглобулины, фибриноген, факторы коагуляции и многочисленные другие белки. Альбумин используют, например, для пациентов с ожогами или, в более общем смысле, при заболеваниях, при которых должен быть увеличен объем крови. Иммуноглобулины могут быть использованы в случае пациентов, которые не способны сами синтезировать защитные антитела. Концентраты факторов коагуляции (в частности, фактора VIII и фактора IX) используются для пациентов с гемофилией. Во многих случаях эти препараты являются необходимыми для спасения жизни пациентов, и, следовательно, они не имеют замены.

Способы разделения плазмы крови на индивидуальные белки основаны на нескольких различных принципах. Более старые способы, которые все еще используются в широком масштабе, основаны на фракционном осаждении этих белков этанолом и последующем разделении фаз центрифугированием или фильтрованием. В более новых схемах фракционирования используются также другие способы разделения, например, ионообменная хроматография или (иммунно)аффинная хроматография. Интегрированная схема разделения обычно включает в себя несколько различных способов, которые объединены в оптимизированном процессе.

В первые годы использования белков плазмы для человека стало ясно, что продукты, приготовленные из крови человека, также имеют недостатки: они могут передавать некоторые инфекционные заболевания, вызываемые вирусами. Наиболее важным вирусом вначале был вирус гепатита (гепатита В). Позднее стали известны другие формы гепатита (не-А, не-В гепатит, который был недавно идентифицирован и назван гепатитом С). Наиболее хорошо известным вирусом, который передается кровью и продуктами крови, является ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), этиологический (причинный) фактор СПИДа (синдрома приобретенного иммунодефицита). Кроме вышеупомянутых, имеются некоторые другие вирусы, которые могут также передаваться плазмой и производными плазмы.

В недавние годы стали известны другие передаваемые (трансмиссивные) болезни с некоторыми общими признаками. Их называют TSE и считают, что они передаются необычными трансмиссивными агентами (NCTA). Болезни человека: болезнь Крейтцфельдта-Якоба (CJD), болезнь Герстманна-Штройсслера-Шайнкера (GSS), летальная семейная инсомния (бессонница) и куру, - все принадлежат к этой группе, как и некоторые болезни животных, наиболее хорошо известными из которых являются скрепи (почесуха) у овец и коровья губчатая энцефалопатия (BSE; "болезнь бешеных коров") у крупного рогатого скота. Зараженные люди и животные обнаруживают симптомы нейродегенерации, и эти болезни являются неизменно летальными. CJD, наиболее хорошо известная болезнь в этой группе, наиболее часто развивается спорадически; однако в ряде случаев в некоторых семьях наблюдался кластерный эффект, т.е. заметно повышенная заболеваемость. Были описаны случаи ятрогенной передачи через экстракты гипофиза, загрязненные инструменты, используемые в нейрохирургических процедурах, и трансплантацию роговицы или твердой мозговой оболочки. Передача любого из заболеваний человека посредством переливания крови никогда не была показана. Ретроспективное эпидемиологическое исследование среди реципиентов, перенесших гемотрансфузию, не показало увеличенной частоты CJD при сравнении с нетрансфузированными контролями [T.F.G. Esmonde, R.G. Will, J.M. Slattery et al.: Creutzfeldt-Jacob disease and blood transfusion. Lancet 1993, 341:205-207]. Ретроспективное исследование среди реципиентов концентратов эритроцитов, предоставленных человеком, который позднее умер от подтвержденной CJD, не обнаружило ни одного случая аномальных нейрологических или психиатрических явлений [N. Heye, S. Hensen, N. Muller: Creutzfeldt-Jacob disease and blood transfusion. Lancet 1994, 343:298-299]. Передача TSE посредством переливания крови должна быть, следовательно, либо крайне редкой, либо крайне неэффективной или как крайне редкой, так и крайне неэффективной. Тем не менее органам государственной власти и регулирующим учреждениям известна потенциальная проблема и необходима полная уверенность в том, что предпринимается все возможное для защиты пациентов от возможного контакта с NCTA.

