ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Данная заявка притязает на приоритет предварительной заявки на патент США серийный No. 61/209854, зарегистрированной 11 марта 2009, раскрытие которой включено в настоящий документ путем отсылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение в целом относится к области поддержки с помощью питания здоровья и продолжительности жизни животных. В особенности изобретение обеспечивает способы разработки тканеспецифических универсальных биомаркеров старения у животных, а также наборы надежных биомаркеров идентифицируемых этими способами и применение тканеспецифических универсальных биомаркеров старения для идентификации питательных веществ и других функциональных ингредиентов или агентов, обладающих омолаживающими свойствами у животных.
Уровень техники
Было показано, что ограничение в потреблении калорий в количествах, существенно ниже уровня ad libitum, увеличивает продолжительность жизни, снижает или откладывает наступление многих возрастных состояний, улучшает устойчивость к стрессу и замедляет функциональное ухудшение здоровья у многих видов животных, включая млекопитающих, таких как грызуны и приматы (см., например, D.K. Ingram et al. (2004) Ann. N.Y. Acad. Sci. 1019: 412-423). Безусловно, проводили клинические испытания для оценки влияния на увеличение продолжительности жизни в результате ограничений в потреблении калорий (CR) у людей. Но у людей, также как и у животных, кажется маловероятным, что CR представляет собой эффективную стратегию для увеличения продолжительности жизни для большинства индивидуумов из-за степени и продолжительности необходимых ограничений. По этой причине исследование было сосредоточено на идентификации веществ, например, фармацевтических агентов, питательных веществ и им подобных, способных имитировать эффект CR без существенного изменения в пищевом рационе.
Усилия были направлены на поиск агентов, которые могут имитировать один или несколько физиологических или биохимических эффектов CR (см., например, Ingram et al., 2004, supra) или которые могут имитировать профиль генной экспрессии, ассоциированных с CR в определенных тканях и органах (например, Spindler, U.S. Patent 6,406,853; U.S. Patent Pub. 2003/0124540). В связи с последним, были раскрыты способы анализа генов, ассоциированных с CR, и скрининга CR-миметиков, на основании профиля генной экспрессии (Spindler et al., публикация патента США 2004/0180003, 2004/0191775 и 2005/0013776; Pan et al., публикация патента США 2007/0231371).
Несмотря на доступность изложенных выше подходов, сохраняется необходимость в более надежных, быстрых и менее дорогостоящих способах скрининга агентов, способных замедлить или обратить процесс старения, препятствовать преждевременному старению и увеличить продолжительности жизни. Настоящее изобретение отвечает этому требованию.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Следовательно, цель настоящего изобретения заключается в обеспечении способов идентификации надежных и универсально применимых маркеров экспрессии генов старения в выбранных тканях и в обеспечении наборов надежных и универсально применимых маркеров экспрессии генов, идентифицируемых этими способами.
Другая цель изобретения заключается в обеспечении одного или нескольких генов или сегментов гена, которые дифференциально экспрессируются в выбранных тканях старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами.
Дополнительная цель изобретения заключается в обеспечении набора, включающего множество полинуклеотидов, которые дифференциально экспрессируются в выбранных тканях старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами.
Другая цель изобретения заключается в обеспечении композиций из двух или нескольких полинуклеотидных или полипептидных зондов, подходящих для детекции экспрессии генов, дифференциально экспрессируемых в выбранных тканях старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами и устройств, таких как чипы, содержащие зонды на подложке.
Дополнительная цель изобретения заключается в обеспечении способов детекции дифференциальной экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в выбранных тканях старых субъектов, по сравнению с молодыми субъектами или стандартным контрольным образцом.
Другая цель изобретения заключается в обеспечении способа измерения эффекта тестируемого вещества на профиле экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в выбранных тканях старых субъектов, по сравнению с молодыми субъектами или стандартным контрольным образцом.
