СПОСОБ ПОСТНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ФЕТАЛЬНОГО АЛКОГОЛЬНОГО СИНДРОМА У УМЕРШИХ ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА Российский патент 2015 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области судебной медицины, криминалистики и может быть использовано в этих областях при экспертном отождествлении личности умершего ребенка раннего возраста с диагнозом фетального алкогольного синдрома, а также для диагностики фетального алкогольного синдрома у умершего ребенка раннего возраста.

Неблагополучно протекающая беременность и роды оказывают часто более пагубное воздействие на нервную систему и психику человека, чем эндо- и экзогенные факторы в постнатальном периоде. Среди факторов, нарушающих оптимальность течения беременности и закономерно влияющих на формирование разнообразных девиаций у плода и ребенка, особое место занимают токсические воздействия, в том числе употребление женщиной алкоголя во время беременности. Развернутая клиническая картина, возникающая у плода, вследствие внутриутробного воздействия алкоголя, носит название фетального алкогольного синдрома.

Фетальный алкогольный синдром (ФАС) - это устойчивый комплекс врожденных дефектов, пороков и нарушений развития плода и ребенка, возникающих во внутриутробный период под воздействием этанола при употреблении женщиной алкогольных напитков в течение беременности.

По клиническим проявлениям все симптомы ФАС делят на 3 основные группы: нарушения физического развития; дисморфизм лицевого черепа; отклонения со стороны ЦНС.

Соответственно диагностика ФАС базируется на документировании трех отклонений: лицевых отклонений (сглаженный носогубный желобок, тонкая кайма верхней губы и короткие глазные щели); дефицита роста и веса; отклонений со стороны ЦНС.

Известен способ постнатальной диагностики фетального алкогольного синдрома у детей раннего возраста, в соответствии с которым выявляют морфологические изменения в головном мозге с помощью магнитно-резонансной томографии. Исследования показали, что при верифицированном ФАС происходит достоверное уменьшение объема мозга в целом на 15%, мозжечка - на 18%, хвостатого ядра - на 23%, кроме того, возможны различные формы недоразвития мозолистого тела. Только агенезия мозолистого тела встречается у 45% детей с ФАС (Mattson, S.N.; Jernigan, T.L.; and Riley, E.P. 1994. MRI and prenatal alcohol exposure: Images provide insight into FAS. Alcohol Health & Research World 18(1):49-52).

Недостаток известного способа состоит в том, что он не позволяет диагностировать фетальный алкогольный синдром по конкретным морфологическим изменениям в мозговом веществе, поскольку выявляет наличие морфологических изменений в мозге по несоответствию норме полученных геометрических размеров как самого мозга, так и его отделов, что требует дополнительных исследований и снижает его достоверность. Кроме того, этот способ диагностики фетального алкогольного синдрома неприменим в судебно-медицинской экспертизе для диагностики умерших детей.

Наиболее близким к предлагаемому является способ постнатальной диагностики фетального алкогольного синдрома у детей раннего возраста, в соответствии с которым анализируют дисморфизм лицевого черепа, а именно выявляют наличие лицевых отклонений, по сравнению с нормой: сглаженный носогубный желобок, тонкая кайма верхней губы и короткие глазные щели (Малахова Жанна Леонидовна, Екатеринбург, доктор медицинских наук, ВАК РФ 14.01.08., автореферат диссертации по медицине на тему «Клинико-патогенетические основы фетального алкогольного синдрома у детей раннего возраста»).

Недостаток известного способа состоит в том, что у ребенка, погибшего в результате криминальных событий, может быть повреждено лицо, что при экспертном отождествлении личности умершего ребенка не позволяет достоверно подтвердить диагноз фетального алкогольного синдрома.

