АМИДОГИДРОЛАЗЫ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ ИЛИ СТИМУЛЯТОРОВ Российский патент 2015 года по МПК C12N9/82 C12N15/63 

Изобретение касается применения амидогидролазы для приготовления пищевых продуктов или стимулятора.

Пищевые продукты, содержащие углеводы, потреблялись людьми во всем мире в течение многих столетий. В настоящее время такие пищевые продукты получают в широком многообразии форм, например в виде хрустящих хлебцев, сухарей, булочек, кренделей с солью, белого хлеба для тостов, сухих завтраков, бисквиты, картофельных чипсов, чипсов тортийя, чипсов, рисовых лепешек и т.д.

Акриламид часто образуется во время обработки или приготовления пищевых продуктов, содержащих углеводы, в особенности во время процессов нагрева, таких, которые имеют место во время выпечки, обжарки, панировки, жарки на гриле или во фритюре, например, и таким образом концентрируется в этих пищевых продуктах. Подобное явление также наблюдается во время приготовления стимуляторов, таких как приготовление кофе, например.

Результаты испытания по концентрации акриламида в пищевых продуктах были впервые опубликованы шведским уполномоченным органом по безопасности пищевых продуктов в апреле 2002 г. В том же году Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) опубликовала отчет, который, среди других вопрос, обсуждал риски для здоровья, которые могли бы возникнуть в результате высокой концентрации акриламида в пищевых продуктах (FAO/WHO: "Health Implications of Acrylamide in Food", Женева 2002 г.).

Акриламид - вещество, которое действует непосредственно на генетический код человека (ДНК). Кроме того, акриламид преобразуется ферментами в печени в глицидамид, который, по оценкам, обладает генотоксичным эффектом. И акриламид и глицидамид образуют соединения с аминокислотами и нуклеиновыми основаниями и поэтому могут изменять структуру и функцию ДНК и гемоглобина, например. Акриламид классифицируется всеми экспертами как канцерогенный, повреждающий ДНК, ядовитый, как вызывающий раздражение, гиперчувствительность и представляющий угрозу для репродуктивной системы.

Самый важный источник для образования акриламида в продуктах - аминокислота аспарагин, которая распространена в пищевых продуктах, таких как картофель, рис и хлебные злаки, но также присутствует в весьма высоких концентрациях в кофе, сухофруктах. Если пищевой продукт/стимулятор также содержат сахар, такой как, например, фруктоза или глюкоза помимо аспарагина, то это еще более способствует образованию акриламида при высоких температурах.

Процессы приготовления для пищевых продуктов или стимуляторов, включая стадии предобработки для снижения содержания акриламида уже известны из уровня техники (см. США 7037540, США 2004/81724 или США 2005/202153, например). Процессы, в которых ферменты, в особенности аспарагиназы, используются для предобработки, также известны из уровня техники. Эти стадии предобработки, которые предназначены для облегчения удаления, инактивации и/или извлечения аспарагина из пищевых продуктов или стимуляторов, которые будут приготовлены, являются в некоторых случаях очень дорогостоящими и/или занимающими много времени.

Таким образом, процессы для приготовления кофейных бобов соответственно включают, например, сложные стадии высушивания, пропаривания или смачивания. Цель таких стадий предобработки состоит в том, чтобы открыть поры кофейных бобов таким образом, чтобы аспарагин, содержащийся в кофейных бобах, мог быть извлечен, снижен или инактивирован лучшим образом.

В течение операции высушивания кофейные бобы нагревают при температурах ниже приблизительно 50°С, чтобы затем вымачивать в инактивирующих аспарагин растворах, таких как, например, лактат кальция или цитрат кальция.

В течение операции пропаривания/смачивания кофейные бобы обрабатывают паром или водой при низком давлении или атмосферном давлении, во время чего влага поглощается бобами. Затем бобы обычно обрабатывают инактивирующими аспарагин растворами в отдельной стадии.

Все вышеупомянутые сложные, и в некоторых случаях также отнимающие много времени, стадии предобработки прямо или косвенно влекут за собой повышенные затраты, так как они продлевают процесс приготовления в целом и поэтому также делают его дороже.

Поэтому цель, формирующая основу изобретения, состоит в том, чтобы улучшить процессы приготовления для пищевых продуктов или стимуляторов, известных из уровня техники. Такие усовершенствования должны, в особенности, упростить стадии предобработки для снижения содержания аспарагина или акриламида в пищевых продуктах или стимуляторах таким образом, чтобы сделать весь процесс приготовления короче и менее дорогостоящим.

Эта цель достигается предметом формулы изобретения патента.

К удивлению было обнаружено, что пищевые продукты или стимуляторы могут быть приготовлены с применением амидогидролазы, остаточная активность которой после инкубации продолжительностью 5 минут при 50°С составляет по крайней мере 75%.

Изобретение касается применения амидогидролазы, предпочтительно аспарагиназы, остаточная активность которой после инкубации продолжительностью 5 минут при 50°С составляет по крайней мере 75%, для приготовления пищевого продукта или стимулятора, предпочтительно снижения содержания аспарагины в пищевом продукте или стимуляторе. Снижение содержания аспарагина предпочтительно также вызывает уменьшение содержания акриламида в пищевых продуктах или стимуляторе, потому что аспарагин представляет собой предшественник акриламида при подвергании пищевого продукта или стимулятора последующей тепловой обработке.

Фигура 1 показывает линию калибровки определения ионов аммония с применением реактива Несслера. ось X: количество NH₄ в 40 мкл, ось Y: оптическая плотность (OD) при 436 нм. Коэффициент корреляции R² составляет 0,9979.

Фигура 2 показывает ферментативную активность аспарагиназы I Pyrococcus furiosus при различных температурах инкубации. rA: относительная активность (в %), Т [°С]: температура в градусах Цельсия.

Фигура 3 показывает температурную стабильность аспарагиназы I Pyrococcus furiosus при температуре 95°С. rA: относительная активность (в %), мин: время в минутах. Очевидно из графика, что при 95°С после инкубации продолжительностью 60 минут относительная активность или остаточная активность аспарагиназы составляет приблизительно 100%.

Фигура 4 показывает температурную стабильность аспарагиназы I Pyrococcus furiosus при температуре 99°С. rA: относительная активность (в %), мин: время в минутах. Очевидно из графика, что при 99°С после инкубации продолжительностью 60 минут относительная активность или остаточная активность аспарагиназы составляет приблизительно 70%.

Фигура 5 показывает снижение содержания акриламида после обжарки двух типов кофе путем предварительной обработки сырых кофейных бобов аспарагиназой согласно изобретению, как в Примере 4 при 80°С. Контроль 1 и образец 1 - кофе типа смеси кофе "арабика", контроль 2 и образец 2 - кофе типа Бразильская "арабика".

Амидогидролазы принадлежат к семейству ферментов гидролаз. Отличительный признак амидогидролаз состоит в том, что они расщепляют/гидролизируют амидные группы. Они скоординированы под номерами ЕС 3.5.1 и 3.5.2 (номер Ферментной Комиссии (Enzyme Commission) согласно определению Комитета по номенклатуре Международного Союза Биохимии и Молекулярной Биологии (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology - NC-IUBMB).

В смысле описания термин "остаточная активность", как подразумевают, означает любую определенную/объемную ферментативную активность, которую фермент имеет после определенной продолжительности инкубации при определенной температуре по сравнению с оригинальной определенной/объемной активностью в диапазоне его температурного оптимума при иначе идентичных условиях реакции (рН, субстрат и т.д.). В этом случае, в контексте описания определенная/объемная активность фермента, как подразумевают, означает определенное количество превращенного субстрата (в мкмоль) на единицу времени (в минуту) на количество фермента (в мг или мл). Остаточная активность фермента следует из определенной/объемной активности фермента после вышеупомянутой продолжительности инкубации, разделенной на оригинальную определенную/объемную активность, выраженную в процентах (%). В этом случае, специфическая активность фермента предпочтительно указывается в Е/мг, а объемная активность фермента предпочтительно указывается в Е/мл. Альтернативно, определенная/объемная активность фермента может также указываться в катал/мг или катал/мл в контексте описания.