Одну или несколько из этих целей достигают, применяя новые способы идентификации тканеспецифических биомаркеров старения и новые комбинации полинуклеотидов или полипептидов, представляющих собой гены и сегменты гена, которые дифференциально экспрессируются в выбранных тканях старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами. Полинуклеотиды применяют для получения композиций, зондов, устройств, основанных на зондах, и способов определения статуса полинуклеотидов, дифференциально экспрессируемых в выбранных тканях старых субъектов, по сравнению с молодыми субъектами или стандартным контрольным образцом, которые полезны для достижения вышеуказанных целей, например, для прогнозирования и диагностирования возрастных состояний в выбранных тканях и скрининга веществ для определения того, действительно ли они обладают омолаживающим эффектом в определенных тканях. Также обеспечивают разнообразные наборы, включающие комбинации зондов, устройства, в которых применены зонды, и вещества, а также различные компьютерные программы, содержащие информацию по применению, и средства коммуникации для передачи информации, имеющей отношение к дифференциально экспрессируемым генам и способам их применения.
Другие и дополнительные цели, признаки и преимущества изобретения легко понятны специалистам в этой области техники.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
Для применения в настоящем документе, диапазоны указаны в сокращенном виде, для того, чтобы избежать необходимости приводить длинный вариант и описывать все, без исключения, величины внутри диапазона. В зависимости от ситуации может быть выбрана любая подходящая величина внутри диапазона, подходящая в качестве верхнего значения, нижнего значения или границы диапазона. Ясно, что все без исключения, целые или дробные числа между любыми диапазонами или интервалами, приведенными в этой заявке, включены в эту заявку.
Используемое здесь и в прилагаемой формуле изобретения слово в единственном числе включает множественное число и, наоборот, кроме тех случаев, когда контекст ясно указывает на иное. Например, ссылка на «животное», «способ» или «вещество» включает множество таких «животных», «способов» или «веществ». Сходным образом, слова «включают», «включает» и «включающий» следует интерпретировать скорее включительно, чем исключительно.
Термин «животное» означает человека или другое животное, включая птиц, крупный рогатый скот, собак, лошадей, кошек, коз, мышей, овец и свиней. Если термин применяют в контексте сравнения исследуемых субъектов, то животные, которых сравнивают, представляют собой животных одних и тех же видов и, при возможности, одной и той же расы или породы. «Животное-компаньон» представляет собой любое домашнее животное и включает, без ограничения, кошек, собак, кроликов, морских свинок, хорьков, хомяков, мышей, песчанок, лошадей, коров, коз, овец, ослов, свиней и им подобных. Предпочтительно, животное представляет собой человека или животное-компаньона, такое как собака или кошка.
Термин «антитело» означает любой иммуноглобулин, который связывается со специфическим антигеном, и включает антитела IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Термин включает поликлональные, моноклональные, моновалентные, гуманизированные антитела, гетероконъюгаты, композиции антител с полиэпитопной специфичностью, химерные, биспецифичные антитела, диатела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител, такие как Fab, Fab', F(ab')2 и Fv или другие антигенсвязывающие фрагменты.
Термин «панель» означает упорядоченное расположение, по меньшей мере, двух зондов на подложке. По меньшей мере, один зонд представляет собой контрольный или стандартный зонд, и, по меньшей мере, один зонд представляет собой диагностический зонд. Размещение от примерно двух до примерно 40000 зондов на подложке гарантирует, что размер и интенсивность сигнала от каждого меченого комплекса, сформированного между зондом и полинуклеотидом или полипептидом образца, индивидуально различимы.
Термин «комплекс связывания» означает комплекс, формирующийся, когда полипептид в образце специфически связывается (как определено в этой заявке) с партнером по связыванию, таким как антитело или его функциональный фрагмент.
Термин «ограничение в калориях» или «ограничение в калорийности» означает любой режим питания с низким содержанием калорий, без недоедания. В целом, ограничение касается общего содержания калорий, получаемых из углеводов, жиров и белков. Ограничение обычно составляет, хотя не ограничивается, примерно от 25% до примерно 40% от калорийности потребляемой пищи по сравнению с калорийностью потребления ad libitum.
Термин «пищевая добавка» означает продукт, который предназначен для потребления в дополнении к нормальной диете животного. Пищевые добавки могут находиться в любой форме, например, в твердой, жидкой форме, в форме геля, таблеток, капсул, порошка и им подобных. Предпочтительно, их обеспечивают в подходящих лекарственных формах. В некоторых воплощениях их обеспечивают в упаковках для крупных потребителей, таких как нерасфасованные порошки или жидкости. В других воплощениях, добавки обеспечивают крупными партиями для включения в другие пищевые продукты, такие как сухие завтраки, лакомства, батончики с добавками, напитки и им подобные.