Предлагаемое изобретение решает задачу создания способа постнатальной диагностики фетального алкогольного синдрома у умерших детей раннего возраста, осуществление которого позволяет достичь технического результата, заключающегося в повышении достоверности и в расширении арсенала средств судебно-медицинской экспертизы для постнатальной диагностики фетального алкогольного синдрома у умерших детей раннего возраста.

Сущность изобретения заключается в том, что в заявленном способе постнатальной диагностики фетального алкогольного синдрома у умерших детей раннего возраста новым является то, что берут головной мозг умершего ребенка, взвешивают и фиксируют массу головного мозга, затем выявляют морфологические изменения в головном мозге, для чего вырезают блоки мозгового вещества из конвекситальной коры сенсомоторной зоны, гипоталамической области и мозжечка, затем вырезанные блоки головного мозга фиксируют в 5% нейтральный формалин в объемном соотношении не менее 1:10, для выполнения исследования блок головного мозга вынимают из формалина, обезвоживают, заливают парафином, после чего выполняют срезы, которые окрашивают соответственно гематоксилином-эозином, по Ван Гизону, по Нисслю, затем каждый окрашенный срез исследуют светооптической микроскопией, по результатам исследований диагностируют фетальный алкогольный синдром при наличии совокупности следующих морфологических изменений головного мозга: в мозговом веществе из конвекситальной коры сенсомоторной зоны имеются участки разряжения в средних слоях, хроматолиз цитоплазмы нервных клеток и пикнотические изменения, в мозговом веществе гипоталамической области имеются хроматолиз нервных клеток в форме маргинации ниссленсской субстанции, перицеллюлярный отек, в мозговом веществе мозжечка имеются разряжение клеток, дистрофические изменения клеток Пуркинье, при этом фиксированная масса мозга ниже минимально допустимой для нормально развитого ребенка аналогичного возраста.

Технический результат достигается следующим образом.

Как указывалось выше, по клиническим проявлениям все симптомы ФАС делят на 3 основные группы: нарушения физического развития; дисморфизм лицевого черепа; отклонения со стороны ЦНС.

Из литературы известно, что повреждающее действие этанола на органном уровне выражается, прежде всего, отклонениями со стороны мозга. При этом одним из основных по частоте встречаемости (94%) краниоцеребральных морфологических изменений является микроцефалия (Диагностические подходы к выявлению фетального алкогольного синдрома (ФАС) и его отсроченных проявлений у детей раннего возраста (Методические рекомендации) / Шилко В.И., Малахова Ж.Л., Бубнов А.А. // Екатеринбург, 2010 - 18 с.).

Размер окружности головы, косвенно характеризующий объемные размеры мозгового черепа, тесно связан с размерами головного мозга. В литературе имеются указания на четкую связь снижения интеллекта со снижением размеров окружности головы (Тиганов А.С., Снежневская А.В., Орловская Д.Д. и др. "Руководство по психиатрии", том 2, изд-во - Медицина, 1999 г., 784 с.).

В заявленном способе головной мозг погибшего ребенка взвешивают и фиксируют его массу. При этом ФАС диагностируют по совокупности признаков, один из которых - это «величина фиксированной массы головного мозга ниже минимально допустимой для нормально развитого ребенка аналогичного возраста»: Таким образом, в заявленном способе опосредованно диагностируют наличие микроцефалии, что повышает достоверность заявленного способа.

Кроме того, для диагностировании ФАС в заявленном способе выявляют морфологические изменения в головном мозге ребенка и, если в мозговом веществе из конвекситальной коры сенсомоторной зоны имеются участки разряжения в средних слоях, хроматолиз цитоплазмы нервных клеток и пикнотические изменения, в мозговом веществе гипоталамической области имеются хроматолиз нервных клеток в форме маргинации ниссленсской субстанции, перицеллюлярный отек, в мозговом веществе мозжечка имеются разряжение клеток, дистрофические изменения клеток Пуркинье, при этом фиксированная масса головного мозга ниже минимально допустимой для нормально развитого ребенка аналогичного возраста, то диагностируют ФАС.