Термин "ферментативная активность", иногда также обозначаемый как "каталитическая активность" или "каталитическая эффективность", общеизвестен специалисту, квалифицированному в данной области, и касается скорости превращения фермента и обычно выражается отношением k_kat/K_M, где k_kat - каталитическая постоянная (также называется числом преобразования), и значение K_M соответствует концентрации субстрата, при которой скорость реакции находится на половине ее максимальной величины. Альтернативно, ферментативная активность фермента может также быть определена определенной активностью (мкмоль превращенного субстрата х мг^-1 х мин ^-1; см. выше) или объемной активностью (мкмоль превращенного субстрата х мл^-1 х мин^-1; см. выше). Ссылка может также быть сделана на общую литературу, такую как Voet et al., "Biochemie" [Biochemistry], 1992, VCH-Verlag, Глава 13, страницы 331-332 относительно ферментативной активности.

В предпочтительных вариантах осуществления A₁-A₇ - F₁-F₇, остаточная активность амидогидролазы, используемой согласно изобретению, составляет предпочтительно по крайней мере 75%, более предпочтительно по крайней мере 80% и наиболее предпочтительно по крайней мере 90%, при условиях, определенных в следующей таблице:

№ Продолжительность Температура (°С)     А В с D Е F 1 5 минут 50 60 70 80 90 100 2 10 минут 50 60 70 80 90 100 3 20 минут 50 60 70 80 90 100 4 30 минут 50 60 70 80 90 100 5 40 минут 50 60 70 80 90 100 6 50 минут 50 60 70 80 90 100 7 60 минут 50 60 70 80 90 100

В вышеупомянутой таблице вариант осуществления С₆, например, означает, что по крайней мере через 50 минут при 70°С остаточная активность амидогидролазы составляет по крайней мере 75%, более предпочтительно по крайней мере 80%, наиболее предпочтительно по крайней мере 90%. В особенно предпочтительном варианте осуществления остаточная активность амидогидролазы находится в диапазоне предпочтительно 75-100%, более предпочтительно 75-90%, при определенных выше условиях.

В предпочтительном варианте осуществления используемая амидогидролаза представляет собой аспарагиназу. В контексте описания аспарагиназа, как подразумевают, является ферментом, который катализирует гидролиз аспарагина до аспартата и аммония. В предпочтительном варианте осуществления это аспарагиназа типа I, а в другом предпочтительном варианте осуществления - аспарагиназа типа II.

Амидогидролаза, предпочтительно аспарагиназа, предпочтительно термоактивна.

В контексте описания "термоактивный" означает, что температурный оптимум таких амидогидролаз, предпочтительно аспарагиназ, находится выше 50°С.

Термин "температурный оптимум" является общеизвестным квалифицированному специалисту и касается диапазона температур, в котором фермент показывает свою максимальную ферментативную активность. В связи с этим может быть сделана ссылка на соответствующую литературу, такую как, например, Voet et al., "Biochemie", 1992, VCH-Verlag, Глава 13, страница 331; I.H. Segel, Enzyme Kinetics: Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State Enzyme Systems, Wiley Interscience, 1993; и A.G. Marangoni, Enzyme Kinetics: A Modern Approach, Wiley Interscience, 2002.

В контексте описания температурный оптимум, как предпочтительно подразумевают, представляет собой диапазон температур, в котором максимальная ферментативная активность амидогидролазы, используемой согласно изобретению, составляет по крайней мере 80%, предпочтительно по крайней мере 90% при иначе постоянных условиях реакции.

Температурный оптимум амидогидролазы, предпочтительно аспарагиназы, предпочтительно находится в диапазоне от 60° до 130°С, более предпочтительно в диапазоне от 70° до 120°С, еще более предпочтительно в диапазоне от 75° до 110°С, наиболее предпочтительно в диапазоне от 80° до 100°С и в особенности в диапазоне от 85° до 95°С.

Поэтому амидогидролазы, предпочтительно аспарагиназы, используемые согласно изобретению предпочтительно не только устойчивы к высоким температурам (то есть, противостоят тепловой обработке относительно их ферментативной активности), но дополнительно термоактивны (то есть, развивают их полную ферментативную активность только при повышенной температуре).

Из предшествующего уровня техники к настоящему времени не известно никакого процесса, в котором термоактивная аспарагиназа применялась для обработки пищевых продуктов или стимуляторов для снижения содержания акриламида.

В предпочтительном варианте осуществления, при температуре предпочтительно от 60° до 120°С, более предпочтительно от 65° до 110°С, еще более предпочтительно от 70° до 100°С, наиболее предпочтительно от 75° до 100°С и в особенности от 80° до 90°С, специфическая активность амидогидролазы, предпочтительно аспарагиназы, предпочтительно составляет, по крайней мере 100, более предпочтительно по крайней мере 200, еще более предпочтительно по крайней мере 300, еще более предпочтительно по крайней мере 500, наиболее предпочтительно по крайней мере 800 и в особенности по крайней мере 100 единиц/мг, причем 1 единица определяется как количество амидогидролазы, которое высвобождает 1,0 мкмоль аммиака в минуту из L-аспарагина при соответствующей температуре реакции и значении рН, составляющем 8,6 (50 мМ Трис-HCl, коррекция рН при 25°С).

К удивлению было обнаружено, что у термоактивной аспарагиназы есть существенные преимущества перед другими аспарагиназами. Например, расщепление аспарагина может быть проведено при сравнительно высоких температурах, используя термоактивные аспарагиназы, и это приводит к совместимости с процессами, в которых высокие температуры, в особенности процессы выдержки при высоких температурах, все еще играют роль. Кроме того, расщепление аспарагина при более высоких температурах может быть проведено при более высокой скорости реакции.

Например, при ферментативной обработке кофейных бобов необходимо дать зеленым кофейным бобам набухнуть в воде прежде, чем их можно будет обработать ферментом. Затем кофейные бобы должны быть высушены снова прежде, чем они смогут быть прожарены. Поэтому ферментативная обработка кофе требует, среди прочего, следующих стадий: а) смачивания; b) ферментативной обработке в смоченном состоянии; с) высушивания; d) прожарки.

Обычные производственные процессы для декафенизации или обеспечения "умеренного вкуса" уже включают вышеупомянутые стадии процесса а), с) и d).

Для стадии высушивания с) кофейные бобы должен быть нагреты до достаточной температуры, так как вода не может быть удалена иначе. Нагревание и смачивание кофейных бобов предпочтительно проводятся с использованием горячего пара (>100°С). Затем при 70-80°С выполняется последующая стадия высушивания с).

Если бы используемая амидогидролаза имела только температурный оптимум, составляющий 50°С, например, это было бы очень неблагоприятно, так как ее нужно было бы во-первых охладить до 50°С для ферментативной обработки и затем снова нагреть для высушивания.

Напротив, не нужно никакого охлаждения при применении термоактивных аспарагиназ, предпочтительных согласно изобретению, и это представляет специфическое преимущество изобретения.

Дальнейшее преимущество при применении термоактивных аспарагиназ состоит в том, что диффузия аспарагина, который будет гидролизироваться, увеличивается в результате повышения температуры, и это аналогично приводит к улучшению эффективности процесса согласно изобретению.

Процесс согласно изобретению позволяет получить операцию приготовления, используя амидогидролазу, сохраняя стадии процесса обычных процессов для приготовления пищевого продукта или стимулятора, то есть без любых серьезных изменений в циклах процесса. Ферментативная обработка может предпочтительно быть проведена во время стадии процесса, в которой пищевой продукт или стимулятор подвергаются, тем не менее, повышенной температуре.

В дальнейшем предпочтительном варианте осуществления, при температуре, составляющей предпочтительно от 60° до 120°С, более предпочтительно от 65° до 110°С, еще более предпочтительно от 70° до 100°С, наиболее предпочтительно от 75° до 100°С и в особенности 80-90°С, объемная активность амидогидролазы, предпочтительно аспарагиназы, составляет предпочтительно, по крайней мере 50, более предпочтительно по крайней мере 100, еще более предпочтительно по крайней мере 300, еще более предпочтительно по крайней мере 500, наиболее предпочтительно по крайней мере 800 и в особенности по крайней мере 1000 единиц/мг, причем 1 единица определяется как количество амидогидролазы, которое высвобождает 1,0 мкмоль аммиака в минуту из L-аспарагина при соответствующей температуре реакции и значении рН, составляющем 8,6 (50 мМ Трис-HCl, коррекция рН при 25°С).