Термин «дифференциальная экспрессия» или «дифференциально экспрессируемый» означает увеличенную или повышенную экспрессию гена или означает ослабленную или сниженную экспрессию гена, которую детектируют по отсутствию, присутствию или, по меньшей мере, двукратному изменению в количестве транскрибируемой информационной РНК или транслируемого белка в образце.
Термин «эффективное количество» означает количество соединения, материала, композиции, лекарственного средства или другого материала, которое эффективно для достижения определенного биологического результата, такого как обращение или замедление старения в выбранной ткани, как описано в этой заявке.
Термин «пища» или «пищевая композиция» означает композицию, которая предназначена для поглощения животным, включая человека, и обеспечивает его питание. Использованное в этой заявке определение «пищевой продукт, разработанный для потребления человеком», представляет собой любую композицию, специфически предназначенную для поглощения человеком. «Корма для животных» представляют собой композиции, предназначенные для потребления домашними животными, предпочтительно, животными-компаньонами. «Полный и сбалансированный по питательным веществам корм для животных» представляет собой такой корм, который содержит все известные необходимые питательные вещества для предполагаемого получателя или потребителя корма, в подходящих количествах и пропорциях, основанных, например, на рекомендациях признанных авторитетов в области питания животных-компаньонов. Такие корма, следовательно, способны служить в качестве единственного источника пищевого рациона для поддержания жизни или стимуляции продуктивности, без добавления дополнительных питательных источников. Композиции сбалансированного по питательным веществам корма для животных широко известны и широко применяются в этой области техники.
Термин «фрагмент» означает (1) олигонуклеотидную или полинуклеотидную последовательность, которая представляет собой часть полной последовательности и которая обладает такой же или сходной активностью при определенном применении, как и полная полинуклеотидная последовательность; или (2) пептидная или полипептидная последовательность, которая представляет собой часть полной последовательности и которая обладает такой же или сходной активностью при специфическом применении, как и полная полипептидная последовательность. Такие фрагменты могут включать любое число нуклеотидов или аминокислот, которые считаются подходящими для специфического применения. Обычно, олигонуклеотидные или полинуклеотидные фрагменты содержат, по меньшей мере, примерно 10, 50, 100 или 1000 нуклеотидов, и полипептидные фрагменты содержат, по меньшей мере, примерно 4, 10, 20 или 50 последовательных аминокислот из полной последовательности. Термин охватывает варианты фрагментов полинуклеотидов и полипептидов.
Термин «ген» или «гены» означает полный или частичные сегмент ДНК, вовлеченный в продуцирование полипептида, включая участки, предшествующие кодирующей области и следующие за ней (лидерный и трейлерный) и промежуточные последовательности (интроны) между индивидуальными кодирующими сегментами (экзонами). Термин охватывает любую последовательность ДНК, которая гибридизуется с комплементарной цепью, кодирующей последовательности гена.
Термин «генный продукт» означает продукт транскрипции гена, такой как мРНК или ее производные (например, кДНК), или трансляции генного транскрипта. Термин «генный продукт» обычно означает продукт трансляции, который представляет собой белок. Термин «генный продукт» может быть применен взаимозаменяемо с термином «белок» в этой заявке.
Термин «гомолог» означает (1) полинуклеотид, включая полинуклеотиды из одинаковых или разных видов животных, имеющий более чем 30%, 50%, 70% или 90% сходства в последовательности с полинуклеотидом сравнения и имеющий одинаковые или существенно сходные свойства и демонстрирующий одинаковую или существенно сходную с полинуклеотидом сравнения функцию, или обладающий способностью специфически гибридизоваться с полинуклеотидом сравнения в жестких условиях; или (2) полипептид, включая полипептиды из одинаковых или разных видов животных, имеющий более чем 30%, 50%, 70% или 90% сходства в последовательности с полипептидом сравнения и имеющий одинаковые или существенно сходные свойства и демонстрирующий одинаковую или существенно сходную с полипептидом сравнения функцию, или обладающий способностью специфически связываться с полипептидом сравнения. При отсылке к фрагментам полноразмерной кодирующей последовательности, функция этих фрагментов может просто заключаться в кодировании выбранной части полипептида определенной последовательность или, соответственно, быть сходной последовательностью для гибридизации с другим полинуклеотидным фрагментом, кодирующим этот полипептид. При отсылке к фрагментам полипептида, функция этих фрагментов может просто заключаться в формировании эпитопа, подходящего для генерации антитела. Сходства в последовательности двух полипептидных последовательностей или двух полинуклеотидных последовательностей определяют, применяя способы, известные специалистам в этой области техники, например, алгоритм Karlin и Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268 (1990)). Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). Для получения выравниваний с разрывами для целей сравнения, может быть применена программа Gapped Blast, как описано у Altschul et al. (Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). При применении программ BLAST и Gapped BLAST, применяют параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). Смотри .
