КОМБИНАЦИЯ ИСТОЧНИКА ЛЕЙЦИНА И ИСТОЧНИКА ОМЕГА-3 НЕНАСЫЩЕННОЙ ЖИРНОЙ КИСЛОТЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГИПЕРКАЛЬЦИЕМИИ Российский патент 2015 года по МПК A61K31/198 A61K31/202 A61P3/14 A61P3/02 A61P3/04 A61P35/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение имеет отношение к специальной комбинации, по меньшей мере, двух компонентов для лечения гиперкальциемии, для уменьшения или предупреждения снижения минеральной плотности костей у субъекта или для регуляции гомеостаза кальция в плазме крови in vivo.

Уровень техники

Кальций играет жизненно важную роль в большом количестве разнообразных физиологических функций, в частности в передаче импульса возбуждения в нервной и мышечной тканях. Кроме того, кальций участвует в передаче сигналов, приводящих, например, к изменениям в гормональном балансе {например, в балансе холецистокинина). У здоровых индивидуумов гомеостаз кальция в плазме строго регулируется и поддерживается в пределах узких границ (между 8,4 и 10,2 мг/дл или 2,1 и 2,6 мМ) с помощью паратиреоидного гормона, витамина D и кальцитонина (смотри “Strassman et al. (1993). Mechanisms of paraneoplastic syndromes ofcolon-26: involvement of inter! eukin 6 in hypercalcaemia. Cytokine., 5, 463-8”).

Уровень содержания кальция в плазме выше 2,8 ммоль/л у мужчин или выше 2,5 ммоль/л у женщин расценивается как гиперкальциемия (Bradley & Hoskin, 2006, Hypercalcaemia in head and neck squamous cell carcinoma. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg., 14, 51-4).

Симптомы, наблюдаемые у пациентов с гиперкальциемией, имеют отношение к физиологической и нервно/мышечной функции кальция и включают утомляемость, тошноту, рвоту, запор, ухудшение умственных способностей, почечную недостаточность, коматозное состояние, головную боль и измененное сознание. Гиперкальциемия чаще всего возникает в связи со злокачественными заболеваниями или первичным гиперпаратиреозом. У значительного процента пациентов с новообразованиями, например, раком легких, раком молочной железы, раком почки, лимфобластным лейкозом, множественной миеломой или раком головы или шеи, развивается гиперкальциемия.

Существуют, по меньшей мере, две различные формы гиперкальциемии, связанной со злокачественными новообразованиями. Одна форма связана с разрушением кости при распространении метастазов (Berenson, J.R., Rajdev, L. & Broder, M. (2006). Managing bone complications of solid tumours. Cancer Biol Ther., 5, 1086-9. Epub 2006 Sep 20.). Другая форма связана с некоторыми другими механизмами, приводящими к повышенному разрушению кости. Один из этих механизмов включает секрецию опухолью РТН-родственного гормона (РТНrН), что может приводить к повышенной деминерализации костей и/или увеличенной реабсорбции кальция в почках вследствие перекрестного взаимодействия РТНгН с рецептором РТН. Кроме того, сообщалось об участии воспалительных цитокинов в индуцировании гиперкальциемии (Mitnick, M., Isales, С., Paliwal, I. & Insogna, К. (1992). Родственный паратиреоидному гормону протеин стимулирует высвобождение простагландина Е2 из клеток человеческих остеобласт-подобных клеток: модулирующий эффект длины пептида. J Bone Miner Res., 7, 887-96).

Сообщалось, что уровень кальция в крови является независимым прогностическим фактором качества жизни у пациентов с множественной миеломой. Более того, наблюдалась корреляция между уровнями кальция и количеством баллов при оценке физических функций у этих пациентов. Сообщалось, что кроме утомляемости с уровнями кальция коррелировали другие параметры качества жизни. Также наблюдалась существенная взаимосвязь между кальцием и потерей аппетита при этом диагнозе. Кроме того, тошнота и рвота была связана с уровнем кальция в сыворотке. Он был упомянут как прогностический фактор боли и была предположена его связь с когнитивной функцией.

Содержание кальция в сыворотке является независимым прогностическим фактором качества жизни при множественной миеломе (Eur J Haematol., 78, 29-34. Epub 2006 Oct 13.). Уровень кальция в крови является независимым прогностическим фактором качества жизни при множественной миеломе. В этом исследовании у 32% из 686 пациентов была установлена гиперкальциемия. Кроме того, сообщалось, о существовании линейной составляющей в корреляции кальция с количеством баллов при оценке качества жизни, утомляемости и физических функций. Эти данные также показывают, что умеренное повышение уровней кальция в пределах уровней, принятых как нормальные изменения, может способствовать связанной с раковым заболеванием утомляемости и связанному с раком снижению физической работоспособности.

Согласно наблюдениям, даже в пределах нормальных значений кальция, содержание кальция в сыворотке было связано с резистентностью к инсулину, и даже небольшие повышения уровней кальция в пределах нормы могут способствовать развитию диабета. Резистентность к инсулину представляет собой важнейшую проблему при различных видах хронических болезней, таких как COPD (хроническое обструктивное заболевание легких), HIV (вирус иммунодефицита человека), болезнь Альцгеймера, рак, почечная недостаточность, сердечная недостаточность и болезненное состояние, характеризующееся высоким уровнем провоспалительных цитокинов в плазме и/или сыворотке.

Кроме того, лечение пациентов, страдающих от нарушения, отличного от гиперкальциемии, лекарственным средством может вызвать или усугубить утомляемость, физическое или психическое нарушение. Например, для лечения солидных опухолей и гематологических злокачественных заболеваний широко используются антрациклиновые антибиотики. У пациентов, страдающих от этих типов рака, также имеется риск развития гиперкальциемии (Higdon, M.L. & Higdon, J.A. (2006). Treatment of oncologic emergencies. Am Fam Physician., 74, 1873-80). Непосредственное действие антрациклинового антибиотика доксорубицина на гомеостаз кальция в скелетной мускулатуре может способствовать утомляемости, вызванной химиотерапией (van Non-en, К. et al. (2009), “Direct effects of doxorubicin on skeletal muscle contribute to fatigue” Br J Cancer., 100, 311-4.). Поэтому группа пациентов, страдающих от солидных опухолей и гематологических злокачественных заболеваний, которых лечили антрациклиновыми антибиотиками или другим видом химиотерапии, может быть даже более чувствительна к длительному истощению в результате ослабленной мышечной функции из-за повышенных уровней кальция. Кроме того, облучение может увеличивать или стимулировать разрушение костей.

WO 01/60355 имеет отношение к использованию соединений, являющихся активаторами или лигандами рецепторов, активируемых пролифератором пероксисом, для лечения или профилактики болезни костей, например, рака, которая приводит к гиперкальциемии. Среди указанных соединений упоминается целый ряд ненасыщенных жирных кислот, которые, по-видимому, могут способствовать костной анаболической активности. Однако не представлены экспериментальные результаты, связанные со специально направленным лечением субъектов, страдающих от гиперкальциемии. В частности, не было продемонстрировано или не предполагалось действие ненасыщенных жирных кислот на уровни кальция в плазме.

Раскрытие изобретения

Изобретатели обнаружили, что для оказания существенного влияния на уровень кальция в плазме у мышей-опухоленосителей недостаточно использования ненасыщенных жирных кислот (в растительном масле, рыбьем жире или их смеси) в отдельности, смотри примеры ниже. Кроме того, у мышей не наблюдалось значительного влияния ненасыщенных жирных кислот (в растительном масле, рыбьем жире или их смеси) самих по себе на снижение костного катаболизма (что приводит к повышенной плотности кости).

Цель изобретения - предоставить новые средства лечения гиперкальциемии, в частности, средства, которые могли бы сделать возможным снижение уровня кальция в плазме у субъекта, страдающего от гиперкальциемии, или сохранение уровня кальция в плазме крови на нормальном уровне у пациента с риском развития гиперкальциемии, и/или которые могли бы обеспечить предупреждение потери плотности или снижение плотности костей, связанной с гиперкальциемией, и/или ослабление одного или более других симптомов, связанных с гиперкальциемией, например усталости, сниженной функции мышц.

Одна или более дополнительных целей, лежащих в основе настоящего раскрытия, станут очевидны из представленного ниже описания.

В ходе работы было обнаружено, что комбинация отдельной ненасыщенной жирной кислоты и другого специального компонента является пригодной для профилактического и терапевтического лечения гиперкальциемии.

