СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА ФИБРИНОГЕНА Российский патент 2015 года по МПК C07K1/14 C07K1/36 C07K14/75 A61K35/16 

Изобретение относится к области фармацевтической промышленности, а именно к биотехнологии получения гемостатических препаратов. Фибриноген синтезируется в печени и секретируется в плазму в концентрациях, достаточных для свертывания крови. Фибриноген представляет собой растворимый гликопротеин, который преобразуется под действием тромбина в фибрин, сеть волокон которого является основой сгустка, обеспечивающего гемостаз. Кроме гемостатической функции фибриноген участвует в заживлении ран, развитии опухолей и в метастазировании (Пособие для врачей-лаборантов по методам исследования плазменного гемостаза. Факторы свертывания крови. 2008, Москва, с.7).

Врожденный дефицит фибриногена (гипофибриногенемия) может нарушить гемостаз и привести к кровотечениям. Более распространенным является приобретенный дефицит фибриногена, который может быть следствием гемодилюции, кровопотери, процесса диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдром), а также при сепсисе (Братчик A.M. Клинические проблемы фибринолиза. 1993, Киев, с.151-172).

Наследственный или приобретенный дефицит фибриногена вызывает развитие гипофибриногенемии, основным методом лечения и профилактики которой является заместительная терапия препаратами фибриногена» (Зубаиров Д.М. Фибриноген и фибрин. В: Молекулярные основы свертывания крови и тромбообразования. 2000, Казань, с.1-32).

В заместительной терапии больных гипофибриногенемией и для ее профилактики применяют препараты, содержащие фибриноген.

Кроме заместительной терапии препараты на основе полученного концентрата фибриногена могут быть использованы в хирургической практике в качестве компонента фибринового клея. Состав такого клея позволяет проводить операции на больших раневых поверхностях, будь то операции в местах с большой степенью васкуляции, или обработка больших поверхностей ожогов, что ускоряет процесс регенерации покровных тканей (Зильберт А.П. Кровопотеря и гемотрансфузия. Принципы и методы бескровной хирургии. 1999, Петрозаводск, с.55-62).

К проблемам производства препаратов на основе фибриногена из плазмы крови человека следует отнести:

- возможность инфицирования реципиента вирусами гепатитов (A, B, C), иммунодефицита человека, парвовирусом, сифилисом и другими патогенами,

- возможность переноса реципиенту с определенной группой крови группы присутствующих в препаратах (концентраты средней чистоты) антител к антигенам эритроцитов других групп крови,

- контаминация препаратов на основе фибриногена балластными белками,

Для решения этих проблем разработаны соответствующие технологические подходы. Так, при подготовке пула плазмы крови проводят отбор тщательно проверенных здоровых доноров, у которых определяют возможное инфицирование вирусами гепатита, иммунодефицита человека и др. Однако для полной гарантии отсутствия вирусной инфекции в процессе получения концентратов фибриногена осуществляют вирусную инактивацию.

Известен способ получения концентрата фибриногена высаливанием с использованием спирто-солевого холодового осаждения» (Препараты крови. Инструктивно-методические материалы по контролю и производству. - М., 1976, стр.145-202). Этот метод требует больших временных и энергетических затрат, приготовления сложных буферных солевых растворов и необходимости их последующего отмывания, что делает процесс громоздким, а длительность процедуры приводит к значительным потерям продукта в ходе получения. Способ не может быть рекомендован для производства препарата из малых количеств крови.

Осаждение фибриногена сульфатом аммония также требует последующей очистки продукта от солевых растворов, что ведет к дополнительным технологическим сложностям» (Патент RU №2062103). Концентраты фибриногена, полученные криопреципитацией, успешно применяются в зарубежной хирургической практике» (Патент RU №2062103), однако достигаемая при этом концентрация фибриногена остается относительно низкой. Наиболее близким к заявляемому методу является способ получения препарата концентрата фибриногена, представленный в Патенте US 4960757.

Способ заключается в получении концентрата фибриногена из осадка, содержащего фибриноген, полученного в процессе выделения препарата фактора VIII, осуществляемого согласно патенту German Patent No. 2916711. Исходное сырье растворяют в буфере, содержащем NaCl, при нагревании до 37°C и перемешивании с поддержанием pH=7,5 2N раствором NaOH. Далее к концентрату фибриногена добавляют раствор CaCl₂.2H₂O и сахарозу до концентрации 60% в конечном растворе. Далее раствор фибриногена со стабилизаторами подвергают термической пастеризации на водяной бане при температуре 60°C с целью инактивации вирусов и других патогенов. После пастеризации раствор фибриногена разбавляют буфером, содержащим хлорид натрия и цитрат натрия и двухкратно переосаждают глицином. Недостатком данного метода является уменьшение концентрации фибриногена в конечном продукте из-за частичной полимеризации на стадии термоинактивации. Образовавшийся на данной стадии фибрин отделяют двухкратным переосаждением глицином. Тем самым выход по фибриногену на конечной стадии становится меньше.

Целью настоящего изобретения являлась разработка способа получения очищенного фибриногена. Данная цель достигалась разработкой технологии, обеспечивающей получение лиофилизированной формы концентрата фибриногена. Преимуществом настоящего метода выделения является использование буферного раствора, содержащего антикоагулирующий агент - цитрат натрия. Так же одним из преимуществ является использование Tween-80 (моноолеат полиоксиэтиленсорбитан) и TnBP (три-н-бутилфосфат) в качестве детергентов при проведении вирусной инактивации. В данном методе также проводится процедура очистки концентрата фибриногена от продуктов процесса вирусной инактивации.