Термин «гибридизационный комплекс» означает комплекс, который формируется между полинуклеотидами образца, когда пурины одного полинуклеотида образуют водородные связи с пиримидинами комплементарного полинуклеотида, например, пар оснований 5'-A-G-T-C-3' с 3'-T-C-A-G-5'. Степень комплементарности и применение аналогов нуклеотидов определяют эффективность и жесткость условий реакции гибридизации.
Термин «совместно» означает, что лекарственный препарат, пищу или другое вещество вводят животному (1) вместе, в композиции, в частности, в пищевой композиции или (2) отдельно, с одинаковой или разной частотой, применяя одинаковые или разные пути введения за примерно одинаковое время или периодически. «Периодически» означает, что вещество вводят по схеме применения, приемлемой для специфического вещества. «Примерно одинаковое время» обычно означает, что вещество (пища или лекарственный препарат) вводят в одинаковое время или в течение примерно 72 часов друг от друга. «Совместно» специфически включает схемы введения, при которых вещества, такие как лекарственные препараты, вводят в течение указанного периода, а композиции изобретения вводят в течение неопределенного периода времени.
Термин «индивидуальный», при ссылке на животное, означает индивидуальное животное любого вида или типа. Этот термин может быть применен взаимозаменяемо с термином «субъект».
Термин «долгожительство» обычно означает продолжительность жизни за пределами средней прогнозируемой продолжительности жизни для определенного вида или для определенной линии, породы или этнической группы внутри этого вида, если существуют различия внутри вида. «Улучшенная продолжительность жизни» или «увеличенная продолжительность жизни» означает любое существенное удлинение продолжительности жизни определенного животного за пределами средней прогнозируемой продолжительности жизни для вида, к которому животное принадлежит.
Термин «полинуклеотид» или «олигонуклеотид» означает полимер нуклеотидов. Термин охватывает молекулы ДНК и РНК (включая кДНК и мРНК), как одноцепочечные, так и двухцепочечные, и, если одноцепочечные, то с комплементарной последовательностью как в линейной, так в кольцевой форме. Термин также охватывает фрагменты, варианты, гомологи и аллели, как подходящие для последовательностей, которые имеют одинаковые или существенно сходные свойства и демонстрируют одинаковую или существенно сходную с оригинальной последовательностью функцию. В особенности, термин охватывает гомологи из различных видов, например, из мыши и собаки или кошки. Последовательности могут быть полностью комплементарны (без ошибочно спаренных оснований) при выравнивании или могут иметь вплоть до примерно 30% ошибочно спаренных оснований в последовательности. Предпочтительно, для полинуклеотидов, цепь содержит от примерно 50 до 10000 нуклеотидов, более предпочтительно от примерно 150 до 3500 нуклеотидов. Предпочтительно, для олигонуклеотидов, цепь содержит от примерно 2 до 100 нуклеотидов, более предпочтительно от примерно 6 до 30 нуклеотидов. Точный размер полинуклеотида или олигонуклеотида будет зависеть от различных факторов и от конкретного приложения и применения полинуклеотида или олигонуклеотида. Термин включает нуклеотидные полимеры, которые синтезируют, и которые изолируют и очищают из природных источников. Термин «полинуклеотид» включает термин «олигонуклеотид».
Термин «полипептид», «пептид» или «белок» означает полимер аминокислот. Термин охватывает природные и неприродные (синтетические) полимеры и полимеры, в которых одна или несколько аминокислот заменены искусственными химическими миметиками. Термин также охватывает фрагменты, варианты и гомологи, которые имеют одинаковые или существенно сходные свойства и демонстрируют одинаковую или существенно сходную с оригинальной последовательностью функцию. Термин охватывает полимеры любой длины, предпочтительно полимеры, содержащие от примерно 2 до 1000 аминокислот, более предпочтительно от примерно 5 до 500 аминокислот. Термин включает полимеры аминокислот, которые синтезируют и которые изолируют и очищают из природных источников.