В предпочтительном варианте осуществления оптимум рН амидогидролазы, предпочтительно аспарагиназы, находится в диапазоне предпочтительно от 1 до 14, более предпочтительно в диапазоне от 3 до 12, еще более предпочтительно в диапазоне от 5 до 11, наиболее предпочтительно в диапазоне от 7 до 10 и в особенности в диапазоне от 8 до 9. Термин "оптимум рН" является общеизвестным квалифицированному специалисту и касается диапазона рН, в котором у фермента есть своя максимальная ферментативная активность. В связи с этим может быть сделана ссылка на соответствующую литературу, такую как, например, Voet et al., "Biochemie", 1992, VCH-Verlag, Глава 13, страница 331. В контексте описания термин оптимум рН, как предпочтительно подразумевают, означает диапазон рН, в котором максимальная ферментативная активность амидогидролазы, используемой согласно изобретению, составляет по крайней мере 80%, предпочтительно по крайней мере 90% при иначе постоянных условиях реакции.

К удивлению было обнаружено, что могут быть предоставлены амидогидролазы, предпочтительно аспарагиназы, которые являются активными в очень широком диапазоне рН. В диапазоне рН 5 - 10 активность этих амидогидролаз, предпочтительно аспарагиназ, предпочтительно составляет по крайней мере 10% максимальной активности. В результате этого возможно применять этот фермент в различных процессах с широко отличающимися диапазонами рН. Также возможно применять его в процессах, в которых значение рН подвергается существенным колебаниям в процессе. Возможны также процессы, в которых значения рН составляют от 5 до 10. При обработке зеленых кофейных бобов с использованием воды из-под крана, например, могут встречаться очень низкие значения рН, составляющие ~5.

В предпочтительном варианте осуществления, во всем диапазоне рН, составляющем 5-10, активность амидогидролазы, предпочтительно аспарагиназы, согласно изобретению составляет по крайней мере 10%, более предпочтительно по крайней мере 15%, еще более предпочтительно по крайней мере 20%, наиболее предпочтительно по крайней мере 25% и в особенности по крайней мере 30% по сравнению с максимальной активностью, то есть с максимальной активностью с оптимальным значением рН при иначе идентичных условиях, предпочтительно при оптимальной температуре и концентрации.

Амидогидролаза, предпочтительно аспарагиназа, используемая согласно изобретению предпочтительно устойчива при хранении. В предпочтительных вариантах осуществления G₁-G₁₇ - K₁-K₁₇ остаточная активность амидогидролазы составляет по крайней мере 80%, более предпочтительно по крайней мере 85%, еще более предпочтительно по крайней мере 90% и в особенности по крайней мере 95%, при условиях, определенных в следующей таблице:

    Диапазон температуры (°С)   Период хранения G H I J K 1 5 дней 25 15 10 8 5 2 10 дней 25 15 10 8 5 3 15 дней 25 15 10 8 5 4 20 дней 25 15 10 8 5 5 25 дней 25 15 10 8 5 6 30 дней 25 15 10 8 5 7 60 дней 25 15 10 8 5 8 90 дней 25 15 10 8 5 9 120 дней 25 15 10 8 5 10 150 дней 25 15 10 8 5 11 180 дней 25 15 10 8 5 12 210 дней 25 15 10 8 5 13 240 дней 25 15 10 8 5 14 270 дней 25 15 10 8 5 15 300 дней 25 15 10 8 5 16 330 дней 25 15 10 8 5 17 360 дней 25 15 10 8 5

В вышеупомянутой таблице вариант осуществления Is, например, означает, что после хранения в течение 25 дней при 10°С, остаточная активность амидогидролазы составляет по крайней мере 80%, более предпочтительно по крайней мере 85%, еще более предпочтительно по крайней мере 90% и в особенности по крайней мере 95%. В особенно предпочтительном варианте осуществления, в случае хранения при 4°С в течение 30 дней, остаточная активность амидогидролазы, используемой согласно изобретению, составляет по крайней мере 80%.

Группа амидогидролаз включает, среди прочего, семейство ферментов аспарагиназ (ЕС 3.5.1.1), которые катализируют гидролиз аспарагина до аспартата и аммиака. В предпочтительном варианте осуществления амидогидролаза, используемая согласно изобретению, представляет собой аспарагиназу.

Общеизвестно, что аспарагиназы могут преобразовать и аспарагин (L и D форму) и глутамин (L и D форму).

Ввиду этой разнородности субстратов аспарагиназ, аспарагиназа, используемая согласно изобретения, гидролизует L-аспарагин предпочтительно быстрее, чем L-глутамин и/или возможно быстрее чем D-аспарагин.

Соотношение значений K_M (соответственно в мМ) L-аспарагина к L-глутамину предпочтительно находится в диапазоне от 1:10 до 1:400, более предпочтительно в диапазоне от 1:20 до 1:200, еще более предпочтительно в диапазоне от 1:30 до 1:100, наиболее предпочтительно в диапазоне от 1:40 до 1:80.

В предпочтительном варианте осуществления аспарагиназа, используемая согласно изобретению, предпочитает L-аспарагин L-глутамину и/или D-аспарагину. Соотношение значений Км (соответственно в мМ) L-аспарагина к L-глутамину предпочтительно находится в диапазоне от 1:1 до 1:400, более предпочтительно в диапазоне от 1:5 до 1:100, еще более предпочтительно в диапазоне от 1:10 до 1:50.

Амидогидролазы или аспарагиназы могут быть неустойчивыми или устойчивыми к высокой температуре. Устойчивые к высокой температуре аспарагиназы уже известны из предшествующего уровня техники (см., например, Li et al., Anal. Chem. 2002, 74, ст.3336-3341, США 5719056 или Agathi et al, Mol. Cell. Biochem. 2001, 216, ст.93-101). Однако, показания для их применения в процессах для приготовления продуктов питания или стимуляторов не очевидны из этих публикаций.

В контексте описания термины "устойчивая к высокой температуре амидогидролаза" или "устойчивая к высокой температуре аспарагиназа", как должны предпочтительно подразумевать, означают амидогидролазу или аспарагиназу, остаточная активность которой после инкубации продолжительностью 5 минут при 50°С составляет по крайней мере 75%.

Аспарагиназа предпочтительно представляет собой аспарагиназу, выбранную из Archeoglobus sp.(например, Archeoglobus fulgidus}, Thermus sp. (например, Thermus therophilus), Pyrococcus sp. (например, Pyrococcus abyssi), Thermococcus sp. (например, Thermococcus kodakarensis}, Methanothermobacter sp. (например, Methanothermobacter thermautrophicus), или аспарагиназу, выбранную из Euryarchaeota или аспарагиназу I из Pyrococcus furiosus.

В предпочтительном варианте осуществления аспарагиназа кодируется нуклеотидной последовательностью, которая предпочтительно имеет по крайней мере 60%, более предпочтительно по крайней мере 80%, еще более предпочтительно по крайней мере 90%, еще более предпочтительно по крайней мере 95%, наиболее предпочтительно по крайней мере 99% и в особенности по крайней мере 99,9% гомологии с нуклеотидной последовательностью <SEQ ID NO:1>. В этом случае, гомология предпочтительно определяется посредством алгоритма согласно Smith & Waterman (J. Mol. Biol., 1981, 147(1), 195-7) с применением матрицы BLOSUM62 и значений 11.0 для открытия промежутка или 1.0 для расширения промежутка.

Предпочтительно в особенности, что аспарагиназа, используемая согласно изобретению, кодируется нуклеотидной последовательностью <SEQ ID NO:1>.

В предпочтительном варианте осуществления аминокислотная последовательность аспарагиназы имеет по крайней мере 50%, более предпочтительно по крайней мере 75%, еще более предпочтительно по крайней мере 80%, еще более предпочтительно по крайней мере 90%, еще более предпочтительно по крайней мере 95%, наиболее предпочтительно по крайней мере 99% и в особенности по крайней мере 99,9% гомологии (идентичности последовательности) с аминокислотной последовательностью <SEQ ID NO:2>. В этом случае, гомология предпочтительно определяется посредством алгоритма согласно Smith & Waterman (J. Mol. Biol., 1981, 147(1), 195-7) с использованием матрицы BLOSUM62 и значений 11.0 для открытия промежутка или 1.0 для расширения промежутка.