Технология предусматривает растворение исходного сырья (криопреципитат свежезамороженной плазмы человека) в воде в присутствии 1-3 ед. гепарина, обработку раствора криопреципитата гелем гидроксида алюминия, осаждение фибриногена 20-30% раствором ПЭГа, последующее растворение отобранного осадка в буфере с цитратом натрия и хлоридом натрия, вирусную инактивацию раствора сольвент/детергентами Tween-80 и TnBP в течение 6-10 часов, удаление продуктов инактивации и инактивирующих агентов экстракцией раствора вазелиновым маслом, очистку от балластных белков двухкратным переосаждением глицином с концентрацией 1-2.5 моль/л, последующую стерильную фильтрацию, розлив и лиофилизацию.

Разработку технологии выделения фибриногена сначала проводили в лабораторных условиях с последующей оптимизацией выбранной методики, а затем масштабировали в условиях опытного производства. Производство препарата фибриногена осуществляли в соответствии с правилами Надлежащей Производственной Практики (GMP), стандартными операционными процедурами (СОП) и необходимыми условиями стерильности».

Сырьем для получения концентрата фибриногена являлся замороженный криопреципитат свежезамороженной плазмы человека.

На всех стадиях производства исходное сырье, промежуточные продукты и целевой препарат тестировали по содержанию фибриногена методом Клауса.

Ниже представлен конкретный пример осуществления изобретения.

Пример

1. Исходное сырье (криопреципитат свежезамороженной плазмы) в количестве 100 г. растворяют в трехкратном объеме дистиллированной воды, содержащей 1-3 ед. гепарина и добавляют 3%-ный гель Al(ОН)₃ (в соотношении: на 1 кг взвешенного криопреципитата - 10 г гидроксида алюминия).

2. Далее к полученной смеси добавляют 30%-ный раствор ПЭГа, до концентрации 3%, а pH раствора доводят до величины, близкой к изоэлектрической точке фибриногена (6,6-6,8) раствором уксусной кислоты. Под действием ПЭГа фибриноген выпадает в осадок, который отделяют от супернатанта центрифугированием. Далее супернатант передают на производство очищенного фактора VIII.

3. Осадок, содержащий фибриноген, растворяют при интенсивном перемешивании в десятикратном объеме буфера, содержащего 10 ммоль цитрата натрия и 150 ммоль хлорида натрия, поддерживая pH на уровне 7,8-8,0 0,5 М раствором трис-буфера, и температуре 30-35°C. Затем раствор центрифугируют для осветления при 4000 об/мин в течение 10 минут.

4. Вирусную инактивацию фибриногена проводят в присутствии 1% Tween-80^® и 0,3% TnBP, инкубируя полученный раствор при комнатной температуре при непрерывном перемешивании в течение 6-10 часов.

5. Удаление продуктов инактивации и инактивируюших агентов проводят экстракцией раствора фибриногена вазелиновым маслом. Для этого к вирусинактивированному концентрату фибриногена добавляют вазелиновое масло в пропорции 2:1 и интенсивно перемешивают 20 мин. Далее смесь центрифугируют при 2000 об/мин 10 минут и отделяют водный слой. Эту процедуру проводят трехкратно.

6. Отделение фибриногена от балластных белков проводят переосаждением полученного концентрата фибриногена глицином, доводя его концентрацию в растворе до 1,5 моль/л. При этом образуется осадок фибриногена, а большинство балластных белков остаются в растворе. Осанок фибриногена отделяют центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут и растворяют в растворе, содержащем 10 ммоль цитрата натрия и 0,15 моль хлорида натрия. Процедуру повторяют дважды, каждый раз отмывая осадок фибриногена холодном 1,5 М раствором глицина.

После переосаждения фибриноген растворяют в буфере до концентрации 25 г/л, подвергают стерильной фильтрации, разливают по флаконам и лиофилизируют. Полученный лиофилизат укупоривают под вакуумом, флаконы обжимают алюминиевыми колпачками и подвергают термоинактивации при 80°C в течение 72 часов.

Выход по фибриногену составляет около 55%.

Изобретение относится к биотехнологии получения гемостатических препаратов. Предложен способ выделения очищенного концентрата фибриногена, свободного от вирусов и балластных белков. Осуществляют солюбилизацию криопреципитата свежезамороженной плазмы человека. Осаждают фибриноген 20-30% раствором ПЭГ. Растворяют отобранный осадок в буфере с цитратом натрия и хлоридом натрия. Проводят вирусную инактивацию раствора сольвент-детергентным методом в присутствии 1-3% Tween-80 и 0,1-1,5% три-н-бутилфосфата. Очищают полученный концентрат от продуктов вирусной инактивации и сольвент-детергентов экстракцией вазелиновым маслом, проводимой трехкратно. Далее переосаждают полученный концентрат фибриногена 1,0-2,5 М раствором глицина. Осуществляют стерильную фильтрацию и лиофильное высушивание с последующим укупориванием лиофилизата под вакуумом и термоинактивацией. Изобретение позволяет получать лиофилизированную форму концентрата фибриногена с выходом около 55%.

Способ выделения очищенного концентрата фибриногена, избавленного от вирусов, заключающийся в солюбилизации исходного сырья, представленного криопреципитатом свежезамороженной плазмы человека, осаждении фибриногена 20-30% раствором ПЭГ, растворением отобранного осадка в буфере с цитратом натрия и хлоридом натрия, вирусной инактивации раствора сольвент-детергентным методом в присутствии 1-3% Tween-80 и 0,1-1,5% три-н-бутилфосфата, очистке получившегося концентрата от продуктов вирусной инактивации и сольвент-детергентов экстракцией вазелиновым маслом, проводимой трехкратно, последующем переосаждении полученного концентрата фибриногена 1,0-2,5 М раствором глицина, стерильной фильтрации и лиофильном высушивании с последующим укупориванием лиофилизата под вакуумом и термоинактивацией.