Термин «зонд» означает (1) олигонуклеотид или полинуклеотид, как РНК, так и ДНК, или природный в виде очищенного после ферментативного расщепления полинуклеотида, или полученный с помощью синтеза, который способен к отжигу с полинуклеотидом с последовательностями, комплементарными зонду, или способен специфически гибридизоваться с ним, или (2) соединение или вещество, включая пептид или полипептид, способные специфически связываться с определенным белком или фрагментом белка с существенным исключением других белков или фрагментов белков. Олигонуклеотидный или полинуклеотидный зонд может быть как одноцепочечный, так и двухцепочечный. Точная длина зонда будет зависеть от многих факторов, включая температуру, источник и применение. Например, для диагностического применения, в зависимости от сложности целевой последовательности, олигонуклеотидный зонд обычно содержит примерно от 10 до 100, от 15 до 50 или от 15 до 25 нуклеотидов. В некоторых диагностических приложениях, полинуклеотидный зонд содержит примерно 100-1000, 300-600 нуклеотидов, предпочтительно примерно 300 нуклеотидов. Зонды в этой заявке выбирают так, чтобы они были «в значительной степени» комплементарны разным нитям определенной последовательности-мишени. Это означает, что зонды должны быть в достаточной мере комплементарны для специфической гибридизации или отжига с их соответствующими последовательностями-мишенями в заранее заданном наборе условий. Следовательно, последовательность-зонд не должна быть полностью комплементарна последовательности мишени. Например, некомплементарный нуклеотидный фрагмент может быть присоединен к 5'- или 3'-концу зонда, тогда как оставшаяся последовательность зонда будет комплементарной последовательности-мишени. Альтернативно, некомплементарные основания или более длинные последовательности могут быть включены в последовательность зонда, если последовательность-зонд в достаточной степени комплементарна последовательности полинуклеотида-мишени для специфического отжига с полинуклеотидом-мишенью. Пептид или полипептидный зонд может представлять собой любую молекулу, с которой белок или пептид специфически связывается, включая ДНК (для ДНК-связывающих белков), антитела, рецепторы клеточной мембраны, пептиды, кофакторы, лектины, сахара, полисахариды, клетки, клеточные мембраны, органеллы и мембраны органелл.
Термин «образец» означает любую ткань или жидкость животного, содержащие, например, полинуклеотиды, полипептиды, антитела, метаболиты и им подобных, включая клетки и другие ткани, содержащие ДНК и РНК. Примеры включают жировую ткань, кровь, хрящ, соединительную ткань, эпителиальную ткань, лимфоидную ткань, мышцы, нервы, мокроту и им подобные. Образец может быть твердым или жидким и может представлять собой ДНК, РНК, кДНК, жидкости организма, такие как кровь или моча, клетки, клеточные препараты или растворимые фракции или аликвоты их среды, хромосомы, органеллы и им подобные.
Термин «разовая упаковка» означает, что компоненты набора физически собраны в один или несколько контейнеров или связаны с ним и рассматриваются как единица для производства, распространения, продажи или применения. Контейнеры включают, но не ограничиваются, мешки, коробки, бутылки, упаковки в термоусадочной пленке, скрепленные металлическими скрепками или иным образом зафиксированные компоненты или их комбинации. Разовая упаковка может представлять собой контейнеры с индивидуальными пищевыми композициями, физически присоединенными так, чтобы их рассматривали как единицу для производства, распространения, продажи или применения.
Термин «специфически связывается» означает специальное и точное взаимодействие между двумя молекулами, которое зависит от их структуры, в частности, от боковых групп их молекул. Например, интеркаляция регуляторного белка в большую бороздку молекулы ДНК, образование водородных связей вдоль углеродного скелета между двумя одноцепочечными нуклеиновыми кислотами или связывание между эпитопом белка и агонистом, антагонистом или антителом.
