СОПОЛИМЕРЫ 4-ВИНИЛПИРИДИНА ИЛИ 2-МЕТИЛ-5-ВИНИЛПИРИДИНА И N-ВИНИЛПИРРОЛИДОНА С КОНЦЕВЫМ ОСТАТКОМ ЦИАНОВАЛЕРИАНОВОЙ КИСЛОТЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПНЕВМОКОНИОЗОВ Российский патент 2015 года по МПК C08F226/10 A61K31/785 A61P11/00 

Область техники

Изобретение относится к области химии биологически активных полимеров. Более конкретно изобретение относится к сополимерам N-винилпирролидона, содержащим в качестве концевых фрагментов остаток циановалериановой кислоты и атом водорода, общей формулы (I):

где мономерное звено является фрагментом 4-винилпиридина (4-ВП), если X представляет

или фрагментом 2-метил-5-винилпиридина (2-М-5-ВП), если X представляет

,

в котором содержание мономерных звеньев, являющихся фрагментами 4-ВП или 2-М-5-ВП, составляет 20-90 мольн. %, средневязкостная молекулярная масса M_µ сополимеров равна 10-350 кДа, а кислотное число равно (0,1-5,6)·10^-3 мг KOH/г.

Указанные сополимеры обладает активностью, позволяющей использовать их в качестве агента при лечении пневмокониозов.

Уровень техники

В патенте RU 2415876 (опубл. 10.04.2011) описан синтез сополимера N-винилпирролидона, содержащего 25-90 мол.% мономерных звеньев 2-метил-5-винилпиридина со средневязкостной молекулярной массой 46-150 кДа и его применение в качестве адъюванта при изготовлении вакцины против гриппа. Указанный сополимер получают радикальной сополимеризацией N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина в присутствии динитрила азобис-изомасляной кислоты (0,4%) в качестве инициатора сополимеризации, пероксида водорода (0,2%) и циклогексана (5,4-7,1%) в качестве регулятора молекулярной массы, а целевой продукт выделяют осаждением в диэтиловый эфир.

Наиболее близкий аналог настоящего изобретения раскрыт в статье «Molecular design of polyvinylpyrrolidone-conjugated interleukin-6 for enhancement of in vivo thrombopoietic activity in mice», S. Tsunoda et al. / Journal of Controlled Release, 68 (2000), 335-341, в которой описан полимер N-винилпирролидона, содержащий в качестве концевых фрагментов остаток циановалериановой кислоты и атом водорода, с молекулярной массой от 2 до 15,2 кДа определенной с помощью гельпроникающей хроматографии и способ получения данного полимера, общей формулы (II):

Указанный полимер получают радикальной полимеризацией N-винилпирролидона в присутствии динитрила азоизомасляной кислоты (4%) в качестве инициатора полимеризации и источника фрагмента циановалериановой кислоты и 3-меркаптопропионовой кислоты в качестве переносчика радикала, регулятора процесса обрыва цепи и источника концевого атома водорода. Для проведения процесса все компоненты растворяли в диметилформамиде и выдерживали при 60°C в течение 6 ч. Регулирование молекулярной массы полимера осуществляли регулируя соотношения в реакционной массе динитрила азоизомасляной кислоты (4%) и 3-меркаптопропионовой кислоты (Таб. 1). Выделение полимера осуществляли с помощью диализа, применяя мембраны Spectra/Por MWCO53500, Spectrum, СА, USA.

Описанный способ не позволяет получить сополимеры N-ВП и 4-ВП или 2-М-5-ВП, соответствующие формуле (I), и приводит к смеси гомополимеров - поливинилпирролидона и поливинилпиридина, что связано с различием более чем на один порядок наблюдаемых констант полимеризации N-ВП и 4-ВП или 2-М-5-ВП.

Значение средней массы (Mn) поливинилпирролидона определялось методом гельпроникающей хроматографии с использованием полиэтиленгликоля в качестве стандарта.

Аналогом данного изобретения в части применения полимеров в качестве агентов для лечения пневмокониозов является поливинилпиридин-N-оксид на основе 2-винил- и 4-винилпиридина, применение которых описанно в “Poly(vinylpyridine oxides) in pneumoconiosis”, Research British journal of industrial medicine, 1971, 28, 72-77 и в Кацнельсон Б.А., Алексеева О.Г., Привалова Л.И., Ползик Е.В. «Пневмокониозы: патогенез и биологическая профилактика». Екатеринбург: УрО РАН, 1995.

