СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ФАКТОРА VIII Российский патент 2005 года по МПК A61K38/37 A61K35/16 

Описание патента на изобретение RU2253475C1

Изобретение относится к области фармацевтической промышленности и биотехнологии и касается способов получения лиофилизированного высокоочищенного препарата фактора VIII из плазмы крови.

Фактор VIII (antihemophilic factor) представляет собой хорошо известный белок плазмы, играющий существенную роль в процессе свертывания крови. Его основным назначением является профилактика и лечение гемофилии А.

Гемофилия А или классическая гемофилия - это генетическое нарушение, связанное с полом передающего и вызывающее недостаток активности фактора свертываемости крови VIII. Различают тяжелую, среднюю и легкую формы гемофилии в соответствии с уровнем фактора VIII. Пациенты с тяжелой формой имеют около или менее 1% (одна единица фактора VIII на децилитр крови) активности фактора. Они склонны к частым кровоизлияниям при небольших или незаметных травмах, особенно в суставы и мускулы. У пациентов со средней формой гемофилии уровень фактора VIII от 2 до 4 ед./дл, у них кровотечения происходят при травмах средней тяжести. У людей с легкой формой гемофилии от 5 до 30 ед./дл фактора VIII и кровотечения происходят при тяжелых травмах или хирургическом вмешательстве. Средний нормальный уровень фактора VIII составляет 100 ед./дл. Норма колеблется от 50 до 180 ед./дл.

Фактор VIII принимает участие в активизации фактора Х в такой последовательности, которая приводит к образованию фибринового сгустка. Его функция измеряется активностью фактора VIII, результатом которой является образование мест фибринового сгущения крови. Фактор VIII циркулирует совместно с фактором Виллебранда (фактор фВ), который его стабилизирует и необходим для нормального приклеивания тромбоцитов к поврежденным стенкам сосудов и для соединения тромбоцитов между собой. Фактор VIII выделяют и используют как отдельно, так и в виде комплекса с фактором Виллебранда.

Концентраты фактора VIII изготавливаются из плазмы крови, полученной в коммерческом процессе от доноров. Для характеристики концентратов используют термин "специфичная активность", что выражается в единицах на один мг белка. Как правило, добавляется альбумин для стабилизации, конечный показатель специфичной активности низкий и поэтому не дает верного представления об эффективности препарата. "Специфическая активность без учета альбумина" - это один из последних показателей уровня очистки, однако с разработкой концентратов фактора VIII высокой очистки, в которых остается фактор Виллебранда, говорят о "специфической активности без учета альбумина и фВ".

Плазма для получения препаратов используется от доноров разных групп крови. В концентратах "средней чистоты", у которых специфическая активность до 10, присутствуют изоагглютинины к красным клеткам антигена А и В. Т-1/2 этих антител длинный, поэтому они накапливаются во время длительных курсов интенсивной терапии (например, после операции) и могут вызывать гемолиз у реципиентов, чья группа крови А, В или АВ. Одни реципиенты гораздо чувствительнее к гемолизу, чем другие. В концентратах высокой очистки уровень изоагглютинина очень низкий.

Концентраты факторов - основной способ лечения тяжелой формы гемофилии А. Аллергические реакции при этом проявляются редко, материал может легко использоваться в программе введения препаратов на дому. Поэтому к данной группе препаратов исследователи проявляют постоянный интерес.

Фактор VIII является белком, поэтому, как и другие белки, применяемые для лечебных целей, он может быть неустойчивым при хранении. Стабильность - одна из проблем, которая решается при разработке новых препаратов. Согласно существующим требованиям восстановленный концентрат должен быть стабилен, по крайней мере, в течение 12 часов.

Другая проблема связана с использованием донорской группы крови - это необходимость защиты реципиентов от инфекции, которая содержится в плазме доноров. В некоторых странах концентраты факторов свертываемости крови изготавливаются из плазмы, полученной от небольшой, тщательно отобранной группы доноров.