Существование инфекционного агента доказано без тени сомнения. Однако точная природа этого агента все еще дебатируется. В прошлом большинство исследователей считали, что это заболевание вызывается "медленным" вирусом; более популярная гипотеза настоящего времени заключается в том, что этот инфекционный агент является белковой частицей, которая может содержать или может не содержать нуклеиновую кислоту, так называемым "прионом". Прионы встречаются по меньшей мере в двух различных формах, одна из которых в норме обнаруживается в клетках, называемая РrР^c, и другая форма, которая встречается только у индивидуумов, пораженных этим заболеванием, называемая РrР^sc или РrР^res из-за ее ассоциации со скрепи или из-за ее резистентности к деградации под действием протеаз, особенно под действием протеазы К. Различие между РrР^c и РrР^res обнаруживается по изменениям в упаковке, или третичной структуре, этого белка, причем преимущественно α-спиральная конформация почти полностью заменяется β-складчатой структурой. Форма РrР^res связана с TSE или может быть причиной TSE. Участие других факторов (кофакторов, т.е. нуклеиновых кислот, других белков) также обсуждается.

Безопасность крови или производных крови может быть увеличена при помощи 5 мер, предпринимаемых на различных уровнях: (1) собирающие кровь организации стараются исключить доноров, о которых известно, что они создают высокий риск передачи инфекционных заболеваний. Это делается при помощи анкеты, которая позволяет исключить людей с повышенными факторами риска. Лицами с повышенными факторами риска являются, например, люди, страдающие определенными заболеваниями, люди, которые посещали определенные страны незадолго до сдачи крови, люди, которые подвергаются опасности вследствие их половой активности, или люди, привыкшие к чрезмерному употреблению лекарственных средств, которые используют загрязненные иглы, реципиенты трансплантатов роговицы или твердой мозговой оболочки, люди, которые лечились гормонами гипофиза или у которых в их семье встречались случаи CJD. (2) Лабораторные анализы позволяют определить инфекционную донорскую кровь, которая может быть затем удалена из последующей обработки. Эти две меры, взятые вместе, приводят к удалению наиболее инфекционных образцов донорской крови, но не всех: (а) чувствительность тест-способов может быть недостаточной; (b) тест на определенный инфекционный агент может быть еще недоступным; из-за практических и экономических причин невозможно подвергнуть скринингу все потенциальные инфекционные агенты; (с) тест позволяет определить не сам инфекционный агент, а скорее антитела, которые индуцируются у инфицированного индивидуума в качестве ответа на инфекцию. Со времени возникновения инфекции до появления детектируемых антител обычно проходит несколько дней или недель (так называемое "окно"). Тесты на антитела в этот период бесполезны; (d) инфицированная донорская кровь может быть пропущена из-за канцелярской ошибки. (3) Безопасность в отношении передачи инфекционных агентов дополнительно улучшается введением в технологический процесс специальных стадий, которые либо инактивируют, либо устраняют инфекционные агенты. (4) Строгое соблюдение хорошей практики производства (GMP) гарантирует эффективность стадий, упомянутых в пункте (3). (5) Полная прослеживаемость каждой взятой донорской крови до соответствующих продуктов и от конечных продуктов к индивидуально взятой донорской крови делает возможными направленное аннулирование продуктов в случае, если это становится необходимым.

Способы обнаружения, инактивации и элиминации инфекционных вирусов в продуктах крови и плазмы являются в настоящее время широко признанными. Коммерческие системы регистрации используются во всем мире для обнаружения, например, антител к вирусу иммунодефицита человека или к вирусу гепатита С. Инактивация вирусов может достигаться различными тепловыми обработками (либо в растворе, либо в сухом состоянии; при различных температурах и в течение различных периодов времени), химическими (с комбинацией растворителей и детергентов или с иодом) или фотохимическими обработками (например, экспонированием с β-пропиолактоном и ультрафиолетовым светом; освещением белкового раствора, к которому был добавлен подходящий краситель) или любым из многих других хорошо известных способов. Новые способы все еще разрабатываются. Передача известных вирусов фармацевтическими продуктами, полученными из плазмы человека, в наши дни может быть исключена почти с полной определенностью, передача неизвестных вирусов является по меньшей мере очень маловероятной.