Целью данного изобретения является расширение арсенала биологически активных соединений на основе сополимеров N-винилпирролидона, которые могут найти применение в медицине.

Описание изобретения

Авторы настоящего изобретения провели обширные исследования и установили, что сополимер на основе N-винилпирролидона (N-ВП) и 4-винилпиридина (4-ВП) или 2-метил-5-винилпиридина (2-М-5-ВП), содержащие в качестве концевых фрагментов остаток циановалериановой кислоты и атом водорода, в отличие от известных аналогов, обладают активностью в отношении пневмокониозов.

Авторы установили, что различие более чем на один порядок наблюдаемых констант полимеризации N-ВП и винилпиридинов позволяет регулировать соотношение N-ВП и винилпиридинов при совместной сополимеризации в присутствии 4,4'-азобис(4-циановалериановой кислоты) (АЦВК) в количестве не менее 4 масс. %, выступающего в качестве инициатора полимеризации и источника фрагмента циановалериановой кислоты; 3-меркаптопропионовой кислоты в количестве до 1 масс.%, выступающей в качестве переносчика радикала, регулятора обрыва цепи и источника концевого атома водорода; циклогексана, выступающего в качестве регулятора молекулярной массы, и получать сополимер, отвечающий общей формуле (I). Молекулярную массу сополимера, нерегулярную структуру и соотношение в нем пиридиновых и пирролидоновых звеньев удается регулировать, изменяя соотношения компонентов в реакционной массе и компенсируя их расход с помощью подпиточной смеси. Состав исходной подпиточной смеси должен учитывать, что наблюдаемые константы полимеризации N-ВП и винилпиридинов различаются более чем на один порядок. Учет выявленных факторов и закономерностей позволяет получать сополимеры в соответствии с формулой изобретения.

В соответствии с данным изобретением получают сополимеры формулы (I):

где мономерное звено является фрагментом 4-винилпиридина (4-ВП), если X представляет

или фрагментом 2-метил-5-винилпиридина (2-М-5-ВП), если X представляет

,

в которых содержание мономерных звеньев, являющихся фрагментами 4-ВП или 2-М-5-ВП, составляет 20-90 мольн.%, средневязкостная молекулярная масса M_µ сополимеров равна M_µ=10-350 кДа, а кислотное число равно (0,1-5,6)·10^-3 мг КОН/г.

Предпочтительно содержание мономерных звеньев 4-ВП или 2-М-5-ВП составляет 25-40 мольн.%, средневязкостная молекулярная масса М_µ сополимеров равна М_µ=15-30 кДа, а кислотное число равно (1,87-3,7)·10^-3 мг КОН/г.

Также в соответствии с изобретением предлагается применение раскрытых выше сополимеров в качестве агента при лечении пневмокониозов.

Для реализации описанного изобретения проводят радикальную сополимеризацию N-ВП и 4-ВП или 2-М-5-ВП в присутствии 4,4'-азобис(4-циановалериановой кислоты) (АЦВК) и 3-меркаптопропионовой кислоты (3-МП). Постоянство соотношения в сополимерах N-ВП и 4-ВП или 2-М-5-ВП, наличие концевых фрагментов циановалериановой кислоты и атома водорода обеспечивают, компенсируя расход компонентов подпиточной смесью. Продукт выделяют осаждением в диэтиловый эфир (ДЭ).

Исходная реакционная смесь содержит 83,5-92,0 мас.% N-ВП, 1,5-9,5 масс.% ВП, 6,5-7,0 масс.% ЦГ, 0-1 масс.% 3-МП и 1-4 масс.% АЦВК.

Подпиточная смесь содержит 7-72 масс.% N-ВП, 28-93 масс.% 2-М-5-ВП, 0-1 масс.% 3-МП и 1-4 масс.% АЦВК. Объем подпиточной смеси вычисляют каждые 20 минут по результатам анализа соотношения концентраций мономеров в реакционной смеси. Реакцию сополимеризации проводят при температуре 65-70°C. По достижении степени конверсии по мономерам около 20% реакционную массу охлаждают до 20°C и осаждают в диэтиловый эфир.