В разных странах используют различные тесты проверки плазмы и цельной крови. Проводится анализ плазмы крови на вирус гепатита В, на ВИЧ, на трансаминазы, на антитела к гепатиту С, анализ цельной крови на антитела к гепатиту С. Однако если тесты показывают отрицательный результат, то это еще не гарантирует отсутствие инфекций, так как у доноров может быть просто низкий уровень антител, или обострение инфекции в последний раз протекало без антител ("окно инфицированности"). Некоторые компании-производители концентратов факторов стали проверять концентраты на наличие вирусов, как промежуточный очистительный этап.

К настоящему времени способы удаления опасных вирусов из концентратов значительно усовершенствованы. ВИЧ удаляется с помощью нагревания. Вирусы гепатитов более устойчивы к нагреванию, чем ВИЧ. Концентраты нагревают после лиофилизации и расфасовывают во флаконы при "сухом" жаре 60-100°С, или на пару при температуре 60-80°С после лиофилизации, но до расфасовки во флаконы, или когда концентрат сам жидкий - при температуре 60°С до лиофилизации ("пастеризованный"). Длительность нагревания зависит от выбираемого метода. Плазму можно обрабатывать сольвентно-детергентным методом (СД), который очень эффективен против вирусов с липидной оболочкой, включая ВИЧ, и вирусы гепатитов В и С. Вирусы без оболочки, как гепатита А и В-19 парвовирус, этим методом не уничтожаются. СД метод более распространен, потому что производит хорошее действие и оказывает наименее отрицательное действие на факторы свертываемости крови. Так как были отмечены случаи передачи через концентраты, обработанные СД технологией, вируса гепатита А, то была введена методика двойной инактивации, сочетающая нагревание с СД. Концентраты с двойной инактивацией (СД и пастеризация) стали провоцировать ингибиторы у тех пациентов, которые ранее часто лечились препаратами крови, но относились к группе невысокого риска образования ингибиторов. В настоящее время для концентратов фактора VIII в основном используются СД метод и сухой жар.

Содержание вирусов в концентратах факторов может быть уменьшено также более интенсивной очисткой или сепарацией других компонентов плазмы от факторов свертываемости. С указанной целью могут использоваться моноклональные антитела. Эти концентраты также обрабатываются высокой температурой и СД методом.

В настоящее время выпускаются различные препараты концентрата фактора VIII:

- рекомбинантные - например, Иммунат, фирма Бакстер,

- из человеческой плазмы - в том числе Гемофил М в виде порошка для приготовления инъекционного раствора 250 ME, 500 ME и 1000 ME во флаконах фирмы Бакстер; Коэйт-ХП фирмы Байер; Октави в виде порошка для приготовления инъекционного раствора 250 ME, 500 ME, 1000 ME во флаконах фирмы Октафарма; Эмоклот ДИ в виде порошка для приготовления инъекционного раствора 100 ME и 250 ME во флаконах 5 мл, 500 ME и 1000 ME во флаконах 10 мл фирмы Италко;

- из плазмы животных - factor VIII:C, porcine.

Известные методы получения основаны на методах преципитации, гельпроникающей хроматографии, ионообменной хроматографии и их всевозможных сочетаниях.

Например, известен способ получения препарата фактора VIII, свободного от изоагглютинина, включающий растворение криопреципитата в растворе, содержащем хлорид натрия, глицин и гепарин, добавление суспензии алюминия гидрооксида, пастеризацию раствора, содержащего фактор VIII в присутствии стабилизатора, обработку ионно-обменным методом с использованием буферных растворов, диализ преципитата, нагревание и фильтрационную стерилизацию с последующей сушкой вымораживанием (патент США 5043428 А).

Известен также способ получения высокоочищенного фактора VIII из плазмы крови путем получения криопреципитата, его растворения в гепаринизированной воде, обработкой суспензией алюминия гидрооксида и затем ПЭГ-4000 при рН 6,4-6,6, обработкой супернатанта ионно-обменной смолой с использованием буфера, стабилизации выделенного фактора альбумином, гепарином, ПЭГ-4000 и, оптимально, лизином или гистидином, концентрирования, диафильтрации, пастеризации и лиофилизации (патент США 5259951 А).