В другом особенно предпочтительном варианте осуществления аспарагиназа, используемая согласно изобретению, включает аминокислотную последовательность <SEQ ID NO:2>.

Как уже изложено выше, процессы приготовления для пищевых продуктов или стимуляторов, предпочтительно содержащих углеводы, часто имеют стадии предобработки для снижения содержания акриламида в этих пищевых продуктов или стимуляторах. Поэтому предпочтительно, чтобы применение амидогидролазы согласно изобретению служит для приготовления, в особенности как часть операции предобработки, для гидролиза аспарагина до аспарагиновой кислоты.

В контексте описания термин "пищевые продукты, содержащие углеводы", как предпочтительно подразумевают, означает пищевые продукты, имеющее содержание углеводов, составляющее предпочтительно по крайней мере 0,1% по весу, более предпочтительного по крайней мере 1% по весу, еще более предпочтительно по крайней мере 5% по весу, еще более предпочтительно по крайней мере 10% по весу, наиболее предпочтительно по крайней мере 20% по весу и, в особенности, по крайней мере 30% по весу относительно общей массы пищевого продукта.

Дополнительно предпочтительно, чтобы применение амидогидролазы согласно изобретению служило для приготовления, в особенности как часть операции предобработки, для снижения содержания аспарагина и/или акриламида в пищевых продуктах или стимуляторе.

В результате такого применения амидогидролазы согласно изобретению предпочтительно происходит снижение содержания аспарагина таким образом, чтобы пищевые продукты или стимуляторы имели сниженное содержание акриламида во время тепловой послеобработки.

В контексте описания термин "тепловая послеобработка", как предпочтительно подразумевают, означает процессы, которые сопровождаются нагреванием пищевых продуктов или стимулятора. Обычные тепловые послеобработки включают нагревание, сухую жарку, жарку на гриле, кипячение, готовку, выпекание, пропаривание, глубокую жарку и т.п..

Особенно предпочтительно, если амидогидролаза, используемая согласно изобретению, подходит для применения в процессах приготовления для пищевых продуктов, содержащих углеводы, таких как, например, рис, хлеб и выпечка, закуски, готовые смеси, сухофрукты, корм для животных и т.д. или стимуляторов, таких как кофе или какао. Такие пищевые продукты и/или стимуляторы предпочтительно выбираются из группы, включающей хрустящие хлебцы, сухари, булочки, крендели с солью, белый хлеб для тостов, вафли, сдобы, рогалики, круассаны, шоколадные пирожные, сухие завтраки, бисквиты, картофельные чипсы, чипсы тортилья, кукурузные чипсы, крекеры, орехи, чипсы, рисовые лепешки, поленту, кускус, блины, готовые смеси, смеси для тортов, смеси для булочек, смеси для хлеба, гренки, пищу для собак, пищу для кошек, кофейные бобы, бобы какао.

Особенно предпочтительны кофейные бобы. Предпочтительные типы кофейного боба включают Coffea arabica, Coffea canephora, Coffea liberica и Coffea robusta.

В особенно предпочтительном варианте осуществления приготовление стимулятора включает декафеинизацию и/или промывку кофейных бобов, в которых используется амидогидролаза согласно изобретению.

В аналогично особенно предпочтительном варианте осуществления приготовление стимулятора включает гидролиз кофейных бобов в комбинации с применением амидогидролазы, предпочтительно аспарагиназы, согласно изобретению. Кофейные бобы подвергаются паровой обработке в течение подготовки процесса декафеинизации или для повышения вкуса. В этом случае бобы сильно нагреваются и контактируют с водой. Применение термоактивной амидогидролазы, как оказалось, было особенно выгодно здесь для снижения концентрации аспарагина в зеленом кофейном бобе. Применение фермента при температурах выше 70°С позволяет полную совместимость с установленными процессами и, кроме того, позволяет получить очень высокие скорости реакции, которые очень уменьшают время процесса.

Применение амидогидролазы, предпочтительно аспарагиназы, согласно изобретению, имеющей вышеописанные свойства, приводит к многочисленным удивительным преимуществам, которые обрисованы в общих чертах ниже на основе четырех иллюстративных примеров. Квалифицированный специалист знает, что такие примеры не следует рассматривать в любом случае ограничивающими, так как амидогидролаза согласно изобретению подходит для применения во множестве процессов приготовления для пищевых продуктов или стимуляторов.

Таким образом, при приготовлении картофельных чипсов, картофель обычно предварительно обрабатывают аспарагиназой перед приготовлением на пару, то есть картофель разрезают на части, и аспарагиназа может или быть распылена на них или картофельные части опускают в раствор, содержащий аспарагиназу. Продолжительность такой обычной обработки аспарагиназой может быть существенной в некоторых случаях (до нескольких часов), поскольку из-за температурного оптимума фермента (обычно 37°С, см., например, США 7 037 540, Пример 5), температура обработки должна составлять максимум 37°С, и расщепление аспарагипа является соответственно медленным.

В результате свойств устойчивости к высокой температуры амидогидролазы, используемой согласно изобретению, картофельные части подвергаются обработке аспарагиназой при более высоких температурах, то есть снижение уровня аспарагина происходит быстрее, среди прочего потому что растворимость аспарагина увеличивается при более высоких температурах. В некоторых случаях, на основании свойств устойчивости к высокой температуры фермента, обработка аспарагиназой может даже происходить одновременно, в то время как картофель готовится на пару. В этом случае, аспарагиназа может быть распылена на картофельные части, например, заранее.

Дезактивация амидогидролазы проводится обычным способом посредством тепловой послеобработки, то есть жарки картофельных частей во фритюре. Поэтому, нет никаких проблем для здоровья относительно применения этих устойчивых к высокой температурой амидогидролаз.

Дальнейший пример касается декафеинизации кофейных бобов. В этом процессе приготовления нежареные зеленые кофейные бобы подвергаются паровой обработке и/или погружаются в частично горячую воду для извлечения кофеина из бобов. С помощью амидогидролазы, используемой согласно изобретению, возможно объединить такие стадии декафеинизации, которые обычно проводят при температурах выше 37°С, с одновременной обработкой аспарагиназой, то есть процесс приготовления для кофе без кофеина также занимает меньше времени и поэтому менее дорогой. Обычные процессы для декафеинизация кофейных бобов известны квалифицированному специалисту и включают, среди других, "швейцарский водный процесс", "прямой метод", "косвенный метод" или "триглицеридный процесс". Ссылка может быть сделана на R. Heiss, Lebensmitteltechnologie: Biotechnologische, chemische, mechanische und thermische Verfahren der Lebensmittelverarbeitung [Пищевая технология: биотехнологические, химические, механические и тепловые процессы для обработки пищи], Springer, 6-ой выпуск, 2003, например, полностью в этом контексте.

К удивлению, амидогидролаза согласно изобретению может также применяться особенно полезно при обработке кофейных бобов пропариванием/смачиванием. Как уже изложено выше, такая обработка пропариванием/смачиванием служит для открывания пор кофейных бобов таким образом, чтобы аспарагин, присутствующий в бобах, мог быть впоследствии инактивирован/снижен более легко. Обработка пропариванием/смачиванием обычно происходит при повышенных температурах, то есть при температурах предпочтительно максимум до 100°С, так как растворимость аспарагина увеличивается в теплом растворителе, и также поры кофейных бобов открываются быстрее при повышенных температурах. При помощи устойчивой к высокой температуре амидогидролазы согласно изобретению снижение аспарагина может произойти одновременно во время обработки пропариванием /смачиванием, и в то же самое время снижение уровня аспарагина может происходить быстрее и эффективнее из-за высокой температурной переносимости фермента.

Амидогидролаза согласно изобретению может также применяться в производстве свежевыпеченных продуктов, таких как хлеб, рогаликов или подобного. Эти свежевыпеченные продукты часто производятся с применением процессов выпечки/экструзии, которые обычно проводят при температурах от 95° до 105°С. Из-за свойств устойчивости к высокой температуре амидогидролазы согласно изобретению фермент можно добавлять во время выпечки/экструзии и таким образом произвести снижение содержания аспарагина. То, что является важным для снижения аспарагина в случае выпечки/экструзии, так это замешивание теста, а также образование газовых пузырей, которые образуются при выходе углекислого газа из горячей воды. Амидогидролаза согласно изобретению инактивируется или денатурируется в результате последующего процесса жарки или обжарки, который обычно происходит в диапазоне температур от 200° до 600°С.