Термин «специфически гибридизуется» означает ассоциацию двух одноцепочечных полинуклеотидов, имеющих в достаточной мере комплементарные последовательности (иногда определяемых как «в значительной степени комплементарные»), так чтобы произошла гибридизация в заранее определенных условиях, обычно применяемых в этой области техники. Например, термин может означать гибридизацию полинуклеотидного зонда с в значительной степени комплементарной последовательностью, которая содержится в молекуле одноцепочечной ДНК или РНК, в соответствии с аспектом изобретения, с существенным исключением гибридизации полинуклеотидного зонда с одноцепочечными полинуклеотидами некомплементарной последовательности.
Термин «стандарт» означает (1) контрольный образец, который содержит ткань из субъекта, которому было введено контрольное вещество или вещество сравнения или не было введено никакого вещества, в сравнении с образцом, который содержит ткань из субъекта, которому было введено тестируемое вещество, например, для определения, вызывает ли тестируемое вещество дифференциальную экспрессию гена, приобретенную в контексте его применения.
Термин «жесткие условия» означает (1) гибридизацию в 50% (объем/объем) формамиде с 0,1% бычьим сывороточным альбумином, 0,1% Фиколлом, 0,1% поливинилпирролидоном, 50 мМ натрий-фосфатном буфере при pH 6,5 с 750 мМ NaCl, 75 мМ цитрата натрия при 42°C, (2) гибридизация в 50% формамиде, 5х SSC (0,75 М NaCl, 0,075 М цитрат натрия), 50 мМ фосфате натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфате натрия, 5х растворе Денхардта, обработанной ультразвуком ДНК из молок лососевых (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% сульфате декстрана при 42°C; с промывками при 42°C в 0,2 х SSC и 0,1% SDS или с промывками с 0,015 М NaCl, 0,0015 М цитратом натрия, 0,1% Na2SO4 при 50°C или сходными процедурами, с применением такой же низкой ионной силы и высокой температуры, таких же агентов для промывок и похожих денатурирующих агентов.
Термин «тканеспецифический маркер» или «тканеспецифических биомаркер», применяемый в этой заявке, означает гены и продукты их экспрессии, которые дифференциально экспрессируются в выбранной ткани старого субъекта в сравнении с молодым субъектом. Термин «тканеспецифический» предназначен для того, чтобы охватить ткани и органы. Например, выбранная ткань может быть гладкомышечной тканью из сердца, и тканеспецифические маркеры могут быть обозначены как «специфические для сердца». В другом примере, выбранная ткань может быть жировой тканью, которая может быть не связана с каким-либо определенным органом. Специалисту ясны эти термины в том виде, как их применяют в контексте на всем протяжении описания.
Термин «вариант» означает (1) полинуклеотидную последовательность, содержащую любую замену, изменение, модификацию, замещение, делецию или вставку одного или нескольких нуклеотидов из полинуклеотидной последовательности или в нее, и которая имеет одинаковые или существенно сходные свойства и демонстрирует одинаковую или существенно сходную с оригинальной последовательностью функцию; и (2) полипептидную последовательность, содержащую любую замену, изменение, модификацию, замещение, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот из полипептидной последовательности или в нее, и которая имеет одинаковые или существенно сходные свойства и демонстрирует одинаковую или существенно сходную с оригинальной последовательностью функцию. Термин, следовательно, включает полиморфизм единичных нуклеотидов (SNP) и аллельные варианты и включает консервативные и неконсервативные замены аминокислот в полипептидах. Термин также охватывает получение производных полинуклеотида или полипептида химическим способом и замену нуклеотидов или аминокислот нуклеотидами или аминокислотами, которые не встречаются в природе.
Термин «виртуальная упаковка» означает, что компоненты набора связаны с помощью руководств на одном или нескольких физических или виртуальных компонентах набора, инструктирующих пользователя, как получить другие компоненты, например, в пакете, содержащем один компонент и руководства, предписывающие пользователю обратиться к веб-сайту, прослушать записанное сообщение, просмотреть визуальное сообщение или обратиться к составителю или инструктору для получения указаний по применению набора.
«Молодой» обычно означает взрослого молодого индивидуума, т.е., вышедшего из пубертатного периода или подросткового возраста, что будет определяться видом или линией, породой или этнической группой внутри вида, в соответствии с известными параметрами. Термин «пожилой» или «старый», используемый в этой заявке, означает индивидуума, который физически или хронологически находится в рамках последних 30% своей средней прогнозируемой продолжительности жизни, что обусловлено видом или линией, породой или этнической группой внутри вида, в соответствии с известными параметрами.