В качестве наиболее близкого аналога (прототипа) может быть указан способ получения концентрата фактора VIII, включающий суспендирование криопреципитата плазмы человека в водном растворе гепарината натрия, при содержании фактора VIII со специфической активностью между 0,6 и 1,1 IU/мг, рН 7-7.1, очистку гелем алюминия гидрооксида, стерилизующую фильтрацию супернатанта, инактивирующую вирусы обработку сольвентно-детергентным методом в присутствии твина-TNBP, адсорбцию предочищенного раствора на хроматографической колонке с фрактогелем, выделение с использованием буферного раствора, дополнительно содержащего натрия хлорид, лиофилизацию (патент США 5252709 А).

Задача настоящего изобретения заключалась в оптимизации процесса очистки препарата от балластных веществ и вирусной инактивации с целью сохранения высокой специфической активности фактора VIII целевого продукта и повышения устойчивости при хранении.

Указанная задача решается новым способом получения лиофилизированного высокоочищенного препарата фактора VIII из плазмы крови.

Способ получения препарата представляет собой очистку криопреципитата донорской плазмы крови от балластных белков обработкой гидроокисью алюминия и полиэтиленгликолем-4000 (ПЭГ-4000) с последующим хроматографическим фракционированием на DEAE-содержащем носителе с использованием буферных растворов разной ионной силы для получения концентрата фактора VIII, который стабилизируют, стерилизуют и переводят в лиофилизированную форму. Вирусная инактивация производится обработкой раствора криопреципитата сольвент-детергентом и термообработкой лиофилизата.

Предложенное сочетание и последовательность стадий очистки, условия обработки и фракционирования в предлагаемом способе позволяют решить трудности, связанные с проведением лиофилизации, а именно самим процессом, сохранением активности при сушке, устойчивости при дальнейшем хранении, а также возможностью получать быстро раствор при разбавлении лиофилизата при применении.

Способ включает следующие стадии:

- получение криопреципитата из плазмы крови;

- растворение криопреципитата в водном растворе, содержащем антикоагулянт, такой как гепарин, рН 6,3-7,3;

Нижний порог содержания фактора VIII в криопреципитате 30-35 МЕ/г

- обработка раствором гидроокиси алюминия;

- центрифугирование;

- обработка раствором ПЭГ-4000 и коррекция рН до 6,55-6,65, без последующего охлаждения, и отделение супернатанта;

- вирусная инактивация сольвент-детергентом;

- микрофильтрация;

- фракционирование в хроматографической колонне с DEAE-содержащем носителе, включающее загрузку, элюцию буферным раствором с добавлением натрия хлорида с начальной концентрацией ионов натрия в буферном растворе 106-112 ммоль/л, увеличением ее до 132-137 ммоль/л и конечной концентрацией 256-270 ммоль/л;

- стабилизация полученного раствора фактора VIII добавлением раствора альбумина;

- стерильная микрофильтрация;

- лиофильная сушка и термическая вирусная инактивация.

Для регулирования рН в способе предпочтительно использование 0.5 М раствора уксусной кислоты.

При осуществлении очистки предпочтительна конечная концентрация в растворе криопреципитата гидрооксида алюминия 0,3%, ПЭГ-4000 - 2%.

В качестве сольвент-детергента добавляют, как правило, трибутилфосфат натрия и твин.

Микрофильтрацию после вирусной инактивации проводят оптимально в 3 этапа через мембранные микрофильтры с размерами пор 2-8 мкм, 1,2 мкм и, наконец, 0,65 мкм.

При фракционировании могут быть использованы в качестве ионно-обменного носителя различные смолы, имеющие фиксированные группы DEAE, например Фрактогель фирмы Merck, DEAE-650M фирмы Toson Biosep.

Буферный раствор, используемый для фракционирования, содержит оптимально Трис, цитрат натрия, хлорид кальция, лизин, глицин, натрия хлорид, воду для инъекций, рН 6,75-6,85. Он может также содержать дополнительно гистидин, может вводиться глюкоза. Предпочтительно буфер содержит 0,014-0,027М лизина и 0,11-0,15М глицина.

Одним из условий фракционирования является изменение концентрации натрия хлорида в сторону увеличения. Данный прием использовался и в известных способах. Однако условия фракционирования согласно предложенному способу позволили оптимизировать процесс, увеличить выход продукта и не потерять специфическую активность.

В приведенной ниже таблице 1 представлены параметры используемых буферов в процессе выделения фактора VIII.