Много стадий для обработки пищевых продуктов и стимуляторов вовлекают операции инкубации в водной среде при высоких температурах от 70° до 110°С, и они предшествуют тепловой послеобработке, которая приводит к образованию акриламида. Они включают стадии готовки, например. Обработки водой в вышеупомянутом диапазоне температуры используются, например, в производстве сформированных чипсов или сформированных картофельных чипсов. Неожиданное преимущество аспарагиназы согласно изобретению состоит в том, что фермент может применяться непосредственно в этих процессах и достигает очень высоких скоростей реакции при высоких температурах, таким образом позволяя получить очень высокие скорости активности с очень маленькими количествами фермента.

Амидогидролаза может также полезно применяться в процессы обработки хлебных злаков. В производстве корнфлекса зерна готовят в смеси с сахаром, солью и солодом и затем далее обрабатывают и обжаривают. Обжаривание вызывает нежелательное образование акриламида. Во время приготовления достигаются температуры от 70° до 100°С, которые очень хорошо подходят для применения амидогидролазы согласно изобретению, чтобы позволить подавить образование акриламида.

Процессы экструзии очень часто вовлекаются в обработку зерна. Например, процессы экструзии проводятся при конечной температуре, составляющей 80-100°С, в производстве сухих завтраков. Также описаны процессы, которые включают процессы выдержки при высоких температурах, составляющих от 70° до 100°С.

Продукты, которые обработаны при высоких температурах и содержат рожь, вообще, имеют очень высокое содержание акриламида (например, хрустящие хлебцы). Высокие температуры достигаются очень быстро в процессе выпечки для производства хрустящих хлебцев. Хрустящие хлебцы можно обрабатывать раствором амидогидролазы согласно изобретению до процесса выпечки, чтобы уменьшить образование акриламида во время процесса выпечки.

Дальнейшее неожиданное преимущество устойчивой к высокой температуре амидогидролазы, используемой согласно изобретению, состоит в возможности повторного применения (рециркуляции) фермента. Таким образом, амидогидролаза, которая не денатурирует даже при подвышенных температурах, то есть до предпочтительно 100°С, из-за своих свойств устойчивости к высокой температуры может быть извлечена после применения или отделена с помощью другого метода и, таким образом, использована для нового применения. Такой рециркулированный раствор амидогидролазы может применяться во многих, то есть, предпочтительно по крайней мере 1, 2, 3, 4 или 5, циклах для снижения уровня аспарагина.

Применение амидогидролазы, используемой согласно изобретению, предпочтительно считают безопасным относительно здоровья, так как эти амидогидролазы - природные нетоксичные вещества.

Дальнейший аспект настоящего изобретения касается процесса для приготовления пищевого продукта или стимулятора, включающего стадии:

(i) инкубирование пищевых продуктов или стимулятора с амидогидролазой, определенной выше при температуре инкубации, составляющей предпочтительно по крайней мере 50°С, более предпочтительно по крайней мере 60°С, еще более предпочтительно по крайней мере 70°С, еще более предпочтительно по крайней мере 80°С, наиболее предпочтительно по крайней мере 90°С и в особенности по крайней мере 99°С; и

(iii) в случае необходимости, нагрев пищевых продуктов или стимулятора до температуры, лежащей предпочтительно по крайней мере на 10°С, более предпочтительно по крайней мере 15°С, еще более предпочтительно по крайней мере 20°С, наиболее предпочтительно по крайней мере 50°С и в особенности по крайней мере 60°С выше температуры инкубации.

В предпочтительном варианте осуществления, процессе для приготовления пищевых продуктов или стимулятора согласно изобретению включает стадии:

(i) инкубирование пищевых продуктов или стимулятора с амидогидролазой, определенной выше при температуре инкубации, составляющей предпочтительно по крайней мере 50°С, более предпочтительно по крайней мере 60°С, еще более предпочтительно по крайней мере 70°С, еще более предпочтительно по крайней мере 80°С, наиболее предпочтительно по крайней мере 90°С и в особенности по крайней мере 99°С;

(ii) выделение амидогидролазы из пищевых продуктов или стимулятора или инактивация амидогидролазы;

(iii) в случае необходимости, нагрев пищевых продуктов или стимулятора до температуры, лежащей предпочтительно по крайней мере на 10°С, более предпочтительно по крайней мере 15°С, еще более предпочтительно по крайней мере 20°С, наиболее предпочтительно по крайней мере 50°С и в особенности по крайней мере 60°С выше температуры инкубации; и

(iv) в случае необходимости, повторное применение амидогидролазы, выделенной в стадии (ii), в стадии (i).

Стадия (i) процесса согласно изобретению предпочтительно проводится при таких условиях (время, температура, значение рН, количество амидогидролазы и т.д.), что количество (свободного) аспарагина, первоначально содержащегося в пищевых продуктах или стимуляторе, уменьшается по крайней мере на 50%, более предпочтительно по крайней мере на 75%, еще более предпочтительно по крайней мере на 80%, еще более предпочтительно по крайней мере 85%, наиболее предпочтительно по крайней мере 90% и в особенности по крайней мере 95%. Специалист, квалифицированный в данной области, может определить подходящие условия с помощью обычного рутинного тестирования.

Стадия (ii) процесса согласно изобретению предпочтительно проводится при таких условиях (время, температура, значение рН, количество амидогидролазы и т.д.), что количество акриламида, образовавшееся в возможной последующей тепловой послеобработке, уменьшается по крайней мере на 20%, предпочтительно на 30%, еще более предпочтительно по крайней мере на 40% и наиболее предпочтительно по крайней мере на 50%.

В предпочтительном варианте осуществления стадия (i) процесса согласно изобретению предпочтительно проводится при таких условиях (время, температура, значение рН, количество амидогидролазы и т.д.), что после проведения стадии (iii) количество акриламида, содержащегося в пищевых продуктах или стимуляторе, составляет не более чем 200 м.д., более предпочтительно не более чем 150 м.д., еще более предпочтительно не более чем 135 м.д., наиболее предпочтительно не более чем 100 м.д. и в особенности не более чем 50 м.д. Специалист, квалифицированный в данной области, может определить подходящие условия с помощью обычного рутинного тестирования.

В аналогично предпочтительном варианте осуществления стадия (i) процесса согласно изобретению предпочтительно проводится при таких условиях (время, температура, значение рН, количество амидогидролазы и т.д.), что после проведения стадии (iii) количество акриламида, содержащегося в пищевых продуктах или стимуляторе, составляет не более чем 1000 мкг/кг, более предпочтительно не более чем 500 мкг/кг, еще более предпочтительно не более чем 300 мкг/кг, наиболее предпочтительно не более чем 150 мкг/кг и в особенности не более чем 50 мкг/кг.

Специалист, квалифицированный в данной области, может определить подходящие условия с помощью обычного рутинного тестирования.

В предпочтительном варианте осуществления стадия (i) проводится в течение по крайней мере 240 минут, более предпочтительно по крайней мере 120 минут, еще более предпочтительно по крайней мере 60 минут, наиболее предпочтительно по крайней мере 20 минут и в особенности по крайней мере 5 мин.

В предпочтительном варианте осуществления соотношение веса пищевых продуктов или стимулятора к амидогидролазе находится в диапазоне 10²:1-10¹⁰:1, более предпочтительно 10²:1-10⁸:1, еще более предпочтительно 10⁴:1-10⁸:1, наиболее предпочтительно 10⁴:1-10⁷:1 и в особенности 10⁵:1-10⁷:1.

В предпочтительном варианте осуществления амидогидролаза готовится в водном растворе и объединяется с пищевыми продуктами или стимулятором, например, путем распыления. В этом случае, концентрация амидогидролазы в водном растворе предпочтительно составляет 10^-6 на 100 г/л, более предпочтительно 10^-5 на 10 г/л, еще более предпочтительно 10^-4 на 1 г/л, наиболее предпочтительно 10^-3 на 10^-1 г/л и в особенности 10^-2 на 5×10^-2 г/л.