Строение полученного продукта характеризуется, в частности, числом мономерных звеньев пиридина (n), средневязкостной молекулярной массой и «кислотным числом». Число мономерных звеньев пиридина определяют по данным ЯМР-спектрометрии, например ¹Н-, ¹³С- или ¹⁵N-ЯМР, по соотношениям интегральных интенсивностей сигналов определенных ядер. Решение данной задачи также доступно среднему специалисту в данной области. Средневязкостную молекулярную массу вычисляют по характеристической вязкости сополимеров. Выбор методики и подбор условий измерения вязкости являются рутинной процедурой, доступной среднему специалисту в данной области. В одном варианте изобретения характеристическую вязкость определяют в растворителе, состоящем из 85 об.% ДМФА и 15 об.% 0,1 М водного раствора LiBr. Кислотное число определяют как количество миллиграмм гидроксида калия (КОН), необходимое для нейтрализации всех карбоксильных групп, содержащихся в 1 г сополимера. Для определения кислотного числа (X) в мг КОН/г проводят потенциометрическое титрование водного раствора полимера раствором гидроксида натрия и вычисляют по формуле (III):

X=V·5,6·10^-3/m, (III)

где V - точный объем 0,0001 н раствора гидроксида натрия, пошедший на титрование, мл; m - масса навески полимера, г; 5,6·10^-3 - масса гидроксида калия, соответствующая 1 мл 0,0001 н раствора титранта, мг.

При необходимости для усиления определенного вида активности сополимера в соответствии с настоящим изобретением продукт реакции с широким молекулярно-массовым распределением может быть дополнительно фракционирован, например, методом гель-хроматографии. Условия выполнения фракционирования известны среднему специалисту в данной области. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением имеется возможность регулировать диапазон средневязкостной молекулярной массы М_µ сополимера на стадии синтеза, изменяя количества 3-меркаптопропионовой кислоты и ЦГ.

Сополимер в соответствии с настоящим изобретением является нетоксичным. В качестве признаков токсического воздействия сополимера на подопытных животных могут рассматриваться, например, гибель, снижение массы тела, изменения походки и поведения, цвета мочи, консистенции экскрементов, состояния глаз и ушей, выпадение зубов и шерсти, а также раздражение кожи в месте введения препарата.

Сополимер в соответствии настоящим изобретением нетоксичен и обладает активностью в отношении пневмокониозов, что подтверждено исследованиями in vivo. Специалисту в данной области очевиден выбор методов исследования, а также подопытных животных, в качестве которых могут быть использованы млекопитающие. В одном из вариантов млекопитающими являются беспородные белые мыши. В другом варианте млекопитающими являются беспородные белые крысы.

Осуществление изобретения.

Далее приведены иллюстративные примеры осуществления изобретения, способствующие более точному и полному пониманию его сути. Специалисту в данной области очевидны возможные модификации и замены, например, относящиеся к протоколам исследований, которые не выходят за рамки объема изобретения, определяемые его формулой.

В примерах 1-9 «ВП» означает 4-ВП или 2-М-5-ВП, что однозначно определено в каждом конкретном случае.

Пример 1. Получение сополимера N-винилпирролидона (N-ВП) и 4-винилпиридина (4-ВП), содержащего в качестве концевых фрагментов остаток циановалериановой кислоты и атом водорода.

В реактор загружают исходную реакционную смесь, содержащую 2,30 кг N-ВП (89,56 масс.%), 45 г ВП (1,75 масс.%), 100 г циклогексана (3,89 масс.%), 21 г 3-меркаптопропионовой кислоты (3-МП) (0,82 масс.%) и 102,0 г АЦВК (3,97 масс.%). Реакционную массу нагревают до 60-70°C и ведут синтез при данной температуре, периодически отбирая пробы для хроматографического анализа (ВЭЖХ, Сферисорб С-18, 5 мкм, 4,6×250 мм, EtOH/H₂O 6:94, 2,5 мл/мин (50°C), 254 нм) и подавая подпиточную смесь, содержащую 450 г N-ВП (75,13 мас.%), 120,0 г ВП (20,03 масс.%), 6 г 3-меркаптопропионовой кислоты (3-МП) (1,0 масс.%) и 23 г АЦВК (3,84 масс.%). По достижении степени конверсии по мономерам 20-25% реакционную массу охлаждают до 20°C и осаждают в диэтиловый эфир (ДЭ). Целевой продукт промывают на фильтре 2 л ДЭ, выделяют фильтрацией и сушат: сначала при атмосферном давлении при 40-60°C, а затем - в вакуумном сушильном шкафу при 80-90°C. Получают 570 г аморфного порошка белого цвета, растворимого в воде (10 мас.% водный раствор имеет pH 6,9-7,0), с суммарным содержанием звеньев ВП, равным 22 мольн.%, М_µ сополимера 28 кДа, кислотное число 1,47·10^-3 мг КОН/г.

