ПРИМЕНЕНИЕ СИНТЕТИЧЕСКОГО АНАЛОГА ПРИРОДНОГО АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА ИНДОЛИЦИДИН ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ КОЖИ Российский патент 2015 года по МПК C07K7/08 A61K38/04 A61P17/00 

Область применения: изобретение относится к медицине, в частности к комбустиологии, может быть использовано для стимуляции регенерации кожи после ожоговой травмы у лабораторных животных, больных.

В литературе последних лет описаны такие свойства антимикробных пептидов (АМП), как реализация защитных и приспособительных реакций при инфицировании, стрессорном воздействии (Korneva Е.А., Rybakina E.G., Kokryakov V.N., Orlov D.S., Shamova O.V., Shanin S.N. Interleukin-1 and defensins in thermoregulation, stress and immunity // Annals of NY Acad. Sci. - 1997. - Vol.812. - P.465-474; Aberg K.M., Radek K.A., Choi E-H, Kim D-K., Demerjian M., Hupe M., Kerbleski J., Gallo R.L., Ganz Т., Mauro Т., Feingold K.R., Elias P.M. Psychological stress downregulates epidermal antimicrobial peptide expression and increases severity of cutaneous infections in mice // J Clin Invest. - 2007. - Vol.117, №11. - P.3339-3349), паразитарной инвазии (McGwire В.S., Kulkarni M.M. Interactions of antimicrobial peptides with Leishmania and trypanosomes and their functional role in host parasitism // Exp Parasitol. - 2010. - Vol.126, №3. - P.397-405), опухолевом росте (Jin G., Kawsar H.I., Hirsch S.A., Zeng C., Jia X., Feng Z., Ghosh S.K., Zheng Q.Y., Zhou A., McIntyre Т.M., Weinberg A. An Antimicrobial Peptide Regulates Tumor-Associated Macrophage Trafficking via the Chemokine Receptor CCR2, a Model for Tumorigenesis // PLoS One. - 2010. - Vol.5, №6. - P.10993). Антимикробные пептиды относят к группе биологически активных веществ, синтезируемых преимущественно нейтрофильными гранулоцитами и макрофагами, а также эпителиальными клетками барьерных органов. Отмечают дозозависимые эффекты их действия. На сегодняшний день наиболее изученной является их непосредственная антимикробная биологическая активность, отражающая наиболее значимую роль этих пептидов в защитных функциях организма (Korneva E.A., Kokryakov V.N. Defensins: antimicrobial peptides with a broad spectrum of biological activity. // Neuroimmune Biology. - 2003. - Vol.3. - P.451-462).

Антимикробные пептиды обладают селективностью действия по отношению к бактериям, выработка резистентности к АМП микроорганизмами затруднена в связи с особенностями механизма бактерицидного действия данных пептидов (Orlov D.S., Nguyen Т., Lehrer R.I. Potassium release, a useful tool for studying antimicrobial peptides // J. Microbiol Methods. - 2002. - Vol.49, №3. - P.325-328).

АМП не задерживаются и не накапливаются в организме, не угнетают функции иммунной системы, а обладают различными иммуномодулирующими эффектами, например свойством стимулировать активность естественных киллерных (ЕК) клеток (Chernysh S., Irina К., Irina A. Anti-tumor activity of immunomodulatory peptide alloferon-1 in mouse tumor transplantation model // Int Immunopharmacol. - 2012. - Vol.12, №1. - P.312-314).

Техническим результатом изобретения является применение синтетического аналога природного антимикробного пептида индолицидин, имеющего формулу H-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Lys-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH₂, для стимуляции репаративной регенерации кожи.

Синтетический аналог природного антимикробного пептида индолицидин вводят парентерально (внутрибрюшинно) в дозе 100 мкг на 1 кг массы тела в 0,2 мл физиологического раствора ежедневно в течение 5 дней с момента ожоговой травмы экспериментальным животным (крысам линии Wistar).