Таким образом, настоящее изобретение имеет отношение к комбинации источника лейцина и, по меньшей мере, одной ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты для профилактического и терапевтического лечения гиперкальциемии.

Кроме того, изобретение имеет отношение к комбинации источника лейцина и, по меньшей мере, одной ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты для уменьшения потери минеральной плотности костей или предупреждения уменьшения минеральной плотности костей у субъекта.

Далее, изобретение имеет отношение к комбинации источника лейцина и, по меньшей мере, одной ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты для регуляции гомеостаза кальция в плазме крови in vivo.

Кроме того, изобретение имеет отношение к комбинации источника лейцина и источника, по меньшей мере, одной ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты для улучшения аппетита и/или увеличения общего произвольного потребления пищи в день и/или для снижения тошноты и/или для снижения позывов на рвоту. Потеря аппетита, тошнота и позывы на рвоту являются симптомами, которые могут быть связаны с ненормальными уровнями кальция в плазме крови.

Кроме того, изобретение имеет отношение к питательной композиции, фармацевтической композиции или нутрицевтической композиции, содержащей комбинацию лейцина и, по меньшей мере, одной ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты, для профилактического или терапевтического лечения гиперкальциемии, для уменьшения потери минеральной плотности костей или предупреждения снижения минеральной плотности костей у субъекта, или для регуляции гомеостаза кальция в плазме крови in vivo, для улучшения аппетита, уменьшения тошноты или уменьшения позывов на рвоту.

В конкретном варианте осуществления комбинация или композиция изобретения предназначается для профилактического или терапевтического лечения избыточного высвобождения кальция из костей и/или скелетных мышц; и/или избыточного накопления кальция вследствие почечной недостаточности или гиперпаратиреоза. С этим накоплением или избыточным высвобождением может быть связана усталость, повышенная утомляемость, потеря инициативы, утрата мышечной функции, аритмия сердца, остеопения, остеопороз, болезни костей, тошнота, рвота или потеря аппетита, причем это может привести к полиурии, олигоурии и повреждению почек.

Было обнаружено, что комбинация источника лейцина и ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты оказывает благоприятное воздействие на минеральную плотность костей и/или на уровень кальция в плазме крови у субъекта, страдающего от гиперкальциемии. Отмечается, что лечение комбинацией источника лейцина и источника ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты согласно изобретению не должно приводить к снижению уровня кальция в сыворотке до нормального уровня кальция при любых обстоятельствах. Например, уровень кальция может быть доведен до или может сохраняться около нормального значения или на немного повышенном уровне (у людей примерно до 2,8 мМ), в результате этого можно избежать возникновения состояния, опасного для жизни и требующего срочной медицинской помощи вследствие тяжелой гиперкальциемии (уровень кальция в плазме крови, превышающий 3,75 мМ), которое может привести к коме или остановке сердца.

Кроме того, в случае, если во время или после лечения уровень кальция полностью не нормализовался при лечении комбинацией или композицией согласно изобретению, субъект может получить пользу от одного или более полезных эффектов, таких как улучшение мышечной функции (например, более высокое максимальное значение силы), сниженной утомляемости, повышенной физической активности, уменьшенной кахексии и/или урегулирования одного или более симптомов, таких как, тошнота, рвота, запор, ухудшение умственных способностей, почечная недостаточность, коматозное состояние, головная боль и измененное сознание.

Краткое описание фигур

Фигура 1 показывает влияние лейцина, ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты (из рыбьего жира) или их комбинации на минеральную плотность костей и уровень кальция в плазме. С=контроль, ТВ=мыши-опухоленосители, получавшие контрольную диету, lеu=лейцин, fо=рыбий жир.

Фигура 2 показывает влияние общей специальной комбинации лейцина (часть связана с протеином, часть в свободном виде), ω-З полиненасыщенной жирной кислоты (из рыбьего жира) и олигосахаридов на уровень кальция в плазме. CON=мыши, получавшие контрольную диету В, TB-CON=мыши-опухоленосители, получавшие контрольную диету В, TB-SNC=мыши-опухоленосители, получавшие специальную питательную композицию.

Фигура 3 показывает корреляцию параметров мышечной функции с уровнем кальция. Данные представляют фактор R корреляции Пирсона при р<0,05. Одна точка на графике, представленная в виде открытого значка (скорость расслабления/мг, 83 Гц), имела значение р 0,057. Контр2*расслабление/мг=квадратный корень времени сокращения с поправкой на мышечную массу умножить на скорость максимального расслабления с поправкой на мышечную массу.

Фигура 4 показывает характерные примеры индивидуальных кривых силы (кривая данных для животных с максимальной силой лучше всего соответствует кривой среднего значения). CON=мыши, получавшие контрольную диету В, TB-CON=мыши-опухоленосители, получавшие контрольную диету В, TB-SNC=мыши-опухоленосители, получавшие специальную питательную композицию.

Фигура 5 показывает измерение утомляемости во время повторяющейся стимуляции, модель подражающая «тренировке». Представленные данные: совокупная потеря на 10 повторов максимальной мышечной силы с поправкой на мышечную массу деленная на максимальную силу на 1 повторе с поправкой на мышечную массу.

Фигура 6 показывает распределение относительной потери максимальной силы во время повторяющейся стимуляции, модель подражающая «тренировке». Представленные данные: максимальная сила с поправкой на мышечную массу при количестве повторов (at time repeat) x - максимальная сила при количестве повторов (at time repeat) (х-20) деленная на максимальную силу с поправкой на мышечную массу при 1 повторе. CON=мыши, получавшие контрольную диету В, TB-CON=мыши-опухоленосители, получавшие контрольную диету В, TB-SNC=мыши-опухоленосители, получавшие специальную питательную композицию.

Фигура 7 показывает корреляцию параметров мышечной функции с уровнями кальция во время «тренировки». Данные представляют фактор R корреляции Пирсона при р<0,05. Две точки на графике, представленные в виде открытого значка (скорость расслабления/мг и ftr, и то и другое при 83 Гц), имели значение р 0,077 и 0,074, соответственно.

Фигура 8 показывает суточную активность на мышь по сравнению с активностью на мышь на 2 день. CON=мыши, получавшие контрольную диету В, TB-CON=мыши-опухоленосители, получавшие контрольную диету В, TB-SNC=мыши-опухоленосители, получавшие специальную питательную композицию.

Термин “или” при использовании в описании означает “и/или”, если не установлено иначе.

Термины в единственном числе при использовании в описании означают “по меньшей мере, один”, если не указано иное.

При упоминании какого-либо 'существительного' (например, соединения, добавки и т.д.) в единственном числе, если не указано иначе, включается множественное число.

При упоминании “комбинации источника лейцина и источника ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты” по поводу конкретной цели имеется в виду, что и лейцин (предоставленный источником лейцина) и ω-3 полиненасыщенная жирная кислота (предоставленная источником ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты) предназначаются для применения с этой целью в комбинации. Источник лейцина и источник ю-3 полиненасыщенной жирной кислоты могут быть введены вместе в единой композиции (например, пищевой, нутрицевтической или фармацевтической композиции), введены одновременно в отдельных композициях или последовательно в отдельных композициях. При последовательном введении композиции обычно вводят непосредственно друг за другом, т.е. в случае перорального/энтерального введения композицию, вводимую последней, обычно вводят до того, как ранее введенная композиция абсорбируется организмом (усвоится).

В принципе, комбинацию или композицию согласно изобретению можно использовать для лечения любого позвоночного животного, в частности любого млекопитающего, в частности любого человека. Субъект может быть мужчиной или женщиной. Субъект может быть ребенком, подростком или взрослым человеком. Гиперкальциемию можно диагностировать известным способом путем определения уровня кальция в плазме крови. Как указано выше, считается, что у мужчины наблюдается гиперкальциемия, когда уровни кальция в плазме выше 2,8 ммол/л, а у женщины - выше 2,5 ммоль/л.