Дальнейший аспект изобретения касается пищевого продукта или стимулятора, который доступен вышеописанным процессом. Остаточное содержание аспарагина и/или акриламида в пищевом продукте или стимуляторе предпочтительно составляет не более чем 200 м.д., более предпочтительно не более чем 150 м.д., еще более предпочтительно не более чем 135 м.д., наиболее предпочтительно не более чем 100 м.д. и в особенности не более чем 50 м.д.

Дальнейший аспект изобретения касается пищевого продукта или стимулятора, который доступен вышеописанным процессом. Остаточное содержание аспарагина и/или акриламида в пищевом продукте или стимуляторе предпочтительно составляет не более чем 400 мкг/кг, более предпочтительно не более чем 300 мкг/кг, еще более предпочтительно не более чем 200 мкг/кг, наиболее предпочтительно не более чем 100 мкг/кг и в особенности не более чем 50 мкг/кг.

Дальнейший аспект изобретения касается вектора, который содержит нуклеотидную последовательность как определено выше. Такой вектор предпочтительно выбирается из группы, включающей плазмиды, космиды, фагемиды, фаг-векторы, бактериальные искусственные хромосомы и дрожжевые искусственные хромосомы.

Дальнейший аспект изобретения - процесс для производства амидогидролазы, определенной выше, включающий следующие стадии:

a) введение вектора, определенного выше, в систему экспрессии;

b) в случае необходимости, экспрессия амидогидролазы в системе экспрессии;

c) в случае необходимости, расщепление или лизис или выделение системы экспрессии;

d) в случае необходимости, добавление подходящей, возможно устойчивой к высокой температуре, нуклеазы, для гидролиза нуклеиновой кислоты системы экспрессии;

e) в случае необходимости, денатурация системы экспрессии посредством процесса инкубации предпочтительно при 60°С, более предпочтительно при 70°С, еще более предпочтительно при 80°С, наиболее предпочтительно при 90°С и в особенности при 100°С, в течение периода, составляющего предпочтительно 1 минуту, более предпочтительно 5 минут, еще более предпочтительно 10 минут, наиболее предпочтительно 20 минут и в особенности 60 минут;

f) в случае необходимости, отделение нежелательных компонентов системы экспрессии путем центрифугирования, фильтрации, микрофильтрации или ультрафильтрации;

g) в случае необходимости, связывание амидогидролазы с твердой основой, причем связывание происходит с помощью ионных, гидрофобных взаимодействий или взаимодействий, определенных аффинным тагом;

h) в случае необходимости, промывка основы для удаления нежелательных компонентов при условиях, в которых амидогидролаза остается существенным образом связанной с основой;

i) в случае необходимости, элюирование амидогидролазы из основы подходящими буферными условиями;

j).

k) в случае необходимости, концентрация раствора амидогидролазы осаждением, ультрафильтрацией, сушкой сублимацией или сушкой; и

l) в случае необходимости, перенос амидогидролазы в подходящий буфер хранения.

Природные аспарагиназы могут локализироваться во внутриклеточном и внеклеточном местоположениях. Если аспарагиназы должны сверхэкспрессироваться в большом количестве во внутриклеточном местоположении, необходимо преодолеть проблему, состоящую в том, что высокие концентрации аспарагиназы проявляют токсический эффект в клетке, так как они гидролизируют аминокислоту аспарагин, которая является незаменимой для клетки. К удивлению было обнаружено, что амидогидролаза согласно изобретению обладает только очень низкой остаточной активностью в диапазоне температур от 20-37°С, в котором обычно проводятся процессы ферментации мезофильных организмов, таких как, например, Escherichia coli, Pseudomonas sp., Bacillus sp., Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae или Aspergillus sp.. Таким образом, при 25°С остаточная активность фермента составляет <2%. Это позволяет внутриклеточную экспрессию аспарагиназы согласно изобретению в мезофильных хозяевах экспрессии в больших количествах.

Дальнейший аспект изобретения включает процесс для производства амидогидролазы, определенной выше, в котором амидогидролаза экспрессируется внутриклеточно в микроорганизме, причем при температуре культивирования во время экспрессии амидогидролазы остаточная активность фермента составляет <30%, предпочтительно <15%, еще более предпочтительно <10%, еще более предпочтительно <5%, наиболее предпочтительно <2%.

Протоколы ферментации для микроорганизмов, доступные квалифицированному специалисту, позволяют получить выходы влажной биомассы предпочтительно >100 г/л, более предпочтительно >125 г/л, еще более предпочтительно >150 г/л, еще более предпочтительно >175 г/л и наиболее предпочтительно >200 г/л.

В предпочтительном варианте осуществления, в случае внутриклеточной экспрессии амидогидролазы в микроорганизме, достигается выход активности >10 кЕ/г влажной биомассы, более предпочтительно >20 кЕ/г влажной биомассы, более предпочтительно >40 кЕ/г влажной биомассы, более предпочтительно >60 кЕ/г влажной биомассы, наиболее предпочтительно >80 кЕ/г влажной биомассы.

В предпочтительном варианте осуществления, в случае внутриклеточной экспрессии амидогидролазы в микроорганизме, достигается выход активности >100000 единиц на литр питательной среды, более предпочтительно >500000 единиц на литр, более предпочтительно >1 миллион единиц на литр, более предпочтительно >3 миллионов единиц на литр, более предпочтительно >6 миллионов единиц на литр и наиболее предпочтительно >10 миллионов единиц на литр.

В предпочтительном варианте осуществления [амидогидролаза] согласно изобретению экспрессируется внутриклеточно в мезофильном хозяине экспрессии, таком как, например, Escherichia coli, Pseudomonas sp., Bacillus sp., Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae или Aspergillus sp.

Следующие примеры служат для более подробного объяснения изобретения, но не должны интерпретироваться как ограничительные.

Примеры

Пример 1 - Экспрессия устойчивой к высокой температуре аспарагиназы

Ген, кодирующий аспарагиназу I из Pyrococcus furiosus (<SEQ ID NO:1>), амплифицировали с помощью двух праймеров PF_AsnI_S (5'-ACCTGCGGTCTCGCATGAAAA TTC TTC TAATTGGGATGGG-3'; <SEQ ID NO:3>) и PF_AsnI_A (5'-GGATCCCTGCA GTT AATCTCTAAGCTCTCCAACTAG-3'; <SEQ ID NO:4>) (оба Thermo Electron, Ульм) посредством ПЦР из Pyrococcus furiosus DSM 3638-ДНК при следующих условиях.

1.1. Условия ПЦР:

Партия ПЦР:

10 мкл 10х буфер VENT (NEB, Beverly, США) 2 мкл dNTPs (no 10 мМ) 100 пкмоль Праймер PF_AsnI_S <SEQ ID NO:3> 100 пкмоль Праймер PF_AsnI_A <SEQ ID NO:4> 1 мкл ДНК из Pyrococcus furiosus DSM 3638 2 Е Полимераза VENT (NEB) до 100 мкл дист. Н₂О

Температурный профиль ПЦР:

2 минуты/94°С

1. 45 секунд/94°С (денатурация)

2. 45 секунд/57°С (приложение) 25 х

3. 60 секунд/72°С (элонгация)

2 минуты/72°С

Получающийся продукт ПЦР был очищен с использованием QIAquick ПЦР набор для очистки (Qiagen, Hilden), соблюдая инструкции производителя.

1.2. Расщепление рестрикции:

Ген, полученный согласно пункту 1.1, был клонирован в вектор экспрессии pRSF-1b <SEQ ID NO:5> (Вектор pRSF-1b, Novagen-Merck-Biosciences, Bad Soden).

Для этого продукт ПЦР был расщеплен с использованием эндонуклеаз рестрикции Eco31I и PstI и вектора pRSF-1b <SEQ ID NO:5> с использованием эндонуклеаз рестрикции NcoI и PstI (все Fermentas, Вильнюс, Литва), как описано в общем ниже:

1.3. Партии расщепления рестрикции:

Продукт ПЦР Вектор 2 мкг продукт ПЦР 4 мкг pRSF-1b <SEQ ID NO:5> 3 мкл 10 х буфер G⁺ (Fermentas) 4 мкл 10 х буфер Y+(Fermentas) 10 E Eco31I 10 Е NcoI 20 Е PstI 20 Е PstI до 30 мкл дист. Н₂О до 40 мкл дист. Н₂О

Партии расщепления рестрикции инкубировались в течение 2 часов при 37°С. 1 Е SAP (Креветочная Щелочная Фосфатаза, Fermentas, Вильнюс, Литва) затем добавили в "векторную партию" для дефосфорилирования и инкубировали в течение дальнейших 30 минут при 37°С. Затем ферменты инактивировали в течение 20 минут при 80°С. Затем продукты очистили с использованием QIAquick ПЦР набора для очистки (Qiagen, Hilden).