К сожалению, ситуация является более затруднительной в случае NCTA (необычных трансмиссивных агентов). Донорам крови обычно задают вопросы, направленные на исключение тех доноров, которые имели повышенный риск поражения болезнью CJD ранее в их жизни (страдали ли члены семьи когда-нибудь от CJD или подобных заболеваний? Лечился ли донор когда-нибудь гормонами гипофиза или подвергался ли донор трансплантации роговицы или твердой мозговой оболочки? ). Нет сомнений, что эта линия анкетирования может исключить некоторые из потенциальных ятрогенных и семейных случаев, но не будет влиять на потенциальные спорадические случаи. Таким образом, элиминация доноров высокого риска путем анкетирования является в самом лучшем случае случайной, и можно предсказать, что многие случаи будут ускользать от обнаружения. Скрининг всех образцов сданной крови еще не является возможным. Хотя были разработаны антитела, которые узнают РrР, большинство из них не отличают РrР^c от РrР^res; таким образом, этот тест должен был бы включать в себя расщепление протеазой, которое делает его слишком громоздким для рутинного применения. Что еще хуже, вообще нет полной уверенности в том, должен ли РrР^res обнаруживаться в крови или в плазме; лучшим источником для тканевого образца была бы биопсия мозга, которая явно невозможна для доноров крови. Могла бы быть возможной разработка теста на основе недавно описанного моноклонального антитела, которое реагирует специфически с РrР^res [Korth et al.: Prion (PrP^sc)-specific epitope defined by monoclonal antibody. Nature 1997, 390: 74-77]; однако это еще не было сделано.

К сожалению, этиологический фактор (факторы) TSE является необычно стабильным к инактивации. Способы, упомянутые выше для инактивации вирусов, не уменьшают инфекционности NCTA. Фактически, они выносят даже автоклавирование (обработку паром при 121^oС в течение 15 минут) и захоронение в почве в течение нескольких лет. Известно мало условий для надежной инактивации NCTA: автоклавирование при повышенной температуре (≥134^oС в течение по меньшей мере 18 минут; обработка раствором гидроксида натрия (1 моль/л), предпочтительно при повышенных температурах; сильно окисляющие условия (гипохлорит натрия); сильные хаотропные условия (изотиоцианат гуанидиния). При использовании таких условий на растворе белков плазмы человека эти белки инактивировались бы сами по меньшей мере так быстро, как NCTA. Единственной альтернативой является, по-видимому, физическое удаление NCTA. Поскольку мономеры инфекционного соединения (соединений) могут быть одинакового размера с белками плазмы человека, они не могут быть удалены, например, (нано)фильтрацией или центрифугированием. Действительно, было показано, что нанофильтрация была способна удалять NCTA, но что это удаление зависело от присутствия или отсутствия определенных растворенных веществ; например, инфекционные агенты проходили через этот фильтр в присутствии поверхностно-активных веществ.

Таким образом, компании, которые технологически обрабатывают кровь или плазму крови, имеют потребность в промышленно применимых способах, которые делают возможным надежное удаление NCTA из белковых растворов. Для минимизации теоретического риска инфекции пациентов, подвергающихся лечению такими продуктами, целью данного изобретения является описание способа, который позволяет выделить NCTA из белковых растворов в промышленном масштабе; этот способ может быть частью современной схемы фракционирования плазмы.

Таким образом, целью данного изобретения является обеспечение способа надежного удаления причинных агентов TSE из растворов белка, чувствительного к загрязнению агентами TSE.

Было обнаружено, что TSE, которые могут присутствовать в белковых растворах, адсорбируются на определенных материалах, например, модифицированной целлюлозе, диатомовой земле, бентонитах, вулканической земле, частицах искусственных полимеров и т.д. Если белковые растворы приводят в контакт с этими материалами и выдерживают в течение достаточно продолжительного времени, то разделение раствора на осадок и супернатант приводит, следовательно, к дополнительному удалению агентов TSE, в дополнение к удалению, производимому стадией как таковой. Материалы, упомянутые выше, вводили ранее при фракционировании плазмы в виде так называемых ускорителей фильтрования для облегчения разделения осадка и супернатанта во время этанольного фракционирования. Ускорители фильтрования образуют слой на верхней части пористых фильтрующих мембран, и они промотируют фильтрование, поскольку являются проницаемыми для жидкости, но не для твердых частиц. Ускорители фильтрования предотвращают забивание пор фильтра небольшими белковыми частицами.