Ранее в судебно-медицинской экспертизе не диагностировали ФАС по морфологическим изменениям в головном мозге умершего ребенка. Авторами заявленного способа впервые предложена и выполнена диагностика ФАС по морфологическим изменениям в головном мозге умершего ребенка.

Совокупность заявленных в формуле изобретения морфологических изменений головного мозга умершего ребенка, диагностирующая ФАС, является оптимальной и получена в результате набора статистических данных.

Кроме того, благодаря тому что в качестве исследуемых областей мозга берут конвекситальную кору сенсомоторной зоны, гипоталамическую область и мозжечок, обеспечивается высокая достоверность результатов исследований. Это объясняется следующим. Известно, что алкоголь больше накапливается и проявляет свое токсическое действие в тех местах организма, где лучше кровоснабжение. Исследуемые в заявленном способе области головного мозга имеют кровоснабжение, лучшее, по сравнению с остальными областями головного мозга. Это подтверждает и характер изменений в этих участках мозга, обуславливающих диагностику ФАС. Наличие в мозговом веществе из конвекситальной коры сенсомоторной зоны участков разряжения в средних слоях, хроматолиз цитоплазмы нервных клеток и пикнотические изменения, наличие в мозговом веществе гипоталамической области хроматолиза нервных клеток в форме маргинации ниссленсской субстанции, перицеллюлярного отека, наличие в мозговом веществе мозжечка разряжения клеток, дистрофические изменения клеток Пуркинье - все это в совокупности свидетельствует о гибели нейронов из-за токсического действия алкоголя. Авторами получены данные, что количество нейронов уменьшается в 2 раза.

Вырезанные блоки головного мозга фиксируют в 5% нейтральный формалин в объемном соотношении не менее 1:10.

Живые ткани, извлеченные из тела, подвергаются быстрым изменениям; между тем любое самое незначительное изменение ткани ведет к искажению картины на гистологическом препарате. Поэтому очень важно сразу же после извлечения ткани из организма обеспечить ее сохранность (http://intranet.tdmu.tdu… «Лекция №2 Методы биологических (гистологических) исследований). Это достигается с помощью фиксаторов - жидкостей различного химического состава, которые очень быстро убивают клетки, не искажая детали их строения и обеспечивая сохранение ткани в этом - фиксированном - состоянии. Фиксация сохраняет структуру клеток, тканей и органов, предотвращает их бактериальное загрязнение и ферментное переваривание, стабилизирует макромолекулы путем химического их сшивания.

В заявленном способе в качестве фиксатора тканей мозга используют формалин, для чего вырезанные блоки головного мозга фиксируют в 5% нейтральный формалин в объемном соотношении не менее 1:10.

Объемное соотношение между фиксируемой тканью головного мозга и формалином является оптимальным и получено авторами опытным путем.

В заявленном способе для выполнения исследования блок головного мозга вынимают из формалина и заливают парафином. Это необходимая операция, предваряющая приготовление срезов. Заливка парафином делает исследуемую ткань прочной, предотвращает ее раздавливание и сминание при резании, дает возможность получить тонкие срезы стандартной толщины (http://intranet.tdmu.tdu… «Лекция №2 Методы биологических (гистологических) исследований). Это, в свою очередь, обеспечивает осуществимость заявленного способа и повышает достоверность результатов исследований.

Обезвоживание исследуемой ткани перед заливкой формалином готовит фиксированную ткань к проникновению в нее среды для заливки, в нашем случае - парафина, что впоследствии улучшает качество среза.

В заявленном способе каждый окрашенный срез головного мозга исследуют светооптической микроскопией.

Светооптическая микроскопия - это исследование с помощью микроскопа, оптического прибора, позволяющего наблюдать мелкие объекты. Увеличение изображения достигается системой линз объектива и окуляра. Зеркало, конденсор и диафрагма направляют световой поток и регулируют освещение объекта. Использование в заявленном способе для диагностики ФАС светооптической микроскопии обеспечивает осуществимость заявленного способа, а следовательно, обеспечивает достижение заявленного технического результата.