В конкретном варианте осуществления комбинация или композиция предназначается для лечения пожилого человека. В связи с этим, в контексте этого применения считается, что пожилым человеком является человек в возрасте 50 лет или более, в частности в возрасте 55 лет или более, конкретнее в возрасте 60 лет или более, еще конкретнее в возрасте 65 лет или более. Это довольно широкое определение принимает во внимание факт, что средний возраст варьирует между различными популяциями на разных континентах и т.д. Наиболее развитые страны в мире приняли хронологический возраст 65 лет как определение «пожилого» человека или человека старшего возраста (это связано с возрастом, при котором человек начинает получать пенсионное пособие), но подобно многим европеизированным понятиям, это определение плохо подходит, например, к ситуации в Африке. В настоящее время не существует стандартного численного критерия, принятого Организацией Объединенных Наций (UN), однако установленной UN границей является возраст 60+для того, чтобы отнести человека к старшей популяции в Западном мире. В Африке более традиционное определение человека старшего возраста или «пожилого» человека связано с хронологическим возрастом от 50 до 65 лет, в зависимости от окружения, региона и страны.

В принципе, любую форму гиперкальциемии можно лечить в соответствии с изобретением, в частности гиперкальциемии, вызванной, по меньшей мере, частично, избыточным высвобождением кальция из костей и/или уменьшенной почечной экскрецией (выведением) кальция.

Субъект, которого необходимо лечить комбинацией или композицией согласно изобретению, может страдать от гиперкальциемии (и в этом случае лечение может называться «терапевтическим»), или субъекта можно лечить для того, чтобы избежать развития состояния гиперкальциемии или, по меньшей мере, уменьшить один или более симптомов, возникающих вследствие гиперкальциемии, в случае, если гиперкальциемия все-таки развивается. Профилактическое лечение, в частности, может использоваться в отношении любого субъекта, у которого есть серьезный риск развития гиперкальциемии. Серьезный риск существует у субъектов, страдающих от нарушения или состояния, при котором в значительном количестве случаев (что статистически известно) развивается гиперкальциемия.

В частности, субъекта, которого следует лечить профилактически или терапевтически, можно выбрать из группы субъектов, страдающих от рака. В частности, предполагается, что субъекты, которых лечат с помощью химиотерапии или лучевой терапии, например, антрациклиновым антибиотиком, также могут получить положительный результат от лечения с помощью композиции изобретения.

В частности, рак может быть выбран из группы новообразований. Конкретнее, форму рака можно выбрать из рака легких, рака молочной железы, рака почки, множественной миеломы и рака головы и шеи. Кроме того, в частности, субъекты, страдающие от гематологических злокачественных заболеваний (множественная миелома, лимфома, лейкемия), нарушений, связанных с витамином D, которые могут приводить к гиперкальциемии (гипервитаминоз D), нарушений/состояний, связанных с высокой скоростью обновления костной ткани (гипертиреоз, длительное обездвиживание, болезнь Педжета костей), почечной недостаточности, интоксикации отдельными веществами, которая может привести к гиперкальциемии (например, интоксикация алюминием, интоксикация витамином А), могут получить пользу от профилактического или терапевтического лечения согласно изобретению.

В принципе, любой пищевой жир или смесь жиров, содержащая свободную ω-3 полиненасыщенную жирную кислоту или производное жирной кислоты (включая три-, ди- и моноглицериды и фосфолипиды) может служить в качестве источника ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты. При упоминании в описании жирных кислот включаются соответствующие остатки жирных кислот и их производных, которые предоставляют жирную кислоту при переваривании, такие как триглицериды, диглицериды, моноглицериды и фосфолипиды указанных жирных кислот.

ω-3 полиненасыщенную жирную кислоту для лечения согласно изобретению обычно выбирают из группы ω-3 полиненасыщенных жирных кислот с длинной цепью. Термин “с длинной цепью” при использовании в описании означает ω-3 полиненасыщенные жирные кислоты, имеющие, по меньшей мере, 18 атомов углерода, в частности С18-С26 ω-3 полиненасыщенные жирные кислоты.

В частности, предпочтительные ω-3 полиненасыщенные жирные кислоты включают эйкозапентаеновую кислоту (ЕРА), докозагексаеновую кислоту (DHA), эйкозатетраеновую кислоту (ЕТА) и докозапентаеновую кислоту (DPA). В частности, хорошие результаты были достигнуты с применением смеси, содержащей ЕРА и DHA. Дополнительные примеры ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты для применения согласно изобретению включают альфа-линоленовую кислоту и стеаридоновую кислоту.

Содержание ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты, в частности ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты с длинной цепью, в композиции изобретения предпочтительно составляет, по меньшей мере, 15 г/кг, в частности, по меньшей мере, 20 г/кг, исходя из общего веса макронутриентов композиции. Содержание ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты, в частности ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты с длинной цепью, составляет обычно 50 г/кг или менее, в частности 40 г/кг или менее, исходя из общего веса макронутриентов композиции. При упоминании в этом раскрытии “общего веса макронутриентов” подразумевается общее содержание белкового вещества, липидов, углеводов и пищевых волокон (клетчатки).

Композиция согласно изобретению может дополнительно содержать одну или более других жирных кислот в дополнение к ω-3 полиненасыщенной жирной кислоте, при этом другая жирная кислота(ы) может быть насыщенной или ненасыщенной.

Как правило, композиция содержит 300 г/кг или менее совокупных жирных кислот, в частности 200 г/кг или менее, конкретнее 180 г/кг или менее, исходя из общего веса макронутриентов композиции.

Общее содержание жирных кислот композиции согласно изобретению, в частности, может составлять, по меньшей мере, 50 г/кг, исходя из общего веса макронутриентов композиции, конкретнее, по меньшей мере, 100 г/кг, исходя из общего веса макронутриентов композиции.

Общее содержание ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты, в частности, ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты с длинной цепью, обычно составляет, по меньшей мере, 12 вес %, предпочтительно, по меньшей мере, 15 вес %, в частности, по меньшей мере, 20 вес %, конкретнее, по меньшей мере, 24 вес %, исходя из общего количества жирных кислот. Практически, содержание ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты, в частности ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты с длинной цепью, обычно составляет 75 вес % или менее, в частности 50 вес % или менее, конкретнее 40 вес % или менее, исходя из общего количества жирных кислот.

В частности, хорошие результаты могут быть получены при использовании комбинации лейцина и смеси полиненасыщенных жирных кислот (PUFA), при этом смесь содержит DHA и ЕРА, DHA и ЕРА, предпочтительно обеспечивая, по меньшей мере, 5 вес %, в частности, по меньшей мере, 14 вес % всех жирных кислот. Соотношение веса к весу DHA к ЕРА, в частности, может находиться в пределах от 1:9 до 9:1, конкретнее в пределах от 2:8 до 8:2, или в пределах от 3:7 до 1:1.

В частности соотношение веса к весу DPA к ЕРА может находиться в пределах от 1:20 до 1:4, конкретнее в пределах от 1: 15 до 1:8.

В качестве источников жирной кислоты (кислот) коммерчески доступными являются различные масла, например, разнообразные масла из зерновых культур и других растений. Масло морского происхождения, такое как рыбий жир, масло из планктона или масло из водорослей, является особенно пригодным в качестве источника ω-3 полиненасыщенных жирных кислот. В конкретном варианте осуществления, по меньшей мере, 70 вес % содержания ω3-полиненасыщенной жирной кислоты происходит из масла морского происхождения, в частности из рыбьего жира или масла из водорослей.

В плане ежедневной дозировки (для взрослого субъекта, например, весящего 70 кг, в частности, взрослого человека) комбинацию или композицию обычно вводят так, чтобы обеспечить ежедневную дозировку ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты с длинной цепью, в частности дозировку ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты с длинной цепью, по меньшей мере, 3,5 г/день. Верхний предел может быть определен, исходя из максимальной рекомендованной ежедневной дозировки в соответствии с общими диетическими принципами. В частности, указанная дозировка может составлять 25 г/день или менее или 20 г/день или менее.

В частности, для комбинации или композиции, предназначенной для перорального введения, например, жидкой питательной композиции, такой как пищевая добавка, имеющая жидкую или кашицеобразную консистенцию (т.е. жидкий пищевой продукт, который можно выпить), указанная ежедневная дозировка ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты предпочтительно находится в пределах от 3,5 до 6 г/день.

В частности для комбинации или композиции, которая предназначается для парентерального питания, указанная ежедневная дозировка ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты находится предпочтительно в пределах от 10 до 20 г/день.