Способы и композиции и другие преимущества, раскрытые в этой заявке, не ограничены определенной методологией, протоколами и реагентами, описанными в этой заявке, поскольку, как ясно специалисту, они могут изменяться. Кроме того, терминология, примененная в этой заявке, предназначена для целей описания только конкретных воплощений и не предназначена для ограничения и не ограничивает объем того, что раскрыто или заявлено.
Если не указано иное, то все технические и научные термины, термины области техники и аббревиатуры, примененные в этой заявке, имеют значении, общепринятые для понимания специалистом среднего уровня компетенции в области(областях) техники изобретения или в области(областях) техники, где этот термин применяют. Хотя любые композиции, способы, изделия или другие средства или материалы, похожие или эквивалентные, описанным в этой заявке, могут быть применены в практике изобретения, в этой заявке описаны предпочтительные композиции, способы, изделия или другие средства или материалы.
Все патенты, патентные заявки, публикации и другие ссылки, процитированные в этой заявке или на которые ссылаются в этой заявке, включены в эту заявку путем отсылки в той степени, в которой это позволяется регулирующим законодательством. Обсуждение этих ссылок предназначено только для суммирования сделанных в них утверждений. Не делается никакого допущения, что любые такие патенты, патентные заявки, публикации или ссылки или любая их часть относятся к релевантному материалу или к известному уровню техники. Право оспаривать верность и пертинентность любого утверждения, что такие патенты, патентные заявки, публикации и другие ссылки являются релевантным материалом или входят в уровень техники, специфически сохраняется.
Изобретение
Частично, настоящее изобретение возникло из способа для идентификации надежных маркеров экспрессии генов старения в выбранных тканях, разработанного авторами. Способ включает стадию скрининга для поиска дифференциально экспрессирующегося гена в выбранных тканях в большинстве линий, пород или этнических групп у вида, и применяют такой критерий, что кандидат на маркер экспрессии гена должен дифференциально экспрессироваться в большинстве линий, пород или этнических групп, среди которых проводят скрининг. Применяя этот и, необязательно, один или несколько вторичных критериев скрининга, были идентифицированы наборы надежных маркеров экспрессии генов старения в нескольких выбранных тканях.
В некоторых воплощениях изобретения, маркеры применяют для измерения экспрессии, по меньшей мере, одного дифференциально экспрессируемого гена. В предпочтительных воплощениях, маркеры применяют для измерения экспрессии двух или нескольких дифференциально экспрессируемых генов. Измерение экспрессии двух или нескольких дифференциально экспрессируемых генов обеспечивает паттерн экспрессирующихся генов или профиль генной экспрессии для выбранной ткани. Более предпочтительно, может быть проведено измерение множества дифференциально экспрессируемых генов в нескольких выбранных тканях, что обеспечивает дополнительную информацию о паттерне экспрессирующихся генов или профиле генной экспрессии.
В различных воплощениях изобретения, изменения в экспрессии гена могут быть измерены с помощью одного или обоих из следующих способов: (1) измерение транскрипции путем обнаружения мРНК, продуцируемой определенным геном; и (2) измерение трансляции путем обнаружения белка, продуцируемого определенным транскриптом.
Сниженная или увеличенная экспрессия может быть измерена на уровне РНК, с помощью любого способа, хорошо известного в этой области техники для количественного определения полинуклеотидов, такого как, например, PCR (включая, без ограничения, RT-PCR и qPCR), защита от РНКазы, нозерн-блоттинг, микроэррей(чип), макроэррей(чип) и другие способы гибридизация. Гены, которые исследуют или испытывают в соответствии с изобретением, обычно находятся в форме мРНК или обратно транскрибированной мРНК. Гены могут быть клонированы и/или амплифицированы. Клонирование само по себе, похоже, не оказывает влияния на репрезентативность генов в популяции. Однако может быть предпочтительно в качестве источника применять полиА+РНК, поскольку для ее применения требуется меньшее число технологических операций.