1.4. Лигация, трансформация в Е. coli и повторная изоляция плазмиды

Векторная ДНК и продукт ПЦР (см. пункт 1.3) были объединены путем инкубации с Т4 ДНК лигазой, как описано ниже:

Партия лигазы:

200 фмоль pRSF-1b <SEQ ID NO:5> 600 фмоль Продукт ПЦР 3 мкл 10x лигазный буфер (Fermentas) 1 мкл ДНК Т4 лигаза до 30 мкл дист. Н₂О

Партии инкубировали в течение 8 ч при 16°С, и затем фермент инактивировали инкубацией в течение 10 минут при 65°С. 1 мкл этой партии применялся непосредственно для трансформации коммерчески доступных компетентных Синих клеток XL1 (Stratagene, La Jolla, США) посредством электропорации. Электропорированные клетки поместили на твердые агаровые планшеты с канамицином и культивировали в течение ночи при 37°С. Работая из полученной единственной колонии, законченная плазмида была повторно изолирована с помощью набора для очистки плазмид, набора минипрепарата QIAprep (Qiagen, Hilden), соблюдая инструкции производителей, и была получена плазмида экспрессии pRSF_Pf-AsnI <SEQ ID NO:6>.

Плазмида экспрессии pRSF_Pf-AsnI <SEQ ID NO:6> была включена в клетки посредством электропорации в Rosetta 2 (DE3) (Novagen-Merck-Biosciences, Bad Soden), и клетки поместили на агаровые планшеты LB (10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, до 1 л дист. воды) с канамицином (Kan) и хлорамфениколом (Cam).

Из этих планшетов были выбраны отдельные клоны, и предварительные культуры были впервые произведены для экспрессии. Для этого, 100 мл LB (Kan, Cam) среды инокулировали с 1% (м/об) глюкозой с 1 мл 5 мл предкультуры и встряхивали при 37°С и 200 оборотов в минуту, пока не было получено OD₆₀₀ 0,6. Клетки центрифугировали (4°С, 15 минут, 32004g) и супернатант отбросили. Пеллету повторно суспендировали в 2 мл 10% (об/об) глицерина. Из суспензии отобрали аликвоты по 200 мкл, заморозили в жидком азоте и хранили при -80°С.

Главная культура для экспрессии состояла из 500 мл LB (Кап, Cam) среды с 1% (м/об) глюкозы. Ее инокулировали с аликвотой предкультуры. Главную культуру инкубировали при 37°С и 200 оборотов в минуту. После того, как было получено OD₆₀₀ 0.9, ее индуцировали с 1 мМ IPTG (изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом) и встряхивали в течение ночи при 30°С и 200 оборотов в минуту. На следующий день клетки седиментировали путем центрифугирования (4°С, 15 минут, 3200xg) и после удаления среды пеллету взвесили и повторно суспендировали с 20 мл буфера для лизиса (10 мМ трис/HCl рН 8,0, 0,5 мг/мл лизозима) и обработали ультразвуком (5х30 s, 80% силы). Суспензию разрушенных клеток центрифугировали (4°С, 30 мин, 14000xg). Затем супернатант подвергли инкубации в течение 30 минут при 80°С и снова подвергали центрифугированию (4°С, 30 мин, 14000xg). Пеллету отбросили, и таким образом полученный сырой экстракт извлекли и хранили при 4°С для дальнейших исследований. Выход активности был определен при 160 кЕ из супернатанта (см., Пример 2). Был определен выход в 40 кЕ на г влажной биомассы из массы клеточной пеллеты, равной 4 г.

Пример 2 - Определение температурного профиля

Принцип количественного определения

Аспарагиназы катализируют преобразование аспарагина в аспартат с высвобождением ионов аммония. Это можно показать с использованием цветных реактивов, таких как, например, реактив Несслера. Альтернативно, ионы аммония могут также быть обнаружены посредством реакции Berthelot (DIN 38 406 E5). Количественное определение с использованием реактива Несслера основано на определении конечной точки. В этом случае, реакцию инкубируют в течение 30 минут при соответствующей температуре, останавливают, и обнаруживают образовавшиеся ионы аммония.

Реактивы и растворы

Реактивы:

L-аспарагина моногидрат: Applichem A3669, МВТ 150,14 г/моль

Сульфат аммония: Merck, 1.101211, МВТ 132,14 г/моль

Реактив Несслера: Fluka, 72190

Трис, ТСА

Исходные растворы и буферные растворы:

50 мМ Трис/HCl рН 8,6

172 мМ раствор L-аспарагина

1,5 М ТСА (трихлоруксусная кислота)

Калибровочные растворы:

5 мМ раствор (NH₄)₂SO₄

2.1. Подготовка кривой калибровки

Для этого были сделаны следующие партии:

по 50 мкл 50 мМ трис/HCl рН 8.6 0 мкл 5 мкл 10 мкл 20 мкл 30 мкл 40 мкл 5 мМ (NH₄)₂SO₄ 45 мкл 40 мкл 35 мкл 25 мкл 15 мкл 5 мкл дист. H₂O

Партии смешивают, добавляют по 5 мкл М ТСА, и смесь смешивают еще раз.

Для каждого значения предоставили по 860 мкл дист. H₂O в 1,5 мл сосуде для реакции и добавили 40 мкл соответствующей партии и затем смешали. По 100 мкл реактива Несслера добавили к каждой партии в одной операции, и образцы смешивали в течение короткого времени. Через 5 минут фотометр сбалансировали с помощью воды при 436 нм и образцы измерили в одной операции. Значения были зарегистрированы в линию калибровки (см. Фигуру 1).

2.2. Определение образца

Используя коммерческий тест для обнаружения белка (Bradfort, Bio-Rad Laboratories GmbH, Мюнхен), была определена концентрация белка сырого экстракта из примера варианта осуществления 1 приблизительно при 4 мг/мл. Раствор аспарагиназы развели в соотношении 1:2000 в 50 мМ трис/HCl рН 8,6. Для каждого образца, который подвергался определению, была представлена следующая партия:

50 мкл 50 мМ трис/HCl рН 8,6 35 мкл дист. Н₂О 5 мкл 172 мМ раствор L-Asn

Партии были смешаны, и устройство для термоциклирования предварительно нагрели до желательной температуры (37, 70, 80, 90 и 99°С).

5 мкл разведенного образца фермента добавили к партиям, и 5 мкл буфера добавили для регистрации контроля, партии смешивали в течение короткого времени и затем инкубировали в течение 30 минут при соответствующей температуре реакции. Затем реакции охладили на льду и остановили путем добавления 5 мкл 1,5 М раствора ТСА.

После этого были немедленно определены высвобожденные ионы аммония. Для каждого значения предоставили по 860 мкл дист. Н₂О в 1,5 мл сосуде для реакции и добавили 40 мкл соответствующей партии и затем смешали. По 100 мкл реактива Несслера добавили к каждой партии в одной операции, и образцы смешивали в течение короткого времени. Через 5 минут фотометр сбалансировали с помощью воды при 436 нм и образцы измерили в одной операции.

Во-первых, определенное значение поглощения было преобразовано в высвобожденные ионы аммония на основе кривой калибровки (см. Фигуру 1). Объемная активность [Е/мин] фермента была определена путем определения единицы (одна единица аспарагиназы высвобождает 1 мкмоль NH4 в минуту при условиях определения). Такие вычисления являются общеизвестными для специалиста, квалифицированного в данной области.

2.3. Определение температурного оптимума

Содержание NH4 было определено при длине волны, составляющей 436 нм, для различных температур, и определены полученные объемные (ферментативные) активности. Объемная активность при 90°С была установлена на 100% (=референтное значение), и соответствующие объемные активности при других температурах были соответственно связаны с этим референтным значением (=относительная активность).