Вообще лейцин входит в состав группы молекул, которые могут называться в данном описании «белковое вещество». Белковое вещество формируется из аминокислотных фрагментов. Термин «аминокислоты» при использовании в описании включает аминокислотные остатки {например, в пептидах). В частности термин «белковое вещество» включает свободные аминокислоты, соли аминокислот, сложные эфиры аминокислот, аминокислотные остатки, связанные с конъюгированными молекулами и пептидами, включая пептиды. Аналогично, когда делается ссылка на конкретную аминокислоту, например, лейцин, включается конкретная аминокислота (остатки), присутствующая в виде соли, в связанной форме, а также свободная конкретная аминокислота.

Таким образом, при использовании в описании, термин источник лейцина используется для любого соединения, которое предоставляет лейцин при правильном введении в организм, в частности, которое предоставляет лейцин после переваривания источника. Источник лейцина, в частности, может содержать, по меньшей мере, одно из следующих соединений: лейцин в форме свободной кислоты (включая ее цвиттер-ионное состояние); соли лейцина; пептиды, содержащие один или более остатков лейцина; протеины, содержащие один или более остатков лейцина; и конъюгаты лейцина с конъюгированным соединением, иным, чем аминокислота, протеин или пептид, при этом конъюгат способен расщепляться с высвобождением свободной аминокислоты (или ее соли) предпочтительно в кишечнике или желудке или после абсорбции в энтероцитах или печени. В принципе, лейцин может присутствовать в качестве D-изомера или L-изомера, предпочтительно лейцин представляет собой L-лейцин. Здесь и далее, если не установлено иное, при упоминании лейцина имеется в виду лейцин в любом виде, т.е. включая не только свободную аминокислоту (кислота/соль), но также лейцин в любой связанной форме.

«Пептид» означает комбинацию двух или более аминокислот, соединенных с помощью одной или более пептидных связей. Когда аминокислоты объединяются в пептид, они называются аминокислотными остатками. Пептиды включают олигопептиды и полипептиды, включая протеины (белки).

«Полипептид» означает пептидную цепь, содержащую 14 или более аминокислотных остатков. Олигопептид означает пептидную цепь, содержащую от 2 до 13 аминокислотных остатков.

Хиральные аминокислоты, присутствующие в комбинации или композиции изобретения, могут находиться в L-форме или D-форме, обычно в L-форме.

Белковое вещество может содержать один или более протеинов, при этом протеин(ы) или часть его может быть модифицированным, в частности (неполным) гидролизом, обычно до такой степени, что до 20% протеина гидролизуется до свободных аминокислот, предпочтительно до такой степени, что до 10% белка гидролизуется до свободных аминокислот. Преимущество (частично) гидролизованного протеина заключается в его полезном свойстве высвобождать аминокислоту при энтеральном введении.

Содержание пептидов (олигопептида, полипептида, протеина), исходя из белкового вещества, составляет обычно, по меньшей мере, 50 вес.%, по меньшей мере, 60 вес.%, или по меньшей мере, 75 вес.%. Вес.% пептида, исходя из белкового вещества, составляет обычно 99,5 вес.% или менее, предпочтительно до 94 вес.% или менее. Преимущество композиции, в которой содержание пептидов является высоким (≥50 вес.%), состоит в том, что вкус или другие органолептические свойства композиции обычно становятся лучше при потреблении (пероральном). Кроме того, усвоение аминокислот организмом может быть более постепенным.

Белковое вещество предпочтительно содержит, по меньшей мере, один протеин, имеющий, по меньшей мере, 9 г лейцина на 100 г аминокислот. Белковое вещество (предоставляющее лейцин) предпочтительно содержит, по меньшей мере, один белок, выбранный из группы сывороточных белков, казеина, казеината, соевых белков и белков пшеницы, предпочтительно из группы сывороточных белков и казеина.

Сывороточные белки означают глобулярные белки, которые могут быть выделены из сыворотки. В частности, глобулярные сывороточные белки можно выбрать из бета-лактоглобулина, альфа-лактоглобулина и сывороточного альбумина, включая их смеси. Примерами смесей, которые содержат сывороточные белки, являются изолят сывороточного белка и концентрат сывороточного белка.

В одном варианте осуществления белковое вещество содержит сывороточный протеин, в частности, по меньшей мере, 10 вес.%, исходя из белкового вещества, предпочтительно, по меньшей мере, 15 вес.%, исходя из белкового вещества. Как правило, фракция сывороточного белка составляет 50 вес.% или менее, исходя из белкового вещества, в частности 40 вес.% или менее, исходя из белкового вещества.

В частности в случае жидкой композиции, концентрация денатурированного сывороточного белка предпочтительно не превышает 35 вес.%, исходя из белкового вещества. Это является предпочтительным для устранения риска превращения в гель во время хранения.

Наличие сывороточного белка может давать ряд преимуществ. При использовании сыворотки наблюдается эффективное по скорости высвобождение аминокислот, и наряду с этим образуются аминокислоты, доступные для усвоения организмом.

Преимущественно, часть сывороточного белка (частично) гидролизуется, в частности до 50 вес.% сывороточного белка может быть (незначительно) гидролизованным, в частности 10-50 вес.%.

В качестве источника сывороточных белков предпочтительно выбирают сывороточную фракцию, содержащую менее, чем 20 вес.% гликомакропептида казеина (GMP), более предпочтительно менее, чем 10 вес.%.

Содержание бета-лактоглобулина предпочтительно составляет больше, чем 40 вес.%, более предпочтительно 46-80 вес.%. Это является предпочтительным, так как бета-лактоглобулин имеет относительно высокое содержание лейцина.

Когда используется интактный протеин, казеин предпочтительно содержит высокую концентрацию бета-казеина, в частности более, чем 36 г/100 г казеина, конкретнее 38-70 г/100 г казеина.

В одном варианте осуществления весь лейцин или часть лейцина присутствует в форме свободных аминокислот, их солей или в виде конъюгата с конъюгированной молекулой иной, чем протеин или пептид, при этом конъюгат способен расщепляться на свободную аминокислоту (или ее соль) и конъюгированное соединение под влиянием компонентов желчи и/или экскретов поджелудочной железы в двенадцатиперстной кишке и/или подвздошной кишке. Предпочтительно, в частности, количество лейцина в форме соли или свободной форме составляет, по меньшей мере, 1 вес.%, в частности, по меньшей мере, 10 вес.%, конкретнее, по меньшей мере, 25 вес.%, исходя из всего лейцина. Количество лейцина в форме соли или в свободной форме предпочтительно составляет до 90 вес.%, в частности до 75 вес.%, конкретнее до 60 вес.%.

Как правило, композиция согласно изобретению содержит 15 г/кг лейцина или более, предпочтительно, по меньшей мере, 25 г/кг лейцина, в частности от 30 до 70 г/кг лейцина, конкретнее от 40 до 60 г/кг лейцина, (включая связанный лейцин), исходя из общего веса макронутриентов композиции.

В конкретном варианте осуществления композиция содержит, по меньшей мере, 15 г/кг свободного лейцина, исходя из общего веса белкового вещества, жира, углеводов и пищевых волокон композиции, в частности от 22 до 35 г/кг свободного лейцина, конкретнее от 30 до 35 г/кг свободного лейцина.

С точки зрения ежедневной дозировки (например, для взрослого субъекта весом 70 кг, в частности, взрослого человека) лейцин обычно вводится в дозировке, по меньшей мере, 5 г/день, предпочтительно, по меньшей мере, 7 г/день. В частности, дозировка может доходить до 50 г/день, конкретнее до 35 г/день.

Как правило, количество лейцина в процентах от всего белкового вещества составляет, по меньшей мере, 12 вес.%. Преимущественно, количество лейцина в процентах от всего белкового вещества составляет, по меньшей мере, 15 вес.%, в частности, по меньшей мере, 18 вес.%, конкретнее, по меньшей мере, 19 вес.%. Указанное количество составляет обычно 30 вес.% или менее, в частности 25 вес.% или менее.