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Работа выполнена на 80 крысах-самцах линии Wistar массой 180-200 г. Животным под эфирным наркозом выполняли ожог кожи спины IIIa-IIIb степени площадью 18% поверхности тела [Лазаренко В.А., Моновцов И.А., Квачахия Л.Л. Регенерация кожи и костной ткани у мышей с экспериментальными травмами при иммунокоррекции риботаном // Курский научно-практич. вест. «Человек и его здоровье». - 2004. - №2-3. - С.50-55]. Исследуемые животные были разделены на две группы: контрольную и опытную по 40 особей в каждой. Крысам контрольной группы ежедневно в течение 5 суток после ожоговой травмы внутрибрюшинно вводили 0,2 мл физиологического раствора, а животным опытных групп - синтетический аналог природного антимикробного пептида индолицидин (ООО «НПФ Верта», г. Санкт-Петербург), в дозе 100 мкг/кг в аналогичном объеме физиологического раствора. Указанная доза выбрана на основе анализа данных литературы о высокой эффективности препарата в данном диапазоне доз [Смирнова М.П., Афонин В.Г., Шпень В.М., Тяготин Ю.В., Колодкин Н.И. Взаимосвязь структура-активность в ряду аналогов антибактериального пептида индолицидина. I. Синтез и биологическая активность аналогов с увеличением амфипатичностью и повышенным общим положительным зарядом молекулы// Биоорган, химия. - 2004. - Т.30, №5. - С.458-465].

Гистологическое изучение раневых биоптатов производили на 1-ые, 4-ые, 7-ые, 10-ые и 14-ые сутки от ожоговой травмы и начала лечения после выведении подопытного животного из эксперимента. Забор материала осуществляли путем иссечения участка экспериментальных ожоговых ран и прилежащих интактных тканей. Взятый материал сразу фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина с последующей проводкой по восходящим спиртам и заливкой в парафин по стандартной методике. Приготовленные парафиновые срезы окрашивали гематоксилин-эозином и по Маллори.

При оценке гистологических срезов обращали внимание на выраженность воспалительных реакций, сроки появления грануляционной ткани, возникновение краевой эпителизации, а также структурную полноценность вновь образованного эпителия.

При морфометрическом исследовании использовали окулярную стереометрическую сетку Автандилова, содержащую 100 тест-точек [Автандилов Г.Г. Основы количественной патологической анатомии: Учеб. пособие. - М.: Медицина, 2002. - 238 с; Автандилов Г.Г. Проблемы патогенеза и патологоанатомической диагностики болезней в аспектах морфометрии. - М.: Медицина, 1984. - 286 с.]. Проводили подсчет точек при увеличении ×400, совпадающих с изучаемыми гистологическими структурами на срезе ткани, и по 10-15 полям зрения микроскопа определяли долю некротизированной ткани, баллонной дистрофии, а также долю поверхностного новообразованного эпителия и подлежащей рыхлой соединительной ткани, объем распространения отека. Полученные результаты выражали в процентах (таблица 1).

Нами было выполнено также морфометрическое исследование, заключающееся в следующем: на срезах гистологических препаратов при увеличении ×400 на выбранном участке в пределах раневого дефекта под лейкоцитарно-фибринозным струпом производили подсчет фибробластов, гранулоцитов, лимфоцитов и макрофагов до 100 клеток, полученные результаты выражали в процентах (таблица 2).

Установлено, что во всех группах к концу первых суток после нанесения ожога поверхность ожоговой раны не была покрыта струпом, края раны отечны, поврежденная кожа бледная.

При микроскопии в контрольной группе отмечалось отсутствие лейкоцитарно-фибринозного струпа, гибель эпидермиса непосредственно в месте воздействия термического агента составляла 19,00±4,43% (табл.2), истончение эпидермиса, прилежащего к зоне деструкции за счет отсутствия в нем рогового и истончения шиповатого слоев; в блестящем слое отмечается формирование пузырей, заполненных коллоидом, не склонных к слиянию. Сосочковый слой не дифференцируется. Подлежащие ткани резко отечны (до 38,06±2,11%), выражена инфильтрация полиморфно-ядерными лейкоцитами (ПЯЛ), а также единичными макрофагами на разных стадиях дифференцировки. Пучки коллагеновых волокон сетчатого слоя дермы отечны и плотно прилежат друг к другу. Отек распространяется к гиподерме и за пределы зоны деструкции эпидермиса. В сетчатом слое дермы отмечаются признаки баллонной дистрофии (8,41±0,92%). Гиподерма также выражено инфильтрирована ПЯЛ. Дифференцируемые фибробласты имели базофильную цитоплазму и набухшие, разрыхленные ядра. Кровеносные и лимфатические сосуды расширены, отмечается стаз. Дифференцируются разрушенные волосяные фолликулы, протоки потовых желез не дифференцируются.