Примеры 2-9. Синтез и выделение сополимеров осуществляют в условиях, указанных в Примере 1. Состав исходной и подпиточной смесей, а также выход сополимера (Выход, %), содержание в нем звеньев ВП (n, мол.%) и интервалы средневязкостной молекулярной массы М_µ сополимера приведены в Таблице 2.

Таблица 2.

Пример 2 3 4 5 6 7 8 9 Реакционная смесь N-ВП, г 2300 2300 2300 2300 2300 2300 2300 2300 4-ВП, г 100 210 280 150 0 0 0 0 2-М-5-ВП, г 0 0 0 0 96 218 279 150 АЦВК, г 100 90 90 30 100 92 90 30 3-МП, г 25 23 23 2 25 22 23 2 ЦГ, г 100 80 80 85 100 80 80 70 Подпиточная смесь N-ВП, г 450 410 46 450 450 420 50 450 4-ВП, г 126,9 146 543 145 0 0 0 0 2-М-5-ВП, г 0 0 0 0 120 150 540 140 АЦВК, г 24 20 20 20 23 20 20 15 3-МП, г 6 5 5,3 2 5,9 5 5 1,2 Выход, г 578 665 711 700 558 650 708 730 n, мол.% 22 64 90 35 21 64 90 35 M_μ, кДа 10-30 50-80 50-80 300-350 10-30 50-80 50-80 300-350

Пример 10. Исследование in vivo острой токсичности сополимеров в соответствии с изобретением.

Исследование проводили в группах из 6 здоровых беспородных белых мышей массой 18-22 г. Сополимер, полученный в соответствии с каждым из Примеров 1-9, растворяют в стерильном изотоническом растворе NaCl из расчета 5 мас.% и вводят каждому животному 1,0 мл этого раствора. Соединение считают выдержавшим испытание, если через 7 суток наблюдения в группе не погибло ни одно животное. В исследовании, проведенном для сополимеров, полученных в Примерах 1-9, гибели животных не отмечено.

Пример 11. Исследование действия сополимера в соответствии с изобретением в качестве агента для лечения (терапии) пневмокониозов.

Исследования проводили на 63 белых беспородных крысах.

Для развития антракоза у подопытных животных антрацитовую пыль с содержанием 8-10% свободного SiO₂ и дисперсностью пылевых частиц до 5 мкм (85%) вводили однократно интратрахеально в виде взвеси по 50 мг в 1 мл физиологического раствора.

Сополимер, полученный в соответствии с каждым из Примеров 1-9, растворяли в стерильном изотоническом растворе из расчета 1% от массы и вводили интратрахеально в дозе 25 мг/кг однократно через 30 или дробно через 30; 45 и 60 суток.

Для проведения исследования сополимера, полученного в соответствии с каждым из Примеров 1-9, подопытных животных разделяли на 21 группу по 3 крысы в каждой группе:

КОНТРОЛЬНАЯ ГРУППА - группа животных, которую не подвергают запыливанию и препарат не вводится.

1-я ГРУППА - животные, получающие однократно интратрахеально 50 мг антрацитовой пыли.

2-10-я ГРУППА - животные, которым после интратрахеального введения 50 мг антрацитовой пыли через 30 суток однократно вводят 25 мг/кг сополимера в соответствии с каждым из Примеров 1-9.

11-20-я ГРУППА- животные, которым после интратрахеального введения 50 мг антрацитовой пыли сополимер в соответствии с каждым из Примеров 1-9 вводится дробно: через 30 суток - 10 мг/кг; через 45 суток - 5 мг/кг; и через 60 суток - 10 мг/кг.