Таблица 1БуферрНКонцентрация Na+, ммоль/лПроводимость, мСименсначальный6,75-6,85106-112до 12,5промежуточный6,75-6,85132-13714-15конечный6,75-6,85256-27024-26

Термическая вирусная инактивация проводится после получения лиофилизата, способствует повышению степени очистки конечного продукта.

Ниже представлен конкретный пример осуществления изобретения.

Пример 1

Нативную плазму донорской крови, имеющую отрицательную реакцию на антитела к ВИЧ, вирусу гепатита С, возбудителю сифилиса и Нbс-антигену, подвергают криоосаждению при температуре +3°С, отделяют и охлаждают. Криопреципитат выдерживают 1 час при комнатной температуре, измельчают и заливают раствором гепарина в воде для инъекций (2 МЕ/мл). Перемешивают при 25°С 15 минут магнитной мешалкой. Устанавливают рН 6,75-6,85 и термостатируют 45 минут. Добавляют 3% раствор гидроокиси алюминия до конечной концентрации 0,3%, затем проводят перемешивание при 23-27°С 15 минут. Раствор центрифугируют на центрифуге Ц14 со скоростью 4000 об/мин в течение 10 минут при температуре 20°С. Вводят раствор ПЭГ в 0,01 М цитрате натрия до конечной концентрации 2%, затем рН доводят до 6,55-6,65 с помощью 0,5 М уксусной кислоты. Цетрифугируют. Добавляют раствор трибутилфосфата натрия и твина, инкубируют 6 часов, добавляют раствор 2 М хлорида натрия до проводимости 11,6 мСименс, устанавливают рН до 6,8 0,5 М раствором Трис. Фильтруют через мембранные микрофильтры: 2-8 мкм, 1,2 мкм, 0,65 мкм. Передают раствор на стадию фракционирования. Стадия включает загрузку насосом; промывку стартовым буфером (0,01 М Трис, 0,02 М цитрата натрия, 0,0025 М хлорида кальция, 0,016 М лизина, 0,12 М Глицина, 0,063 М натрия хлорида, вода для инъекций); промывку буфером В от остатка балластных белков (0,01 М Трис, 0,02 М цитрата натрия, 0,0025 М хлорида кальция, 0,016 М лизина, 0,12 М Глицина, 0,091 М натрия хлорида, вода для инъекций); элюирование целевого продукта (0,01 М Трис, 0,02 М цитрата натрия, 0,0025 М хлорида кальция, 0,016 М лизина. 0,12 М Глицина, 0,220 М натрия хлорида, вода для инъекций); промывку колонны 2 М раствором натрия хлорида. Скорость элюции 3,2 л/ч, при давлении не выше 1 атм, при комнатной температуре. Добавляют 10% раствор альбумина до концентрации 0,1%. Выход по основному веществу 26820 ME (40,5%). Стерилизуют через стерилизующую капсулу с диаметром пор 0,22 мкм. Общий белок 0,5-1 мг/мл, специфическая активность 15-20 МЕ/мл, ионы натрия 150-220 ммоль/л, рН 6,75-6,85. Выход по основному веществу 26284 МЕ (98%). Проводят заморозку -50°С, давление 1 бар, 7,5 часов, лиофилизация - 20 - +30°С при давлении 60 мкбар в течение 40,5 часов, инактивация при 60°С и давлении 60 мкбар в течение 72 часов. Выход концентрата по основному веществу 17280 МЕ (66%).

Для определения специфической активности фактора VIII используется одностадийный метод определения содержания фактора VIII в плазме с использованием стандарта фактора. Для этого смешивают равные объемы взвеси каолина в эритрофосфатиде, субстратной плазмы, стандарта фактора VIII, инкубируют смесь при температуре 37°С и добавляют хлорид кальция, определяя время образования плотного сгустка. Расчет концентрации фактора VIII в % в зависимости от времени образования сгустка производят по калибровочному графику. Его строят на основании данных, полученных при определении времени свертывания в пробах с различным содержанием стандарта фактора VIII.

Специфическая активность полученного концентрата не изменялась после проведения лиофилизации и вирусной инактивации и составила 15-20 МЕ/мл.