В гистологических препаратах животных контрольной группы в первые сутки эксперимента доля некротизированной ткани составляла 19,00±4,43%, отмечали максимальное распространение отека до 38,06±2,11%, баллонной дистрофии до 8,41±0,92%. Клеточный инфильтрат представлен в большинстве гранулоцитами 62,88±2,06%, доля фибробластов, лимфоцитов и макрофагов составили соответственно: 8,63±0,60%, 12,00±1,15%, 17,75±0,86%.

В опытной группе, получавшей аналог индолицидина в дозе 100 мкг/кг, на следующие сутки после нанесения ожоговой травмы отмечали отсутствие лейкоцитарно-фибринозного струпа. В месте воздействия термического агента эпидермис либо отсутствовал, либо был некротизирован (до 33,21±1,56%). В прилежащем эпидермисе интактной кожи обнаруживали пузыри, содержащие коллоид. В дерме не дифференцировался сосочковый слой. Коллагеновые волокна сетчатого слоя были отечны. Наиболее выраженный отек верхнего слоя дермы (до 33,21±1,56%) отмечали в местах отсутствия эпидермиса. По сравнению с контрольной группой отек был менее выражен (на 12,02%), что, по-видимому, способствовало интенсивной инфильтрации дермы нейтрофилами и макрофагами. В клеточном инфильтрате преобладали гранулоциты и макрофаги. Менее выражены признаки дистрофии дермы по сравнению с контрольной группой. Гиподерма также была интенсивно инфильтрирована. Отмечали расширение кровеносных и лимфатических сосудов и стаз в них.

На первые сутки после нанесения ожога в гистологических препаратах животных, получавших Инд 21 в дозе 100 мкг/кг, отмечается увеличение доли некротизированной ткани по сравнению с контрольной группой на 37,56%, менее выраженный отек дермы и баллонной дистрофии (на 12,02% и 46,36%). В клеточном составе инфильтрата преобладали гранулоциты, количество которых было меньше по сравнению с контрольной группой на 28,83%, уменьшалось также количество лимфоцитов (на 28,13%). Количество фибробластов и макрофагов по сравнению с показателями контрольной группы было выше на 49,28% и 90,85% соответственно.

На 4-е сутки после моделирования ожоговой раны у животных контрольной серии морфологическая картина регенерирующих тканей в зоне термической травмы выглядела следующим образом: отмечается начало формирование лейкоцитарно-фибринозного струпа над зоной деструкции. По сравнению с предыдущим сроком эксперимента отмечается уменьшение отека (33,21±1,56%), распространяющегося на всю толщу дермы и переходящего на гиподерму. Отмечается более выраженная инфильтрация ПЯЛ и макрофагами гиподермы и прилежащего к ней сетчатого слоя дермы. Инфильтрат и отек распространяются на интактную ткань. В дерме отмечается уменьшение признаков дистрофии по сравнению с предыдущим сроком наблюдения. Ближайший край интактной кожи под струпом, истончен, в некоторых срезах в толще интактного эпидермиса определяются пузыри. Отмечается стаз в сосудах. Признаки эпителизации отсутствуют или маловыражены.

На четвертые сутки у крыс контрольной группы по сравнению с предыдущим сроком наблюдения доля некротизированной ткани возрастала на 74,78%, отмечали снижение отека тканей и доли баллонной дистрофии на 12,75% и 32,97% соответственно. Доля новообразованного эпителия составила 3,81±0,84%, подлежащей рыхлой соединительной ткани - 1,66±0,57%. Доля нейтрофилов и лимфоцитов снизилась на 26,84% и 11,46% соответственно. Отмечено увеличение доли фибробластов (на 39,13%) и макрофагов (на 62,68%) по сравнению с предыдущим сроком наблюдения.