Удаление различных вирусов из белкового раствора подобным способом было описано в более раннем патенте (ЕР 0679405 A1). Ввиду того факта, что природа агентов TSE, как упоминалось выше, все еще дебатируется, совсем не очевидно, что они должны вести себя подобно вирусам.

В соответствии с данным изобретением, агенты TSE удаляют из белкового раствора путем адсорбции на твердой фазе, причем эта твердая фаза либо суспендирована в растворе для адсорбции агентов TSE, либо уже была образована предварительно на пористом фильтре. Белковый раствор должен быть приведен в контакт по меньшей мере один раз с адсорбентом, выбранным из группы, состоящей из кизельгура, диатомовой земли, кремниевой кислоты, глинистых минералов, гидроксида или оксигидрата металла, целлюлозы, перлита и нерастворимых в воде синтетических полимеров, или смеси или комбинации этих материалов; время контакта равно по меньшей мере 10 минут. Затем эту суспензию разделяют на супернатант и осадок фильтрованием или любым иным подходящим способом.

Твердыми фазами для этого способа являются, например, ускорители фильтрования Celite^тм (John-Manville Corp.), Aerosil^тм (Degussa), перлит, вспученный нагреванием перлит, бентонит или в общем мелко распределенные твердые вещества, которые могут быть удалены фильтрованием или центрифугированием из суспензии. Пригодны также вещества, подобные гелям гидроксидов металлов (например, Alhydrogel Аl(ОН)₃ в виде геля в воде).

Адсорбция агентов TSE на вышеупомянутых минералах зависит от используемого материала, агента TSE и окружающей среды. Путем систематического изменения окружающей среды "прилипаемость" конкретного агента TSE на одном и том же материале может быть изменена. Может быть возможной модификация адсорбции агента TSE на конкретном материале, например, путем изменения величины рН среды. Другие параметры раствора, такие как температура, ионная сила, соли и органические растворители, также могут влиять на адсорбцию агентов TSE и могут быть использованы для улучшения адсорбции и, следовательно, удаления агентов TSE из белкового раствора.

Даже кратковременная обработка белкового раствора в течение только 10 минут может приводить к существенному удалению агентов TSE. Однако может быть предпочтительной обработка в течение более длительного времени для улучшения удаления агентов TSE. Время обработки может быть приблизительно 15 минут, 30 минут, приблизительно 1 час, приблизительно 2 часа, приблизительно 6 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 14 часов, приблизительно 16 часов, приблизительно 20 часов.

Удаление адсорбента, включающего в себя адсорбированные агенты TSE, производят центрифугированием или фильтрованием. Центрифугирование может быть выполнено различными путями, например, с использованием периодической процедуры или непрерывного центрифугирования. Центробежная сила и время центрифугирования должны корректироваться таким образом, чтобы гарантировать чистое разделение суспендированного материала и супернатанта. В лабораторном масштабе фильтрование может проводиться с использованием воронки Бюхнера или подобного устройства. В большем масштабе (на производстве) предпочтительным является другое оборудование, например, фильтр-прессы или ротационные (барабанные) фильтры.

Экспериментальная часть
В силу очевидных причин невозможно проведение экспериментов с этиологическим фактором (факторами) CJD или подобных заболеваний человека на людях. Таким образом, для того, чтобы узнать что-то о поведении агентов TSE, необходимо обратиться к модельным системам. Одной из хорошо установленных модельных систем является модель скрепи хомяка. Ниже дается краткое описание этой модели: сначала готовят инокулят из мозга заболевшего животного; мозг удаляют осторожно и гомогенизируют обработкой ультразвуком с 9 объемами забуференного фосфатом солевого раствора. Этот препарат может передавать заболевание при инокуляции 50 мкл интракраниально в здоровых хомяков. В зависимости от активности инокулята заболевание будет развиваться в пределах нескольких недель или нескольких месяцев. Все животные должны наблюдаться в течение года или до их смерти, в зависимости от того, что наступит первым. Заболевание проявляется характерными изменениями поведения, например, повышенной реакцией на шум и атаксией. Путем разведения инокулята постадийно 1: 10 буфером и инокуляции этих разведений в животных можно определить титр инокулята; этот титр является обратной величиной последнего разведения, которое вызвало заболевание у половины животных, которые были инокулированы.