Окрашивание исследуемых срезов тканей мозга обеспечивает более отчетливое выявление различных компонентов клеток и тканей. В заявленном способе при выполнении светооптической микроскопии используют стандартную смесь щелочного и кислотного красителей: гематоксилин и эозин. (http://intranet.tdmu.tdu… «Лекция №2 Методы биологических (гистологических) исследований»; «Общие принципы и методы окрашивания гистологических препаратов» (Микроскопическая техника: Руководство / Под редакцией Д.С. Саркисова и Ю.Л. Перова. - М.: Медицина, 1996. ISBN 5-225-02-820-9).

Щелочные красители, в нашем случае гематоксилин, связываются с базофильными (кислыми) компонентами ткани (например, нуклеиновые кислоты ядра и рибосом).

Гематоксилин имеет растительное происхождение: его получают из эфирного экстракта кампешевого дерева. Гематоксилин хорошо растворяется в спирте и плохо в воде. Красящими свойствами обладает продукт окисления гематоксилина - гематеин.

Кислотные красители, в нашем случае - эозин, связываются со структурами или веществами, имеющими щелочную реакцию. Это ацидофильные (основные) компоненты ткани. С помощью кислотных красителей выявляют вещества и структуры основной природы (цитоплазматические структуры клеток, эритроциты и т.д.).

Эозин - ксантеновый краситель, растворимый в воде, получают действием брома на флуоресцеин. Интенсивно-розового цвета. Имеет широкое применение в гистологии и цитологии как контрастирующий цитоплазматический краситель. Чаще всего в сочетании с ядерными красителями, например эозин-гематоксилин. Окраска гематоксилин-эозином является основной обзорной окраской гистологических и цитологических препаратов (ИНТЕРНЕТ. ВИКИПЕДИЯ).

Кроме того, в заявленном способе используют окраску по Ван Гизону - метод окраски микропрепаратов в гистологии, предназначенный для изучения структуры соединительной ткани. Красителем служит смесь кислого фуксина и пикриновой кислоты, причем первый компонент окрашивает коллагеновые волокна в ярко-красный цвет, а второй придает прочим структурам ткани желтую окраску. Окраска разработана американским психоневрологом и патологом Айрой Ван Гизоном в 1889 году (ИНТЕРНЕТ, ВИКИПЕДИЯ).

Окраска по методу Ниссля является общеизвестной нейрогистологической методикой, позволяющей выявлять ядра нервных и глиальных клеток, а также хроматофильную субстанцию (субстанцию Ниссля, тигроидное вещество) в цитоплазме нейронов (http://www.histomix.ru/product_15.html).

Из вышеизложенного следует, что в заявленном способе исследуемые срезы каждого из блоков головного мозга окрашивают гематоксилином-эозином, по Ван Гизону, по Нисслю. При этом на конкретное окрашивание реагируют конкретные составляющие исследуемой ткани, а именно базофильные компоненты ткани, ацидофильные компоненты ткани, ядра нервных и глиальных клеток, а также хроматофильная субстанция (субстанцию Ниссля, тигроидное вещество) в цитоплазме нейронов, структура соединительной ткани. В результате посредством выполнения светооптической микроскопии каждого соответственно окрашенного среза исследуемого блока мозга обеспечивается возможность получения широкого спектра информации и с высокой достоверностью о состоянии тканей мозга, а именно состояния мозгового вещества из конвекситальной коры сенсомоторной зоны, гипоталамической области и мозжечка. Это позволяет достоверно выявить наличие морфологических изменений в исследуемых областях головного мозга и достоверно их охарактеризовать, что повышает достоверность диагностики ФАС.