Кроме того, комбинация или композиция может содержать один или более дополнительных ингредиентов, в частности один или более ингредиентов, выбранных из группы усваиваемых углеводов, неусваиваемых углеводов и других пищевых волокон, микроэлементов, минералов, витаминов, иного белкового вещества, чем белковое вещество, обеспечивающее лейцин (например, одну или более свободных аминокислот отличных от лейцина), других липидов, отличных от (поли)ненасыщенной жирной кислоты, для лечения согласно изобретению, и другие добавки, типичные для питательных композиций, нутрицевтических композиций или фармацевтических композиций (такие как антиоксиданты, ароматизирующие вещества, стабилизирующие вещества или (в случае фармацевтической композиции) фармацевтически приемлемый носитель). Примеры дополнительных ингредиентов, например, описываются в WO2003/041701 (N.V.Nutricia) и WO2007/073178 (N.V.Nutricia). В частности, примеры дополнительных ингредиентов, из которых один или более могут присутствовать в композиции для применения согласно изобретению, в частности, в питательной композиции, включают натрий, калий, хлор, фтор, йод, фосфор, магний, витамин А, витамин D3, витамин Е, витамин К, витамин В1, витамин В2, витамин В3, витамин В5, витамин В6, фолиевую кислоту, витамин В12, биотин, витамин С, липоевую кислоту, цинк, железо, медь, марганец, молибден, селен и хром. Такие компоненты могут присутствовать в концентрации вплоть до рекомендуемой суточной дозы на ежедневную порцию.

В частности, хорошие результаты были получены при использовании композиции, дополнительно содержащей неусваиваемый углевод. Имеются данные, что присутствие неусваиваемого углевода в комбинации с (ω3-поли)ненасыщенной жирной кислотой, в частности DHA и/или ЕРА, и лейцином может оказывать дополнительный полезный эффект на уровень кальция в плазме путем снижения системных уровней воспалительных цитокинов. Кроме того, как показано с помощью примеров, присутствие неусваиваемого углевода, в частности неусваиваемого олигосахарида может быть полезно в отношении иммунной функции. В частности, может присутствовать один или более неусваиваемых олигосахаридов, например, один или более олигосахаридов, выбранных из группы галактоолигосахаридов (GOS) и фруктоолигосахаридов (FOS). Под олигосахаридом имеется в виду цепочка, содержащая от 2 до 25 остатков Сахаров. В частности, если присутствует неусваиваемый углевод, его содержание может составлять около 20-70 г/кг, конкретнее 40-60 г/кг, исходя из веса макронутриентов. В частности, ежедневная дозировка (например, для взрослого весом около 70 кг) может быть выбрана в пределах 2,5-15 г/день.

Предполагается, что использование диеты с низким гликемическим индексом является благоприятным в отношении лечения гиперкальциемии, уменьшения потери минеральной плотности костей или предотвращения уменьшения минеральной плотности костей у субъекта или регуляции гомеостаза кальция в плазме крови in vivo. Без связи с какой-либо теорией, изобретатели полагают, что диета с низким гликемическим индексом может влиять на уровни кальция в сыворотке положительным образом, так как использование диеты с низким гликемическим индексом может оказывать положительное влияние на уровни кальция в сыворотке, причем эффект может быть связан с улучшенной чувствительностью к инсулину, вследствие использования диеты с низким гликемическим индексом.

Таким образом, в конкретном варианте осуществления композиция представляет собой питательную композицию с низким гликемическим индексом. В частности композицию с гликемическим индексом ниже 55, предпочтительно ниже 45. На практике гликемический индекс всегда будет выше ноля, и обычно составляет, по меньшей мере, 1, в частности, по меньшей мере, 5. Подробности определения гликемического индекса композиции предоставлены в нижеприведенных Примерах.

Специалист сможет создать композицию с относительно низким гликемическим индексом на основе раскрытой в описании информации и общедоступных сведений. В частности, при увеличении процента углеводов, которые перевариваются более медленно, чем глюкоза, или при увеличении количества углеводов, которые дают меньше глюкозных фрагментов, чем глюкоза, гликемический индекс композиции (при других одинаковых условиях) уменьшается. Предпочтительными примерами углеводов, которые усваиваются более медленно, чем глюкоза, являются изомальтулоза, фруктоза, галактоза, лактоза, трегалоза. Наряду с этим, добавление жира и клетчатки может замедлить эвакуацию из желудка. Более того, клетчатка может создавать физический барьер в кишечнике, уменьшая скорость абсорбции. Аминокислоты из белка могут увеличивать высвобождение инсулина (особенно лейцин), и тем самым увеличивать поглощение глюкозы клетками. Все эти механизмы могут способствовать уменьшению гликемического индекса.

В конкретном варианте осуществления композиция представляет собой питательную композицию. Питательная композиция означает питательную композицию, содержащую компоненты природного происхождения, предпочтительно существующие в виде источника питания, которым можно торговать за прилавком, в виде добавок, функциональных продуктов питания или компонентов пищевого продукта, т.е. без назначения врача или ветеринара. Питательная композиция также может быть медицинским питанием, предназначенным для лечения с помощью диеты болезни или состояния млекопитающих под наблюдением врача или ветеринара.

Питательная композиция согласно изобретению может иметь вид жидкости, например, напитка, полужидкости, например, йогурта или сладкого крема, иметь вид геля, например, желеобразного кекса, или иметь вид твердого продукта, например, конфет или мороженого.

В отдельном варианте осуществления композиция изобретения представляет собой пищевую добавку в жидкой или кашицеобразной консистенции. В более конкретном варианте осуществления пищевая добавка в жидкой или кашицеобразной консистенции содержит 1,5-2,5 г/100 мл общего лейцина и 0,8-2 г/100 мл ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты.

В конкретном варианте осуществления композиция изобретения представляет собой композицию для кормления через трубочку (парентерального кормления). В более конкретном варианте осуществления композиция для кормления через трубочку содержит 0,4-0,9 г/100 мл общего лейцина и 0,4-1 г/100 мл ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты.

В некотором варианте осуществления жидкую композицию приготавливают из концентрата, например, из жидкого (например, с вязкостью менее, чем примерно 80 мПз), полужидкого {например, с вязкостью менее, чем примерно 80 мПз, и менее, чем примерно 400 мПз), гелеобразного или твердого. В случае таких препаратов для разведения концентрата можно использовать воду. В частности, такие препараты изготавливают непосредственно перед введением композиция, например, в растворимом виде.

Конкретный вариант осуществления изобретения представляет собой питательную композицию, содержащую белковое вещество, жир и усваиваемый углевод, в которой

a) содержание белкового вещества обеспечивает от 18 до 50 эн%, предпочтительно от 20 до 40 эн%, более предпочтительно от 22 до 32 эн% всей композиции;

b) содержание жиров обеспечивает от 10 до 50 эн%, предпочтительно от 20 до 40 эн%, более предпочтительно от 25 до 35 эн% всей композиции;

c) содержание усваиваемых углеводов обеспечивает от 20 до 70 эн%, предпочтительно от 30 до 60 эн%, более предпочтительно от 38 до 48 эн% всей композиции.

Энергетическая ценность соединения (эн%) основывается на энергии, обеспечиваемой усваиваемой частью (в частности, у человека) соединения. В частности, энергетическая ценность основывается на вкладе белкового вещества, липидов и усваиваемых углеводов, при этом используются следующие расчетные коэффициенты: 4 ккал/г для усваиваемых углеводов и белкового вещества и 9 ккал/г для липидов.

Общая энергетическая ценность жидкой композиции в соответствии с изобретением может быть выбрана в пределах широких границ, например, от 0,2 до 4 ккал/мл. Как правило, общая энергетическая ценность составляет, по меньшей мере, 0,3 ккал/мл, в частности, по меньшей мере, 0,8 ккал/мл, конкретнее, по меньшей мере, 1,2 ккал/мл. Обычно, общая энергетическая ценность составляет 3,0 ккал/мл или менее, в частности 2,6 ккал/мл или менее, конкретнее 2,4 ккал/мл или менее.

В конкретном варианте осуществления жидкая композиция согласно изобретению обладает энергетической ценностью в пределах от 0,3 до 3,0 ккал/мл, предпочтительно от 0,8 до 2,6 ккал/мл, более предпочтительно от 1,2 до 2,4 ккал/мл.

В дополнительном конкретном варианте осуществления жидкая композиция в соответствии с изобретением обладает энергетической ценностью в пределах от 0,2 до 1,0 ккал/мл, предпочтительно от 0,4 до 0,9 ккал/мл. В частности, такие композиции могут использоваться лицами пожилого возраста.

Факторы, играющие роль в определении желательной энергетической ценности, включают легкость достижения более высокого эн% белкового вещества, с одной стороны, и быстрое опорожнение желудка (увеличивающее анаболический ответ), с другой стороны.

Комбинация или композиция изобретения может вводиться под наблюдением врача-специалиста или может приниматься самостоятельно.

Композиция или комбинация может быть введена энтерально (путем парентерального кормления) или перорально.

Теперь изобретение будет проиллюстрировано с помощью следующих примеров.