Соответствующие значения сопоставлены в следующей таблице и показаны графически на Фигуре 2:

Темп. Определенное значение 436 нм Единицы на мл Относительная активность 37°С 0.018 320 9% 70°С 0.126 2140 58% 80°С 0.205 3460 94% 90°С 0.218 3670 100% 99°С 0.2 3370 92%

Пример 3 - Определение температурной стабильности

Реактивы и растворы, определение кривой калибровки, а также тесты на активность проводились, как описано выше, в примере варианта осуществления 2.

3.1. Температурная стабильность при 95°С

Определение объемной (ферментативной) активности всегда в этом случае проводилось при температуре инкубации 90°С.Для определения температурной стабильности раствор аспарагиназы из примера варианта осуществления 1 был разведен в соотношении 1:10 в 50 мМ трис/HCl рН 8,6 и затем предварительно инкубирован при 95°С в течение различных промежутков времени (0, 1,15, 30, 45 и 60 мин). Затем проводилось дальнейшее разведение в соотношении 1:100 в 50 мМ трис/HCl рН 8,6 и определена остающаяся остаточная активность. Объемная ферментативная активность без прединкубации при 95°С была установлена на 100% (=референтное значение), и все другие значения были связаны с этим референтным значением (=относительная активность). Таким образом полученные/вычисленные значения сопоставлены в следующей таблице (см. также Фигуру 3):

Время в мин Определенное значение 436 нм Единицы на мл Относительная активность 0 0.398 3340 100% 1 0.466 3900 117%* 15 0.403 3380 101%* 30 0.464 3890 116%* 45 0.464 3890 116%* 60 0.418 3500 105%* * относительная активность = остаточная активность

3.2. Температурная стабильность при 99°С

Тест для определения температурной стабильности при 99°С проводился тем же способом, как тест, описанный выше в пункте 3.1. Таким образом полученные/вычисленные значения сопоставлены в следующей таблице (см. также Фигуру 4):

Время в мин Определенное значение 436 нм Единицы на мл Относительная активность 0 0.411 3440 100% 1 0.416 3490 101%* 15 0.396 3320 97%* 30 0.276 2320 67%* 45 0.329 2790 81%* 60 0.294 2470 72%* * относительная активность = остаточная активность

Пример 4 - Сокращение содержания акриламида в кофейных бобах

Чтобы определить эффективность обработки пищевых продуктов аспарагиназой согласно изобретению сырые кофейные бобы были подвергнуты стадии обработки ферментом при 80°С перед обжаркой, и после обжарки было определено снижение содержания акриламида.

Для этого были подготовлены следующие испытательные партии:

Контроль 1: 500 г сырых кофейных бобов типа смеси кофе "арабика" + 267 г 100 мМ трис/HCl рН 8,6 (25°С)

Контроль 2: 500 г сырых кофейных бобов типа Бразильская "арабика" + 267 г 100 мМ трис/HCl рН 8,6 (25°С)

Образец 1: 500 г сырых кофейных бобов типа смеси кофе "арабика" + 267 г 100 мМ трис/HCl рН 8,6 (25°С)+

1400 единиц аспарагиназы из примера варианта осуществления 1

Образец 2: 500 г сырых кофейных бобов типа Бразильская "арабика" + 267 г 100 мМ трис/HCl рН 8,6 (25°С)+

1400 единиц аспарагиназы из примера варианта осуществления 1

Контроли и образцы инкубировались в течение 60 минут при 80°C с вращением. Затем жидкость отфильтровали из кофейных бобов, бобы высушили и обжарили.

Содержание акриламида определялось независимо аккредитованной испытательной лабораторией. Результаты исследований показаны в следующей таблице (см. также Фигуру 4):

  Содержание акриламида в м кг/кг Среднее отклонение в мкг/кг Остаточное содержание Контроль 1 480 20 100% Образец 1 222 19 46% Контроль 2 585 35 100% Образец 2 273 18 47%

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к применению аспарагиназы и способу приготовления пищевого продукта с использованием данной аспарагиназы. Аспарагиназу, аминокислотная последовательность которой имеет по крайней мере 90% гомологию с аминокислотной последовательностью <SEQ ID NO:2>, остаточная активность которой после инкубации продолжительностью 5 минут при температуре в диапазоне от 70°C до 100°C составляет 200 ед./мг, применяют для приготовления пищевого продукта, который содержит аспарагин. Способ приготовления пищевого продукта включает инкубирование пищевых продуктов с указанной аспарагиназой при температуре инкубации, составляющей по крайней мере 50°C. В случае необходимости, нагревают пищевые продукты до температуры, лежащей по крайней мере на 10°C выше температуры инкубации. При необходимости, выделяют аспарагиназу из пищевых продуктов или инактивируют амидогидролазу. В случае необходимости, повторяют применение аспарагиназы. Предложенное изобретение позволяет снизить содержание аспарагина или акриламида в пищевых продуктах, содержащих аспарагин. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 5 ил., 11 табл., 4 пр.

1. Применение аспарагиназы, аминокислотная последовательность которой имеет по крайней мере 90% гомологию с аминокислотной последовательностью <SEQ ID NO:2>, остаточная активность которой после инкубации продолжительностью 5 минут при температуре в диапазоне от 70 до 100°C составляет 200 ед./мг, для приготовления пищевого продукта, который содержит аспарагин.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что у аспарагиназы есть температурный оптимум в диапазоне от 70 до 120°C.

3. Применение по п. 1, отличающееся тем, что у аспарагиназы есть оптимум pH от 1 до 14.

4. Применение по п. 1, отличающееся тем, что в диапазоне pH 5 - 10 активность аспарагиназы составляет по крайней мере 10% по сравнению с максимальной активностью.

5. Применение по п. 1, отличающееся тем, что аспарагиназа представляет собой «аспарагиназу I» из Pyrococcus furiosus.

6. Применение по п. 1, отличающееся тем, что аспарагиназа кодируется нуклеотидной последовательностью<SEQ ID NO:1>.

7. Применение по п. 6, отличающееся тем, что аминокислотная последовательность аспарагиназы имеет по крайней мере 95% или по крайней мере 99% гомологию с аминокислотной последовательностью <SEQ ID NO:2>.

8. Применение по п. 1, отличающееся тем, что аспарагиназа включает аминокислотную последовательность <SEQ ID NO:2>.

9. Применение по п. 1, отличающееся тем, что приготовление пищевых продуктов служит для гидролиза аспарагина до аспарагиновой кислоты.

10. Применение по п. 1, отличающееся тем, что приготовление пищевых продуктов служит для снижения содержания аспарагина и/или акриламида в пищевых продуктах.

11. Применение по п. 10, отличающееся тем, что снижение содержания аспарагина происходит таким образом, чтобы у пищевых продуктов было сниженное содержание акриламида во время или после тепловой обработки.

12. Применение по п. 1, отличающееся тем, что пищевые продукты выбираются из группы, включающей хрустящие хлебцы, сухари, булочки, крендели с солью, белый хлеб для тостов, вафли, сдобы, рогалики, кромсаны, шоколадные пирожные, сухие завтраки, бисквиты, картофельные чипсы, чипсы тортилья, кукурузные чипсы, крекеры, чипсы, рисовые лепешки, поленту, кус кус, блины, орехи, готовые смеси для тортов, смеси для булочек, смеси для хлеба, гренки, пищу для собак, пищу для кошек, кофейные бобы и какао бобы.

13. Применение по п. 12, отличающееся тем, что пищевые продукты представляют собой кофейные бобы.

14. Применение по п. 13, отличающееся тем, что приготовление включает декафеинизацию и/или промывку кофейных бобов.

15. Способ приготовления пищевого продукта, включающий стадии:
(i) инкубирование пищевых продуктов с аспарагиназой, определенной в одном из пп. 1 - 8 при температуре инкубации, составляющей по крайней мере 50°C;
(ii) в случае необходимости, нагрев пищевых продуктов до температуры, лежащей по крайней мере на 10°C выше температуры инкубации;
(iii) при необходимости выделение аспарагиназы из пищевых продуктов или инактивация амидогидролазы; и
(iv) в случае необходимости, повторное применение аспарагиназы, выделенной в стадии (ii), в стадии (i).