Предложенный способ позволяет получить препарат, по своей эффективности не уступающий лучшим зарубежным аналогам, и может быть рекомендован для промышленного использования.

Похожие патенты RU2253475C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА ФАКТОРА VIII ИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА 2010
  • Воробьев Андрей Иванович
  • Берковский Арон Леонидович
  • Юрьев Андрей Серафимович
  • Голубев Евгений Михайлович
  • Ципилева Татьяна Александровна
  • Сергеева Елена Владимировна
RU2445974C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСБЕЗОПАСНОГО ПОЛНОГО ПРОТРОМБИНОВОГО КОМПЛЕКСА 2014
  • Исеркапов Артем Вакилевич
  • Берковский Арон Леонидович
  • Голубев Евгений Михайлович
  • Дереза Татьяна Леонидовна
  • Кутюрова Оксана Георгиевна
  • Шастина Наталья Сергеевна
  • Швец Виталий Иванович
RU2559576C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИОФИЛИЗИРОВАННОГО ПРЕПАРАТА АКТИВИРОВАННОГО ПРОТРОМБИНОВОГО КОМПЛЕКСА, ОБЛАДАЮЩЕГО ФАКТОР VIII-ШУНТИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ 2017
  • Берковский Арон Леонидович
  • Голубев Евгений Михайлович
  • Дереза Татьяна Леонидовна
  • Сергеева Елена Владимировна
  • Кутюрова Оксана Георгиевна
  • Суворов Александр Владимирович
  • Джулакян Унан Левонович
  • Исеркапов Артем Вакильевич
  • Швец Виталий Иванович
RU2648517C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА ТРОМБИНА 2014
  • Берковский Арон Леонидович
  • Суворов Александр Владимирович
  • Голубев Евгений Михайлович
  • Сергеева Елена Владимировна
  • Дереза Татьяна Леонидовна
  • Кутюрова Оксана Георгиевна
  • Хурдин Вячеслав Викторович
  • Слободян Анастасия Викторовна
RU2583931C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА ФИБРИНОГЕНА 2013
  • Берковский Арон Леонидович
  • Суворов Александр Владимирович
  • Голубев Евгений Михайлович
  • Сергеева Елена Владимировна
  • Хурдин Вячеслав Викторович
  • Слободян Анастасия Викторовна
RU2556804C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ С1-ЭСТЕРАЗНОГО ИНГИБИТОРА ЧЕЛОВЕКА И ПРОДУКТ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В МЕДИЦИНЕ 2004
  • Игонин А.А.
  • Пальцева Е.М.
  • Уваров В.Ю.
  • Иванов А.А.
  • Сергеева Е.В.
  • Берковский А.Л.
RU2256464C1
СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ В ВЫСОКОЙ СТЕПЕНИ ВИРУСОБЕЗОПАСНЫХ КОМПОНЕНТОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФИБРИНОВОГО КЛЕЯ ИЗ ПУЛА ПЛАЗМЫ ЧЕЛОВЕКА 1998
  • Буи-Хак Трунг
RU2236237C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА VIII ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И ПРОДУКТ ЕГО СОДЕРЖАЩИЙ 2007
  • Игонин Антон Алексеевич
  • Уваров Валентин Юрьевич
  • Пальцева Екатерина Михайловна
  • Иванов Алексей Алексеевич
RU2326689C1
Способ разделения белков крови 1990
  • Тьерри Бюрнуф
  • Марианна Бюрнуф
SU1837880A3
ПРОТИВОВИРУСНЫЙ ПРЕПАРАТ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ВИРУСНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 1999
  • Петров В.Ф.
  • Николаева А.М.
  • Казьянин А.В.
  • Пархоменко Т.Г.
  • Борисова В.Н.
  • Мельников В.А.
  • Буданов М.В.
RU2144379C1

Реферат патента 2005 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ФАКТОРА VIII