В опытной группе, получавшей аналог индолицидина в дозе 100 мкг/кг, на четвертые сутки эксперимента ожоговая рана в большинстве случаев покрыта оформленным фибринозно-лейкоцитарным струпом, который в некоторых срезах располагается на участках эпителизации. По сравнению с предыдущим сроком наблюдения отек уменьшается и имеет тенденцию к распространению к гиподерме. В сетчатом слое дермы полнокровные капилляры. Клеточная инфильтрация выражена значительно и представлена в большинстве фибробластами, нейтрофилами, а также макрофагами. Инфильтрат распространяется за пределы интактной дермы.

На четвертые сутки доля некротизированных тканей увеличивалась на 9,55% по сравнению с предыдущим сроком эксперимента. Снижались распространенность отека дермы (на 24,44%), баллонной дистрофии (на 91,28%). Отмечали появление новообразованного эпителия (7,47±1,11%), доля которого была достоверно выше, чем в контрольной группе (p<0,05), и рыхлой грануляционной ткани. Клеточный состав инфильтрата был наиболее выражен фибробластами, нейтрофильными гранулоцитами и макрофагами. По сравнению с предыдущим сроком наблюдения снижался уровень гранулоцитов (на 22,63%) и макрофагов (на 60,89%), тогда как количество фибробластов и лимфоцитов возрастало (на 226,21% и 17,39% соответственно).

В препаратах контрольной серии на седьмые сутки после ожоговой травмы четко визуализировался выраженный лейкоцитарно-фибринозный струп (24,30±5,26%), располагающийся на дерме, отторгающийся в некоторых местах. Дерма и гиподерма оставались отечны (29,73±3,37%) и инфильтрированы, но по сравнению с 4-ми сутками эксперимента менее выражено. В дерме обнаруживали признаки формирования демаркационного вала, образованного лейкоцитами. Отмечается начало краевой и островковой эпителизации под струпом.

На седьмые сутки после нанесения ожога отмечали уменьшение доли некротизированных тканей (на 26,82%) и снижение отека (на 10,47%). Увеличивалась доля новообразованного эпителия и рыхлой соединительной ткани на 8,49% и 18,50% соответственно. В клеточном составе инфильтрата преобладали гранулоциты и макрофаги, число которых снижалось на 37,50% и 3,03% по сравнению с предыдущим сроком наблюдения. Доля фибробластов и лимфоцитов увеличивалось на 83,33% и на 83,53% соответственно.

В опытной группе, получавшей аналог индолицидина в дозе 100 мкг/кг, на 7-ые сутки отмечали участки эпителизации (12,46±0,99%), отечность эластических волокон сетчатого слоя дермы (22,95±1,96%) и клеточную инфильтрацию. Регенерировавший эпидермис располагался на рыхлой грануляционной ткани (4,87±0,59%), содержащей большое количество фибробластов. Участки раны, лишенные эпидермиса, были покрыты фибрином или струпом. Дерма была инфильтрирована в большинстве фибробластами, гранулоцитами и макрофагами.

Через семь суток после нанесения ожога у животных, получавших Инд 21 в дозе 100 мкг/кг, отмечается увеличение доли новообразованного эпителия и подлежащей рыхлой соединительной ткани на 66,79% и 97,70% по сравнению с предыдущим сроком эксперимента, что было достоверно выше по сравнению с контрольной группой. Продолжали снижаться распространенность отека и некротизированной ткани на 9,30% и 87,33% соответственно. Проявлений баллонной дистрофии клеток не отмечено. В клеточном составе преобладали фибробласты, количество которых увеличилось на 6,85% по сравнению с 4-ми сутками наблюдения и оставалось достоверно выше, чем в контрольной группе (p<0,01). Увеличивалось также количество макрофагов (на 50,00%), тогда как количество нейтрофильных гранулоцитов и лимфоцитов снижалось на 13,72% и 28,40% соответственно.

Гистологическая картина ран животных контрольной группы на 10-е сутки: под выраженным лейкоцитарно-фибиринозным струпом продолжается формирование эпителия (краевое наползание и островковая эпителизация). Отмечается снижение отека дермы и гиподермы, сохраняется инфильтрация дермы. Количество фибробластов увеличивалось (на 6,25%), число гранулоцитов, напротив, снижалось (на 3,91%). Количество лимфоцитов и макрофагов снижалось до окончания эксперимента.