Таким образом, из вышеизложенного следует, что заявленный способ постнатальной диагностики фетального алкогольного синдрома у умерших детей раннего возраста при осуществлении обеспечивает достижение технического результата, заключающегося в повышении достоверности и в расширении арсенала средств судебно-медицинской экспертизы для постнатальной диагностики фетального алкогольного синдрома у умерших детей раннего возраста.

На фиг.1 изображен срез конвекситальной коры сенсомоторной зоны головного мозга; на фиг.2 - срез гипоталамической области головного мозга; на фиг.3 - срез мозжечка.

Заявленный способ постнатальной диагностики фетального алкогольного синдрома у умерших детей раннего возраста выполняют следующим образом. Берут головной мозг умершего ребенка, взвешивают и фиксируют массу головного мозга. Затем выявляют морфологические изменения в головном мозге. Для этого вырезают блоки мозгового вещества из конвекситальной коры сенсомоторной зоны, гипоталамической области и мозжечка. Вырезанные блоки головного мозга фиксируют в 5% нейтральный формалин в объемном соотношении не менее 1:10. Для выполнения исследования блок головного мозга вынимают из формалина, обезвоживают, заливают парафином, после чего выполняют несколько срезов. Срезы окрашивают соответственно гематоксилином-эозином, по Ван Гизону, по Нисслю. Каждый соответственно окрашенный срез исследуют светооптической микроскопией. По результатам исследований диагностируют фетальный алкогольный синдром при наличии совокупности следующих морфологических изменений головного мозга: в мозговом веществе из конвекситальной коры сенсомоторной зоны имеются участки разряжения в средних слоях, хроматолиз цитоплазмы нервных клеток и пикнотические изменения, в мозговом веществе гипоталамической области имеются хроматолиз нервных клеток в форме маргинации ниссленсской субстанции, перицеллюлярный отек, в мозговом веществе мозжечка имеются разряжение клеток, дистрофические изменения клеток Пуркинье, при этом фиксированная масса головного мозга ниже минимально допустимой для нормально развитого ребенка аналогичного возраста.

Количество срезов мозгового вещества с каждого блока соответствует количеству используемых окрашиваемых веществ. В нашем случае - не менее трех срезов с каждого блока. Срезы парафиновых блоков с заключенной в них тканью помещают на предметное стекло. Далее удаляют парафин, помещая стекла со срезами в ксилол. Затем выполняют световую микроскопию http://intranet.tdmu.tdu… «Лекция №2 Методы биологических (гистологических) исследований).

Для выполнения заявленного способа использовали электронный микроскоп ШМ-200СХ при ускоряющем напряжении 80 киловольт.

Пример. Клинико-паталогоанатомический случай (ГБУЗ СО ГО Судебно-медицинской экспертизы летального случая ребенка с ФАС; Акт судебно-медицинского исследования №5479 от 19.09.2011 г, рис.5.10-5.12).

Ребенок П., дата рождения - 20.07.2011; возраст 2 месяца; ребенок от V беременности, протекавшей на фоне угрозы прерывания, гестоза, привычной алкогольной интоксикации. Роды II срочные, самостоятельные.

На момент смерти: масса ребенка - 4216 г, масса мозга - 481 г. Масса здорового ребенка в 2 месяца должна составлять 5052 г, т.е. у погибшего ребенка гипотрофия.

Вес мозга у детей в 2 месяца должен составлять 1/8-1/9 от веса ребенка, т.е. для здорового ребенка от 561,3 до 631,5 г.

У погибшего ребенка верхняя граница массы мозга составляет 527 г, что значительно ниже нормы. Это же подтверждает и размер окружности головы, косвенно характеризующий объемные размеры мозгового черепа, поскольку у ребенка имеется внешний признак ФАС-микроцефалия. Описание снимков мозга погибшего ребенка: фиг.1, фиг.2, фиг.3.