Примеры

Пример 1: пример состава пищевой добавки, имеющей жидкую или кашицеобразную консистенцию

Таблица 1 Состав пищевой добавки, имеющей жидкую кашицеобразную консистенцию   Предпочтительный предел (г/100 мл) Конкретная композиция (г/100 мл) белковое вещество 9-12 10,1 - содержание общего лейцина 1,5-2,5 1,95 -из которого свободного лейцина     0,9-1,5 1,1 углеводы (усваиваемые) 10-25 17,4 Жиры 2-6 5,3 - из них ненасыщенных 2-6 4,2 - из них ω3-PUFA 0,8-2 1,1 пищевые волокна 1-4 2

Пример 2: состав композиции для парентерального питания

Таблица 2 Питательная композиция для парентерального питания   Предпочтительный предел (г/100 мл) Конкретная композиция (г/100 мл) белковое вещество 6-10 7.8 - содержание общего лейцина 1,0-2,0 1,5 -из которого свободного лейцина     0,4-0,9 0,8 углеводы (усваиваемые) 10-25 17 Жиры 2-6 5,4 - из них ненасыщенных 2-6 4,5 - из них ω3-PUFA 0,4-1 0,8 пищевые волокна 1-4 1,5

Пример 3: результаты испытаний

Материалы и методы

Животные

Самцов мышей CD2F1 в возрасте 6-7 недель (BALB/cxDBA/2, Harlan/Charles River the Netherlands) индивидуально размещали в комнате с контролем климата (цикл ночь-день 12:12 при постоянной комнатной температуре 21±1°С). После акклиматизации в течение 1 недели мышей разбили на группы, сопоставимые по весу: (1) контрольная группа, получавшая контрольную пищу, (2) животные с опухолями, получавшие контрольную пищу, и (3) животные с опухолями, получавшие экспериментальные диеты. Представленные данные получены в результате объединения нескольких экспериментальных опытных серий с одинаковыми характеристиками животных и экспериментальными методами (если не установлено иное), различающихся только использованными экспериментальными диетами. Все экспериментальные процедуры были одобрены Этическим комитетом по использованию животных (DEC consult, Билтовен, Нидерланды) и соответствовали принципам надлежащего ухода за лабораторными животными.

Экспериментальные диеты (эксперименты категории А и В)

Эксперименты подразделили на: (А) эксперименты, предназначенные для проверки влияния отдельного компонента или комбинации питательных компонентов (добавление свободного лейцина (leu), ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты (из рыбьего жира) (fo)) или их комбинации к основной диете (AIN93-M с высоким содержанием белка (151 г казеин/кг)), которые давали животным в виде гранул; (В) эксперименты, предназначенные для проверки влияния сложной питательной комбинации, которая похожа на состав усовершенствованного продукта Фортикер (Nutricia Advanced Medical Nutrition, Нидерланды), включает все индивидуальные компоненты, проверенные в (А), и отличается от AIN-93 по составу макронутриентов для получения более гуманизированной диеты Западного типа, предоставляемой в виде густой массы по техническим причинам.

Контрольная диета с высоким содержанием белка AIN93-M в экспериментах, где проверялось влияние отдельных ингредиентов, содержала на кг корма 151 г белка (100% казеин), 702 г углеводов и 40 г жира (100% соевое масло) (Research Diet Services, Wijk bij Duurstede, Нидерланды). Экспериментальные диеты в этой категории отрегулировали в отношении к контрольным диетам путем частичного замещения углеводов и/или соевого масла лейцином (151 г казеина/кг и 16 г лейцина/кг корма; leu), рыбьим жиром (151 г казеин/кг и 22 г рыбьего жира/кг корма; fo), или лейциной и рыбьим жиром (151 г казеина/кг, 16 г лейцина/кг и 22 г рыбьего жира/кг корма; leu+fo). 22 г рыбьего жира содержали 6,9 г ЕРА и 3,1 г DHA, что приводит к отношению EPA:DHA 2,2:1.

В эксперименте, где проверяли полную богатую белками комбинацию лейцина, ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты (из рыбьего жира) и олигосахаридов, контрольная диета содержала на кг корма 126 г белка (казеина), 53 г жира (кукурузное масло) и 699 г углеводов. Изо-калорийная экспериментальная диета (в дальнейшем она называется специальная питательная композиция, SNC) содержала на кг корма 2 Юг белка (189 г интактного белка, из которого 68% казеина и 32% сыворотки, и 21 г свободного лейцина), 53 г жира (20,1 г кукурузного масла, 10,2 г масла канолы и 22,2 г рыбьего жира), 561 г углеводов, 18 г галакто-олигосахаридов и 2 г фрукто-олигосахаридов.

Опухолевая модель

Клетки мышиной аденокарциномы С-26 культивировали in vitro в среде RPMI 1640 с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина (31). Опухолевые клетки трипсинизировали в суб-конфлюентном состоянии и после промывки суспендировали в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS) при концентрации 2,5×10⁶ клеток-мл^-1. Опухолевые клетки (5×10⁵ клеток в 0,2 мл) инокулировали подкожно в правый паховый бок мышей под общей анестезией (изофлуран/N₂О/О₂). Контрольные животные (С) получили имитацию инъекции 0,2 мл HBSS.

Протокол эксперимента

После инокуляции опухолевых клеток или введения раствора Хенкса (HBSS) три раза в неделю измеряли массу тела, потребление пищи и размер опухоли (длину и ширину). Ежедневную активность в домашней клетке контролировали только в эксперименте категории В. Во всех экспериментах на 20 день после инокуляции опухоли проводили обезболивание и взвешивание животных. Извлекали и взвешивали скелетные мышцы (например, m.Tibialis Anterior (mTA), m.Gastrocnemius (mG), m.Extensor Digitorum Longus (mEDL) и M.Soleus (mS)), опухоль, поджелудочную железу, почки, печень, эпидидимальный жир, тимус, легкие и сердце. Массу тушки (carcass mass) вычисляли, вычитая массу опухоли из массы тела. Кроме того, в эксперименте категории В проверяли мышечную функцию ex vivo.

Оценка ежедневной активности

Физическую активность контролировали непрерывно (24 час) в течение 20-дневного периода исследования, начиная со 2 дня, с помощью датчиков активности (датчик с чувствительными элементами двух типов DUO 240, Visonic; адаптированный R.Visser, NIN, Амстердам, Нидерланды), которые переводили отдельные изменения инфракрасного изображения, вызванные движениями животных, в счет (баллы) произвольной активности. Датчики располагались над домашними клетками и через входные порты и интерфейс подсоединялись к компьютеру, снабженному программным обеспечением MED-PC IV для сбора данных (MED associates, St.Albans, Вермонт). Активность выражалась в счете (баллах) за час (в течение всего 24-часового периода, темного периода (активный период, мыши являются ночными животными) и светлого периода (неактивный период)). Активность вычисляли для каждой мыши отдельно и выражали относительно ее собственной общей активности на 2 день, чтобы ввести поправку на индивидуальную чувствительность датчиков. Активность двух последовательных дней усредняли, чтобы уменьшить суточные колебания. Для того, чтобы определить изменения в характере активности на всем протяжении эксперимента, активность за час и активность ночь-день выражали как процент от общей суточной активности и переводили в актограмму.

Оценка функциональных возможностей мышц

Сократительные характеристики правой EDL мышцы оценивали ex vivo, как описано ранее (van Non-en, К., Kegler, D., Argiles, J.M., Luiking, Y., Gorselink, M., Laviano, A., Arts, K., Faber, J., Jansen, H., van der Beek, E.M. & van Helvoort, A. (2009): Dietary supplementation with a specific combination of high protein, leucine and fish oil improves muscle function and daily activity in tumour-bearing cachectic mice. Br J Cancer., 100, 713-22.).

Коротко, мышцам давали возможность стабилизироваться в инкубаторе для органов в течение 30 мин, после этого определяли оптимальный ток возбуждения и силу. Затем определяли характеристики сила-частота (от 10 до 167 Гц, 250 мсек) и после восстановления в буфере для органов и периода отдыха в течение 5 минут проводили исследование мышц по протоколу «тренировки» (83 Гц, 250 мсек каждые 1000 мсек). Этот протокол представляет собой умеренную нагрузку, сравнимую с нормальной суточной активностью. При такой использованной частоте достигается полный тетанус (тетаническое сокращение) мышцы. Сигналы изометрической силы кривой частота-сила анализировали на максимальную и общую силу и скорость максимального сокращения и расслабления.