На десятые сутки эксперимента в опытной группе, получавшей аналог индолицидина в дозе 100 мкг/кг, доля эпителизированной поверхности ран и рыхлой соединительной ткани увеличивались на 7,21% и 81,40% по сравнению с предыдущим сроком наблюдения и были достоверно выше, чем в контрольной группе (p<0,01). Некротизированные ткани отсутствовали, распространенность отека дермы снижалась на 15,25% по сравнению с 7-ми сутками наблюдения и была достоверно ниже, чем в контрольной группе (p<0,05). Увеличивалось количество фибробластов и лимфоцитов (на 8,08% и 5,17% соответственно), тогда как число гранулоцитов и макрофагов снижалось соответственно на 5,44% и 33,33% по сравнению с предыдущим сроком наблюдения.

В гистологической картине инфильтратов ран контрольной группы на 14-е сутки визуализируется четко выраженный лейкоцитарно-фибринозный струп с участками отторжения. На небольшом протяжении струп располагается на вновь образованном эпидермисе (4,56±1,36%). Краевая эпителизация. Увеличивается количество рыхлой грануляционной ткани (до 44,04±1,61%). Отмечали наличие неэпителизированных участков. Сохраняется выраженный отек дермы (25,71±1,21%), ее выраженная инфильтрация. Однако стоит отметить увеличение в клеточном инфильтрате фибробластов. Отек и инфильтрация распространяются на гиподерму. Инфильтрация подкожной жировой клетчатки и мышц выражена в большей степени, чем сетчатого слоя дермы. В некоторых препаратах отмечено формирование вторичного демаркационного вала. Отмечается уменьшение сосудистых реакций и снижение посттравматического отека.

По сравнению с предыдущим сроком наблюдения доля некротизированных тканей и отека также снижались (на 31,70% и 10,06% соответственно), а новообразованного эпителия и подлежащей соединительной ткани увеличивалась (на 4,85% и 71,41%). Количество фибробластов снижалось на 8,02%. Число гранулоцитов увеличивалось на 20,81%.

На 14-ые сутки в опытной группе, получавшей аналог в дозе 100 мкг/кг, отмечали наличие неэпителизированных участков под оформленным струпом. Регенерировавший эпителий (14,53±1,56%) покрывал большую площадь ожоговой раны, располагаясь на рыхлой грануляционной ткани, содержащей большое количество фибробластов и макрофагов. Отек дермы незначительный. Маловыраженная клеточная инфильтрация.

Продолжалось увеличение площади эпителизации (на 8,79%) и распространения подлежащей рыхлой соединительной ткани (на 45,96%) по сравнению с 10-ми сутками наблюдения. Распространенность отека дермы снижалась на 4,25%. Продолжало увеличиваться количество фибробластов (на 8,76%). Число гранулоцитов, лимфоцитов и макрофагов снижалось на 3,54%, 3,28% и 36,68% соответственно.

Результаты проведенных экспериментов показывают, что под влиянием синтетического аналога индолицидина в клеточном инфильтрате ран с первых суток после ожоговой травмы по сравнению с контролем достоверно увеличивалось количество макрофагов и фибробластов, когда количество нейтрофилов и лимфоцитов было меньше. Отек и баллонная дистрофия выражены менее значительно. Количество некротизированных тканей было максимальным в начале эксперимента и отсутствовало через 14 суток. Под влиянием исследуемого пептида эпителизация и созревание грануляционной ткани протекали значительно интенсивнее и заканчивались раньше, чем у контрольных животных, что также подтверждается клиническими наблюдениями.

Таким образом, результаты исследований доказывают, что предлагаемый способ эффективно стимулирует репаративную регенерацию на примере экспериментальных ожоговых ран. Способ основан на применении синтетического аналога природного антимикробного пептида индолицидин, обладающего выраженным стимулирующим и модулирующим действием, полифункциональностью, не является трудоемким и не требует использования сложного оборудования.

Изобретение относится к медицине, в частности к комбустиологии, и может быть использовано для стимуляции регенерации кожи. Для этого применяют синтетический аналог природного антимикробного пептида индолицидин, имеющего формулу H-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Lys-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH₂. Изобретение обеспечивает ускорение репаративной регенерации кожи после ожоговой травмы. 2 табл., 1 пр.

Применение синтетического аналога природного антимикробного пептида индолицидин, имеющего формулу H-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Lys-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH₂, для стимуляции репаративной регенерации кожи.