На фиг.1 (конвекситальная кора сенсомоторной зоны) отмечаются участки разряжения в средних слоях, хроматолиз цитоплазмы нервных клеток и пикнотические изменения. На фиг.2 (гипоталамическая область) отмечается хроматолиз нервных клеток в форме маргинации ниссленсской субстанции. Перицеллюлярный отек. На фиг.3 (мозжечок) отмечается разряжение клеток, дистрофические изменения клеток Пуркинье.

Авторами было выполнено сравнение морфологии головного мозга погибшего ребенка и детей, умерших от пневмонии, почечной недостаточности и т.п., но без диагноза ФАС. Совпадающих морфологических изменений в головном мозге детей без диагноза ФАС не обнаружено.

Изобретение относится к области судебной медицины, криминалистики и может быть использовано в этих областях при экспертном отождествлении личности умершего ребенка раннего возраста с диагнозом фетального алкогольного синдрома, а также для диагностики фетального алкогольного синдрома у умершего ребенка раннего возраста. Способ постнатальной диагностики фетального алкогольного синдрома у умерших детей раннего возраста заключается в следующем: головной мозг умершего ребенка взвешивают и фиксируют его массу. Выявляют морфологические изменения в головном мозге. Для этого вырезают блоки мозгового вещества из конвекситальной коры сенсомоторной зоны, гипоталамической области и мозжечка. Исследуют светооптической микроскопией с предварительным окрашиванием срезов мозгового вещества. Окрашивание выполняют гематоксилином-эозином, по Ван Гизону, по Нисслю. По результатам исследований диагностируют фетальный алкогольный синдром при наличии совокупности следующих морфологических изменений головного мозга: в мозговом веществе из конвекситальной коры сенсомоторной зоны имеются участки разряжения в средних слоях, хроматолиз цитоплазмы нервных клеток и пикнотические изменения, в мозговом веществе гипоталамической области имеются хроматолиз нервных клеток в форме маргинации ниссленсской субстанции, перицеллюлярный отек, в мозговом веществе мозжечка имеются разряжение клеток, дистрофические изменения клеток Пуркинье, при этом фиксированная масса головного мозга ниже минимально допустимой для нормально развитого ребенка аналогичного возраста. Достигаемый технический результат: повышение достоверности и расширение арсенала средств судебно-медицинской экспертизы для постнатальной диагностики фетального алкогольного синдрома у умерших детей раннего возраста. 3 ил., 1 пр.

Способ постнатальной диагностики фетального алкогольного синдрома у умерших детей раннего возраста, отличающийся тем, что берут головной мозг умершего ребенка, взвешивают и фиксируют массу головного мозга, затем выявляют морфологические изменения в головном мозге, для чего вырезают блоки мозгового вещества из конвекситальной коры сенсомоторной зоны, гипоталамической области и мозжечка, затем вырезанные блоки головного мозга фиксируют в 5% нейтральный формалин в объемном соотношении не менее 1:10, для выполнения исследования блок головного мозга вынимают из формалина, обезвоживают, заливают парафином, после чего выполняют срезы, которые окрашивают соответственно гематоксилином-эозином, по Ван Гизону, по Нисслю, затем каждый окрашенный срез исследуют светооптической микроскопией, по результатам исследований диагностируют фетальный алкогольный синдром при наличии совокупности следующих морфологических изменений головного мозга: в мозговом веществе из конвекситальной коры сенсомоторной зоны имеются участки разряжения в средних слоях, хроматолиз цитоплазмы нервных клеток и пикнотические изменения, в мозговом веществе гипоталамической области имеются хроматолиз нервных клеток в форме маргинации ниссленсской субстанции, перицеллюлярный отек, в мозговом веществе мозжечка имеются разряжение клеток, дистрофические изменения клеток Пуркинье, при этом фиксированная масса головного мозга ниже минимально допустимой для нормально развитого ребенка аналогичного возраста.