Статистические данные

Все результаты выражены в виде средних значений±SEM. Статистический анализ проводили с помощью SPSS 15.0 (SPSS Бенилюкс, Горинхем, Нидерланды). В эксперименте А использовали разные партии животных, поэтому для всех параметров было определено, что объединение данных разрешается, если не было взаимодействия между группами и экспериментами. Данные по составу тела, массе опухоли и органов на 20 день сравнивали между группами с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) и апостериорного LSD. Различия считались значимыми при значении р ниже α/k; где α=10% и k=количество сравнений. Для эксперимента А значение р должно быть ниже 0,02; для эксперимента В значение р должно быть ниже 0,05. Данные о потреблении пищи, весе тела, суточной активности и мышечной функции, которые регистрировались в течение 20 дней после инокуляции, анализировали с помощью повторных анализов ANOVA. Чтобы дополнительно распознать различия между группами, подсчитывали разницы или дельты от первого измерения в интервале. Эти дельты сравнивали между группами, используя ANOVA с апостериорным LSD для двухточечного сравнения между группами. Что касается функции скелетных мышц, данные первого измерения на 20 день не были похожими между группами, поэтому дополнительное установление различий проводили с помощью анализа ANOVA. Различия считались значимыми при двустороннем значении р<0,05.

Результаты

Минеральная плотность костей была уменьшена у мышей-опухоленосителей (ТВ) по сравнению с контрольными мышами (С) (фигура 1А). Добавление или лейцина или ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты (из рыбьего жира) не приводило к значимым изменениям по сравнению с ТВ. Однако, комбинация ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты и лейцина давала в результате значительное увеличение минеральной плотности костей по сравнению с ТВ. Наличие опухоли вызывало увеличение уровня кальция в плазме примерно на 75% (фигура 1В). Добавление отдельных ингредиентов (TB-leu или TB-fo) не влияло на уровни кальция у животных-опухоленосителей. Однако комбинация лейцина и ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты приводила к значимому снижению уровней кальция в плазме. Подобное уменьшение уровней в плазме было обнаружено у животных, получавших полную питательную комбинацию рыбьего жира, лейцина и олигосахаридов (эксперимент В) (фигура 2).

Мышцы от контрольных животных показали более высокую максимальную силу, максимальную скорость сокращения и максимальную скорость расслабления по сравнению с контрольными мышами ТВ. Специальная питательная комбинация ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты, лейцина (часть свободного лейцина, часть связанного в белке) и олигосахаридов корректировала различия, как зависимые от мышечной массы, так и независимые от мышечной массы. Тот же самый эксперимент использовали для более подробного изучения корреляции уровней кальция с параметрами мышечной деятельности. При всех значениях частот, при которых можно было получить тетанус (>83 Гц), параметры мышечной функции (максимальная сила, максимальная скорость сокращения и максимальная скорость расслабления) отрицательно коррелировали с уровнями кальция (R ниже - 0,7 и р<0,05) (фигура 3). Когда параметры мышечной функции, максимальная сила, максимальная скорость сокращения и максимальная скорость расслабления были скорректированы относительно мышечной массы, отрицательные корреляции сохранялись (R между - 0,4 и - 0,7) (фигура 3).

Повторные стимуляции при 83 Гц, подражающие умеренной «тренировке», вызывали утрату максимальной силы во всех трех группах. Потеря в силе была более резкой в группе TB-CON по сравнению с группой CON. Специализированная питательная комбинация частично нормализовала это. На фигуре 4 показаны характерные примеры (кривая, ближайшая к средней кривой) кривых силы, полученных во время тренировки. Для всех кривых вид пиков изменяется за первые 5 повторов. Момент времени, когда наблюдается максимальная сила, изменяется к концу импульса по сравнению с первым повтором.

Чтобы получить более ясное понимание об устойчивости мышцы к утомляемости, были вычислены относительные изменения максимальной силы. Если данные были представлены относительно максимальной силы в начале «тренировки» (с поправкой на мышечную массу), первые 20 повторов давали в результате похожую кумулятивную потерю максимальной силы, кроме того при 80 повторах относительная кумулятивная потеря максимальной силы была одинаковой (фигура 5). Однако контрольные мыши показали меньшую кумулятивную потерю максимальной силы между 20 и 50 повторами, чем мыши-опухоленосители. Мыши TB-SNC показали тенденцию к умеренной потере относительной максимальной силы. Это различие в распределении относительных максимальных сил становится более заметным, когда выражается как относительная потеря на 10 повторов (фигура 6). Обе кривые CON и TB-SNC значительно отличались от TB-CON по сравнению с повторами 30-70. Данные также показывают меньшую относительную потерю максимальной силы за первые 40 повторов.

Чтобы дополнительно прояснить зависимость между мышечной функцией во время повторяющейся стимуляции и кальцием, определяли, какой параметр мышечной функции самым лучшим образом коррелирует с уровнями кальция на всем протяжении полной повторной стимуляции. На фигуре 7 показаны параметры мышечной функции, которые демонстрируют фактор корреляции менее, чем - 0,35, и р<0,05, по меньшей мере, для 50 повторов. Для первых 40 повторов скорость расслабления с поправкой на мышечную массу показала наиболее строгую отрицательную корреляцию с уровнями кальция. В результате 40-80 повторов максимальная сила с поправкой на мышечную массу наилучшим образом отрицательно коррелировала с уровнями кальция. Когда использовали квадрат (quadratic set) данных по кальцию, факторы корреляции мышечной массы были сходными.

Суточная активность уменьшалась в группе TB-CON, при этом она была частично нормализована в группе TB-SNC по сравнению с CON (фигура 8). CON и TB-SNC значимо отличались от TB-CON. Общая суточная активность отрицательно коррелировала с уровнями кальция (таблица 3В). Активность в темный (активный) период даже лучше коррелировала с концентрациями кальция. Не наблюдалось корреляции между уровнями кальция и активностью в светлый (пассивный) период. Квадратичные уровни кальция немного меньше коррелировали с параметрами активности.

Обсуждение

Результаты показывают, что частичная нормализация уровней кальция достигалась только в том случае, когда лейцин и ω-3 полиненасыщенная жирная кислота (из рыбьего жира) были объединены.

Кроме того, эта комбинация была пригодна для того, чтобы частично нормализовать распределение потери относительной максимальной силы.

В частности, наблюдалось улучшение суточной активности (ночной у опытных животных) по сравнению с контрольной группой. Более того, концентрации кальция коррелировали с суточной активностью и, в частности, с активностью во время темного (активного) периода, и в этом случае наводя на мысль, что частота случаев утомляемости может быть уменьшена в соответствии с изобретением.

Данные, полученные при повторяющейся стимуляции, имитирующей тренировку, так же как и данные, полученные от одиночных стимуляций при разных частотах, показывают, что уровни кальция почти линейно коррелируют с мышечной деятельностью. Поэтому, предотвращение или лечение повышенных уровней кальция путем воздействия, связанного с питанием, может быть вариантом выбора для пациентов с гиперкальциемией или пациентов, у которых есть риск развития гиперкальциемии, с целью поддержания качества жизни такого пациента.

Пример 4: определение гликемического индекса

Определение

Гликемический индекс (GI) углевода - это мера его способности повышать возникающую после приема пищи концентрацию глюкозы. Продукты с высоким GI приводят к более высокой концентрации глюкозы, возникающей после приема пищи, чем продукты с низким GI. Кроме того, GI углевода предсказывает инсулиновый ответ на этот продукт.

GI углевода вычисляется путем оценки двухчасового гликемического ответа, являющегося результатом потребления 25 г стандартной глюкозы:

GI равен 'дифференциальной площади под кривой содержания глюкозы в крови, полученного в результате потребления испытываемого продукта, содержащего 25 г углевода' деленной на 'соответствующую площадь после приема равноценной порции глюкозы'

Методика исследования гликемического индекса

При проверке GI доступный углевод определяется как: суммарное количество углеводов минус неусваиваемые углеводы (растворимые и нерастворимые), которые происходят из клетчатки (physiological point dietary fibres) (например, инулин, FOS, резистентный крахмал 3 типа).

Предоставленные образцы должны соответствовать продукту, доступному для потребителя на рынке.