Инокулят, приготовленный, как описано выше, имеет титр 10¹². Преимущество этой модели заключается в том, что она не делает никаких предположений относительно природы инфекционного агента (агентов), поскольку этот тест основан на клиническом заболевании. Таким образом, инфекционный агент (агенты) могут быть одним белком или несколькими белками, с участием нуклеиновой кислоты (кислот) или без участия нуклеиновой кислоты (кислот), медленным вирусом или любой другой нозологической формой, он всегда является инфекционным агентом (агентами), которые измеряются. Таким образом, эта система может быть использована для оценки либо физического удаления, либо инактивации этиологического фактора (факторов) TSE. Эксперименты проводят аналогично экспериментам со свободной от субъективных факторов выборкой с вирусами, которые были подробно описаны в литературе в течение последних приблизительно десяти лет: небольшое количество инфекционного материала (так называемого "спайка") добавляют на конкретной стадии процесса очистки оцениваемого продукта, и его активность измеряют. Затем выполняют следующую стадию процесса очистки (например, осаждение, с последующим разделением осадка и супернатанта; термическую инактивацию) и оставшуюся активность титруют, в обеих фазах в случае физического разделения или как функцию времени в случае инактивации. Из этих измерений могут быть рассчитаны коэффициенты инактивации, при условии, что сбалансированные табличные подсчеты или кинетика были прослежены правильно. В случае NCTA титрование является чрезвычайно трудоемким, поскольку каждая точка титрования требует применения нескольких животных; следовательно, протоколы должны исправляться соответственно. Результат этих экспериментов становится известным только после нескольких месяцев, когда инфицированные животные либо будут поражены заболеванием, либо останутся здоровыми.

Примеры
Гомогенат мозга, используемый во всех последующих экспериментах, тщательно титровали инъекцией разведений в мозг хомяков. После 187 дней наблюдения распределение больных и здоровых животных в различных группах было следующим (см. таблицу).

Из этих данных может быть рассчитан титр приблизительно 10⁹ для данного гомогената. Подобные таблицы были получены для каждого из анализируемых растворов. Из этих данных были рассчитаны коэффициенты клиренса; они указаны в каждом примере.

Пример 1 (для этого и последующих примеров можно сослаться также на чертеж, показывающий диаграмму способа фракционирования плазмы по Kistler/Nitschmann).

58 мл плазмы крови человека перемешивали и охлаждали до 1^oС. Добавляли 0,58 мл гомогената мозга. Добавляли этанол до конечной концентрации 19% с сопутствующим охлаждением плазмы до -5,5^oС. После доведения рН до 5/8 добавляли перлит, и суспензию центрифугировали. Инфекционность в супернатанте уменьшалась в ≈10⁵ раз.

Пример 2
40 мл фильтрата перемешивали при 5,5^oС. Добавляли 0,4 мл гомогената мозга с последующим добавлением этанола до конечной концентрации 40%. Температуру понижали до -7^oС и рН доводили до 5,95. Добавляли смесь перлита и Celite^тм. Суспензию центрифугировали. Инфекционность в супернатанте уменьшалась в -10⁵ раз.

Пример 3
52 мл осадка А перемешивали при 1^oС. Добавляли 0,52 мл гомогената мозга. Добавляли буфер, и рН доводили до 5,1. Добавляли воду, затем этанол до конечной концентрации 25%. Температуру снижали одновременно до -3^oС. Добавляли перлит, и суспензию центрифугировали. Инфекционность в супернатанте уменьшалась в ≈10⁶ раз.