Подопытных животных обследовали ежемесячно с использованием физиологических, биохимических, иммунологических и морфологических методов исследования. Полученные результаты обрабатывают статистически.

Наличие выраженного лечебного действия препарата определяют по следующим показателям:

- динамика изменения веса животных сохраняется на уровне контрольной группы;

- потребление кислорода и суммационно-пороговый показатель уравнивается с контрольной группой к концу наблюдения;

- пределы колебаний морфологического состава периферической крови, гемоглобина и общего белка сыворотки крови остаются на уровне контроля;

- изменение окислительно-восстановительных процессов (по содержанию сульфгидрильных групп и индексу каталазы), процессов переаминирования (АЛТ, ACT) и активность холинэстеразы крови восстанавливаются к концу срока наблюдения;

- морфологические исследования показывают уменьшение количества очажков эмфиземы, количество утолщенных межальвеолярных перегородок, уменьшение инфильтрации и отека, отсутствие клеточно-фиброзных узелков.

Ежемесячное обследование показало, что подопытные животные равномерно прибавляли в весе в каждой из групп. Достоверное отставание в весе отмечено со 2-го месяца от начала интратрахеального введения антрацитовой пыли в группе,не получавшей сополимер (1-я группа). В группах (2-10), получавших сополимер однократно в дозе 25 мг/кг, снижение нарастания веса выявлено с 4-го месяца от начала интратрахеального введения пыли. В группах (11-20), получавших сополимер в дозе 25 мг/кг дробно (10-5-10 мг/кг), нарастание веса практически не отличалось от контрольной группы на протяжении 6 месяцев. Увеличение потребления кислорода крысами наблюдалось во все сроки обследования, начиная с 1 месяца после интратрахеального введения антрацитовой пыли в 1-й группе, не получавшей сополимер. В группах (2-10) животных, получивших сополимер в дозе 25 мг/кг однократно, увеличение потребления кислорода выявлено через 1, 3 и 4 месяца от начала введения пыли, но к концу наблюдения, через 6 месяцев потребление кислорода в этих группах не отличалось от контрольной. В группах (11-20), получавших сополимер дробно во все сроки наблюдения, потребление кислорода животными достоверно не отличалось от контрольной группы.

В группах (2-20) животных, получавших лечение сополимером, пределы колебаний морфологического состава периферической крови, гемоглобина и общего белка сыворотки крови оставались на уровне контроля.

Морфологические исследования показали, что во 2-20-й группах животных, получавших сополимер, в легких через 3 месяца, по сравнению с 1-й группой, не получавшей сополимер, уменьшилось количество очажков эмфиземы, количество утолщенных межальвеолярных перегородок, уменьшились инфильтрация, отек и отсутствовали клеточно-фиброзные узелки.

Изобретение относится к области химии биологически активных полимеров. Предложены сополимеры на основе N-винилпирролидона, содержащие в качестве концевых фрагментов остаток циановалериановой кислоты и атом водорода, общей формулы (I), где мономерное звено является фрагментом 4-винилпиридина (4-ВП), если X представляет

или фрагментом 2-метил-5-винилпиридина (2-М-5-ВП), если X представляет

,

в котором содержание мономерных звеньев, являющихся фрагментами 4-ВП или 2-М-5-ВП, составляет 20-90 мольн.%, средневязкостная молекулярная масса M_µ сополимеров равна 10-350 кДа, а кислотное число равно (0,1-5,6)·10^-3 мг KOH/г. Также предложено применение указанных сополимеров в качестве агента против пневмокониозов. 2 н.п. ф-лы, 2 табл., 11 пр.

1. Сополимер на основе N-винилпирролидона, содержащий в качестве концевых фрагментов остаток циановалериановой кислоты и атом водорода, общей формулы (I):

где мономерное звено является фрагментом 4-винилпиридина (4-ВП), если X представляет

или фрагментом 2-метил-5-винилпиридина (2-М-5-ВП), если X представляет
,
в котором содержание мономерных звеньев, являющихся фрагментами 4-ВП или 2-М-5-ВП, составляет 20-90 мольн.%, средневязкостная молекулярная масса M_µ сополимеров равна 10-350 кДа, а кислотное число равно (0,1-5,6)·10^-3 мг KOH/г.

2. Применение сополимера по п. 1 в качестве агента при лечении пневмокониозов.