Все продукты, представленные для испытания, проверяются in vivo, т.е. 10 человек съедают количество продукта, содержащее эквивалент 25 г усвояемого углевода. Они являются здоровыми субъектами без хронических болезней, диабета или нарушений, связанных с глюкозой. BMI субъектов составляет 18,5-27 кг/м².

Контрольный продукт: контрольным продуктом являются 25 г порошкообразной глюкозы, растворенные в 250 мл воды. Каждый человек испытывает контрольный продукт, по меньшей мере, дважды.

Испытываемые продукты: Испытываемые продукты приготовлены согласно инструкциям производителя, представляя собой обычно потребляемую пищу. Испытываемые продукты съедаются только один раз в течение отдельной процедуры в виде порции, обеспечивающей 25 г усвояемого углевода, как определено выше.

Правила для субъектов: субъектов тестировали утром после поста 10-12 час в течение ночи. Два образца крови брали натощак (-5 и 0) с интервалом 5 минут, после чего субъекты съедали испытываемую пищу или контрольную пищу с равной скоростью за 15 минут. Дополнительные образцы крови брали через 15, 30, 45, 60, 90 и 120 минут после начала приема пищи. Испытываемая пища и контрольный продукт должны потребляться вместе с 250 мл воды. Это остается постоянным для каждого испытания в серии.

За 24 часа до тестирования GI: За день до каждой процедуры субъекты воздерживаются от принятия алкоголя и избегают необычных уровней физической нагрузки и потребления пищи. Вечерний прием пищи у субъектов должен содержать пищу, богатую углеводами, например, рис, макаронные изделия, хлеб, картофель, и не слишком много жира. В этот прием пищи следует исключить бобы, фасоль или зеленый горошек (чтобы избежать вторичного эффекта приема пищи на следующее утро). Важно, что субъекты ужинают, а потом воздерживаются от пищи в течение не более, чем 18 часов. Субъектов просят быть в одинаковом состоянии каждый раз, когда они приходят на исследование. После вечернего приема пищи субъекты постятся, по меньшей мере, 10 часов в течение ночи до начала испытательной процедуры на следующее утро. Во время периода голодания они могут пить только воду.

Взятие образцов крови: кровь берут из прокола в пальце. Кровь собирают без применения ингибиторов свертывания (гепарин, EDTA). Анализ на глюкозу: цельную капиллярную кровь измеряют с помощью автоматического анализатора глюкозы. В этом случае используется анализатор глюкозы Hemocue.

Анализ полученных данных: дифференциальная площадь под кривой ответа крови на глюкозу (iAUC), без учета площади ниже базовой линии, вычисляется геометрически, как описано ниже:

Для времени t0, t1,…tn концентрация глюкозы в крови составляет G0, G1,…Gn, соответственно:

$$iAUC=\begin{array}{c}x=1\\ \Sigma \text{ Ax}\\ \text{n}\end{array}$$

где Ax=AUC для х-ого интервала времени (т.е. между tx-1 и tx).

Для первого временного интервала (т.е. х=1): если G1>G0, A1=(G1-G0)×(t1-t0)/2

в ином случае A1=0

Для других временных интервалов (т.е. х>1)

если Gx≥G0 и Gx-1≥G0, Ax={[(Gx-G0)/2]+(Gx-1-G0)/2}×(tx-tx-1)

если Gx>G0 и Gx-1<G0, Ax=[(Gx-G0)²/(Gx-Gx-1)]×(tx-tx-1)/2

если Gx<G0 и Gx-1>G0, Ax=[(Gx-1-G0)²/(Gx-1-Gx)]×(tx-tx-1)/2

если Gx≤G0 и Gx-1-G0, Ax=0

Вычисление GI: У отдельных субъектов значение GI составляет iAUC для каждого продукта, выраженного в виде процента среднего значения iAUC двух контрольных продуктов (глюкоза). GI испытываемого продукта представляет собой среднее значение GI±SEM от 10 субъектов.

Из набора данных может быть исключено до двух «выбросов» («выброс» представляет собой индивидуума, чей GI отличается от среднего более, чем на два SD). SEM должна находиться в пределах 20% среднего.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой комбинацию источника лейцина и источника ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты для применения при терапевтическом или профилактическом лечении гиперкальциемии. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств, применяемых при терапевтическом или профилактическом лечении гиперкальциемии. 2 н. и 17 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 табл., 4 пр.

1. Комбинация источника лейцина и источника ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты для применения при терапевтическом или профилактическом лечении гиперкальциемии.

2. Комбинация источника лейцина и источника ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты для применения с целью уменьшения потери минеральной плотности костей, или для применения с целью предупреждения уменьшения минеральной плотности костей у субъекта, или для применения с целью регуляции гомеостаза кальция в плазме крови у субъекта in vivo, при этом указанный субъект является субъектом, страдающим от рака.

3. Комбинация по любому из пп. 1-2 для применения с целью уменьшения утомляемости.

4. Комбинация для применения по любому из пп. 1-2, содержащая, по меньшей мере, источник одной ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты, предоставляющий ω-3 полиненасыщенную жирную кислоту, выбранную из группы эйкозапентаеновой кислоты, докозагексаеновой кислоты, эйкозатетраеновой кислоты и докозапентаеновой кислоты.

5. Комбинация по любому из пп. 1-2 для применения при лечении субъекта, страдающего от рака.

6. Комбинация по п. 5, где рак выбран из рака легких, рака молочной железы, рака почки, множественной миеломы и рака головы и шеи.

7. Комбинация по любому из пп. 1-2 для применения при лечении чрезмерного высвобождения кальция из костей и/или скелетных мышц и/или для применения при лечении чрезмерного накопления кальция вследствие почечной недостаточности или гиперпаратиреоза.

8. Комбинация для применения по любому из пп. 1-2, когда комбинация предназначается для применения при лечении пациента, подвергавшегося радиотерапии или химиотерапии.

9. Комбинация для применения по любому из пп. 1-2, в которой источник лейцина содержит, по меньшей мере, одно соединение, выбранное из группы лейцина в виде свободной кислоты (включая цвиттер-ионное состояние); солей лейцина; пептидов, содержащих один или более фрагментов лейцина; протеинов, содержащих один или более фрагментов лейцина; и конъюгата лейцина с конъюгированным соединением, иным, чем аминокислота, протеин или пептид, при этом конъюгат способен расщепляться с высвобождением свободной аминокислоты (или ее соли) предпочтительно в кишечнике или желудке или после абсорбции в энтероцитах или печени.

10. Комбинация для применения по любому из пп. 1-2, в которой источник лейцина содержит, по меньшей мере, 12 вес. %, более предпочтительно 15 вес. % лейцина, наиболее предпочтительно более чем 18 вес. % лейцина, исходя из всего белкового вещества.

11. Комбинация для применения по п. 1 или 2, которая формирует часть питательной композиции, фармацевтической композиции или нутрицевтической композиции.

12. Комбинация для применения по п. 11, содержащая, по меньшей мере, один углевод, в частности, по меньшей мере, один олигосахарид.

13. Комбинация для применения по п. 12, содержащая, по меньшей мере, один олигосахарид, выбранный из группы галактоолигосахаридов и фруктоолигосахаридов.

14. Комбинация для применения по пп. 11, 12 или 13, содержащая, по меньшей мере, 15 г/кг совокупного лейцина, исходя из общего веса белкового вещества, жира, углеводов и пищевых волокон композиции, в частности от 30 до 70 г/кг лейцина, конкретнее от 40 до 60 г/кг лейцина.

15. Комбинация для применения по п. 11, содержащая, по меньшей мере, 15 г/кг свободного лейцина, исходя из общего веса белкового вещества, жира, углеводов и пищевых волокон композиции, в частности от 22 до 35 г/кг лейцина, конкретнее от 30 до 35 г/кг лейцина.

16. Комбинация для применения по п. 11, имеющая содержание ω-3 полиненасыщенной жирной кислоты, исходя из совокупных липидов, по меньшей мере, 12 вес. %, предпочтительно 18 вес. % или более.

17. Комбинация для применения по п. 11, когда композиция содержит масло морского происхождения или его фракцию, при этом масло морского происхождения или его фракция обеспечивает, по меньшей мере, 70 вес. % всех ω-3 полиненасыщенных жирных кислот в композиции.

18. Комбинация для применения по п. 11, которая формирует часть питательной композиции, имеющей гликемический индекс менее чем 55, в частности менее чем 45.

19. Комбинация для применения по п. 1 или 2 для лечения человека.