Пример 4
33 мл ресуспендированного осадка GG (который содержит ускоритель фильтрования из предыдущей стадии) охлаждали до 4^oС. Добавляли 0,33 мл гомогената мозга. Суспензию центрифугировали. Инфекционность в супернатанте уменьшалась в ≈10⁷ раз.

Пример 5
50 мл раствора иммуноглобулина G перемешивали при 4^oС. Добавляли 0,5 мл гомогената мозга с последующим добавлением ускорителя фильтрования (Celite^тм 577). Суспензию центрифугировали. Инфекционность в супернатанте уменьшалась в ≈10⁶ раз.

Пример 6
33 мл ресуспендированного осадка GG охлаждали до 4^oС, и вносили "спайк", как описано в примере 4. Суспензию центрифугировали и супернатант дополнительно обрабатывали, как в примере 5 (добавление ускорителя фильтрования с последующим центрифугированием; объемы корректировали соответственно), но без дополнительного "спайка" в виде гомогената мозга. После более 200 дней наблюдения ни одно из животных, инъецированных вторым супернатантом, не обнаруживало каких-либо признаков заболевания. Это свидетельствует о том, что двукратное фильтрование последовательно в присутствии подходящих ускорителей фильтрования удаляет существенно большее количество инфекционного агента (агентов), чем удалило бы любое отдельное фильтрование.

Суспендируют в растворе по меньшей мере один адсорбент в течение по меньшей мере 10 мин. Адсорбент выбирают из кизельгура, диатомовой земли, кремниевой кислоты, глинистых минералов, гидроксида металла, оксигидрата металла, целлюлозы, перлита, бентонита и не растворимых в воде синтетических полимеров. Полученную суспензию перемешивают и затем адсорбент отделяют от белкового раствора. Способ позволяет снизить показатели инфекционности раствора в 10⁵-10⁷ раз. 14 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

1. Способ удаления причинных агентов трансмиссивных губчатых энцефалопатий, включающий в себя суспендирование по меньшей мере одного адсорбента, выбранного из группы, состоящей из кизельгура, диатомовой земли, кремниевой кислоты, глинистых минералов, гидроксида металла, оксигидрата металла, целлюлозы, перлита, бентонита и не растворимых в воде синтетических полимеров, в растворе белка, содержащем причинные агенты, в течение по меньшей мере 10 мин, в течение которого полученную суспензию перемешивают и затем адсорбент удаляют из белкового раствора. 2. Способ по п. 1, где адсорбент отделяют от раствора белка, содержащего причинные агенты, путем центрифугирования или фильтрования. 3. Способ по п. 1 или 2, где раствор белка, содержащий причинные агенты, представляет собой препарат на основе плазмы крови человека. 4. Способ по пп. 1-3, где адсорбент является нерастворимым гидроксидом металла или оксигидратом металла. 5. Способ по п. 4, где адсорбент является гидроксидом магния или алюминия. 6. Способ по любому из пп. 1-4, где адсорбент содержит гель гидроксида алюминия или целлюлозу. 7. Способ по п. 1, где адсорбент представляет собой диатомовую землю, перлит, вспученный нагреванием перлит, бентонит или тальк. 8. Способ по п. 1, где адсорбент присутствует в форме геля. 9. Способ по любому из пп. 1-8, где раствор белка, содержащий причинные агенты, приводят в контакт, по меньшей мере дважды, со свежей порцией адсорбента. 10. Способ по п. 9, где раствор трижды приводят в контакт со свежей порцией адсорбента. 11. Способ по любому из пп. 1-10, где значение рН суспензии заключено в диапазоне от 4 до 7. 12. Способ по любому из пп. 1-11, где один или более параметров раствора изменяются по меньшей мере один раз во время периода контакта этого раствора с адсорбентом. 13. Способ по п. 12, где параметрами раствора являются температура, концентрация одного или нескольких растворенных веществ и ионная сила. 14. Способ по любому из пп. 1-13, где время контакта раствора с адсорбентом заключено в диапазоне между 10 мин и 48 ч, например, между 30 мин и 12 ч или между 3 ч и 48 ч. 15. Способ по любому из пп. 1-13, где температура белкового раствора составляет 0-20^oС и предпочтительно составляет примерно 2^oС.