Изобретение относится к области фармацевтической промышленности и биотехнологии. Способ получения препарата фактора VIII заключается в следующем: криопреципитат донорской плазмы крови суспендируют в водном растворе гепарина, проводят очистку от балластных белков обработкой гидроокисью алюминия при его конечной концентрации в растворе 0,3%, затем полиэтиленгликолем-4000 (ПЭГ4000) при его конечной концентрации 2%, осуществляют вирусную инактивацию сольвентно-детергентным методом в присутствии твина, микрофильтрацию с последующим хроматографическим фракционированием на DEAE-содержащем носителе с использованием буферных растворов рН 6,75-6,85 с разной ионной силой. Полученный концентрат фактора VIII стабилизируют раствором альбумина до его конечной концентрации в препарате 0,1%, стерилизуют микрофильтрацией и переводят в лиофилизированную форму, в которой дополнительно инактивируют вирусы термообработкой. Предложенный способ позволяет сохранить высокую специфическую активность фактора VIII при высокой степени очистки препарата и обеспечить устойчивость при хранении. 4 з.п. ф-лы, 1 табл.

Формула изобретения RU 2 253 475 C1

1. Способ получения препарата концентрата фактора VIII, включающий криоосаждение плазмы крови человека, суспендирование выделенного криопреципитата в водном растворе антикоагулянта, очистку обработкой гидрооксидом алюминия, инактивирующую вирусы обработку сольвентно-детергентным методом в присутствии твина, адсорбцию предочищенного раствора методом хроматографии с использованием ионно-обменной смолы, содержащей DEAE фиксированные группы, элюирование буферным раствором, содержащим натрия хлорид, лиофилизацию, отличающийся тем, что в качестве антикоагулянта используют гепарин при рН 6,3-7,3, добавляют гидроокись алюминия до ее концентрации в растворе криопреципитата 0,3%, затем проводят дополнительную очистку раствором ПЭГ-4000 при его конечной концентрации 2% с последующим установлением рН 6,55-6,65, после вирусной инактивации осуществляют микрофильтрацию, элюируют адсорбированный фактор VIII буферным раствором, рН 6,75-6,85, с добавлением натрия хлорида с начальной концентрацией ионов натрия в буферном растворе 106-112 ммоль/л, увеличением ее до 132-137 ммоль/л и конечной концентрацией 256-270 ммоль/л, стабилизируют полученный концентрат фактора VIII добавлением раствора альбумина до его конечной концентрации в препарате 0,1%, фильтруют через стерилизующий микрофильтр, полученный лиофилизированный концентрат подвергают дополнительной термической вирусной инактивации.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что микрофильтрацию после вирусной инактивации проводят оптимально в 3 этапа через мембранные микрофильтры с размерами пор 2-8 мкм, 1,2 мкм и 0,65 мкм соответственно.3. Способ по п.1 или п.2, отличающийся тем, что буферный раствор, используемый для элюирования, содержит трис, цитрат натрия, хлорид кальция, лизин, глицин, натрия хлорид, воду для инъекций.4. Способ по п.3, отличающийся тем, что буферный раствор содержит 0,014-0,027 М лизина и 0,11-0,15 М глицина.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что содержание фактора VIII в криопреципитате составляет не менее чем 30-35 МЕ/г.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2005 года RU2253475C1

US 5252709 A1 12.10.1993
US 5259951 A1 09.11.1993
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА ФАКТОРА VIII И ФАКТОРА ФОН ВИЛЛЕБРАНДА 1990
  • Мариана Бюрнуф-Радосевич[Fr]
  • Тьерри Бюрнуф[Fr]
RU2025129C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ С ПОМОЩЬЮ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ВИРУСНО-ИНАКТИВИРОВАННОЙ ФРАКЦИИ, СОДЕРЖАЩЕЙ ФАКТОР VIII 1994
  • Странчар Алеш
  • Штадлер Моника Андреа
  • Йозич Дьюро
RU2148411C1
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ВЫСОКООЧИЩЕННОГО КОМПЛЕКСА ФАКТОРА VIII ФАКТОРА ВИЛЛЕБРАНДА 1993
  • Моника Штадлер[At]
  • Хорст Швинн[De]
RU2096414C1
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛОКАЛЬНЫХ МАГНИТНЫХ АНОМАЛИЙ 1972
SU434354A1
US 5245014 A1 14.09.1993.

RU 2 253 475 C1

Авторы

Ажигирова М.А.

Берковский А.Л.

Сергеева Е.В.

Дереза Т.Л.

Фетисова Л.В.

Гладун В.В.

Даты

2005-06-10Публикация

2004-02-02Подача