Таким образом, в одном из аспектов изобретение обеспечивает способы идентификации маркеров экспрессии генов старения в выбранной ткани. Способы включают отбор одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в ткани у старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, с применением такого критерия, что ген дифференциально экспрессируется в выбранной ткани в большом количестве линий, пород или этнических групп видов, предпочтительно, на заранее заданном уровне значимости (например, p<0,10, p<0,05 или p<0,01). В некоторых воплощениях, ген дифференциально экспрессируется в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более линиях, породах или этнических группах. В других воплощениях устанавливают такой критерий, что ген дифференциально экспрессируется в большинстве протестированных линий, пород или этнических групп и может быть усилен так, чтобы ген должен дифференциально экспрессироваться, по меньшей мере, в 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% протестированных линий, пород или этнических групп.
Способ может быть применен на практике в линиях, породах или этнических группах любого вида. В конкретных воплощениях, вид представляет собой млекопитающее и, в особенности, человека или животное-компаньона, такое как собака или кошка, или других животных-компаньонов, как определены выше.
Ткань, которую выбирают для практического применения способа, может представлять собой любую ткань или орган, включая, но, не ограничиваясь, жировую ткань, мочевой пузырь, кровь, кость, костный мозг, пищеварительный тракт, мозг и центральную нервную систему, молочную железу, бронхи, хрящ, ободочную и прямую кишку, соединительную ткань, эндокринную систему, глаз, женские репродуктивные органы, железы, сердце, кишечник, почку, печень, легкое и назальную/бронхиальную систему, лимфатический узел и лимфоидные органы, мужские репродуктивные органы, ротовую полость и язык, нервную ткань, отличную от мозга/ЦНС, поджелудочную железу, брюшную полость, селезенку и желудок. В примерах осуществления изобретения ткань выбирают из сердца, мышц, мозга или жировой ткани.
Описанный выше способ может включать дополнительные критерии идентификации надежных маркеров старения в выбранных тканях. Например, способ может дополнительно включать тот критерий, что дифференциальная экспрессия гена, дифференциально экспрессируемого у старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, по меньшей мере, частично обращается путем ограничения в калорийности. Способ также может дополнительно включать тот критерий, что известно или предполагается, что ген, дифференциально экспрессируемый у старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, ассоциирован с одной или несколькими связанными со старением физиологическими функциями. Функциональность генного продукта может быть определена экспериментально или по доступной специалисту литературе.
Описанные выше способы применяют для идентификации биомаркеров старения в выбранных тканях. Соответственно, в еще одном аспекте изобретения обеспечивают комбинации, включающие множество полинуклеотидов или экспрессируемых из них белков, которые дифференциально экспрессируются в выбранных тканях старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, в которых полинуклеотиды выбирают из генов, кодирующих белки, перечисленные в таблице 2, таблице 5, таблице 8 или в таблице 10, или их фрагменты. В этих таблицах приведены определения генов, названия генов и номера в базе данных «Entrez», которые позволяют получить полное описание генов и генных продуктов в базе данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI) Национальных институтов здоровья.
В одном из воплощений, выбранная ткань представляет собой сердце, и полинуклеотиды выбирают из генов, кодирующих два или более из следующего: Amyl, Apod, Bdh1, С3, Casq1, Сс18, Kcnd2, Lcn2, Mt2, Myot, Pah, Prkcq, Serpina3n, Skap2, Tmem16k и Vgll2. Из этой группы дифференциальная экспрессия обращается путем ограничения в калорийности в С3, Ссl8, Lcn2, Mt2, Pah, Prkcq, Serpina3n, Tmem16k и Vgl12.
В другом воплощении, выбранная ткань представляет собой жировую ткань, и полинуклеотиды выбирают из генов, кодирующих два или более из следующего: Aspn, Clec4n, Соl6а2, Col18a1, Cox8b, Crip2, Ear11, Emilin2, Otop1, Pla2g2d, Rhbdl3, Slc6a13 и Sycp3. Из этой группы дифференциальная экспрессия обращается путем ограничения в калорийности в Aspn, Со16а2, Crip2, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, Rhbd13 и Slc6al3.
В другом воплощении, выбранная ткань представляет собой мозг, и полинуклеотиды выбирают из генов, кодирующих два или более из следующего: Apod, B2m, Clqa, Clqb, Cd68, Clec7a, Cst7, Ctsd, Gfap, Il33, Lgals3, Lyzs и Sppl. Из этой группы дифференциальная экспрессия обращается путем ограничения в калорийности в Apod, B2m, Clqa, Clqb, Ctsd, Gfap, Il33, Lyzs и Spp1.
В другом воплощении, выбранная ткань представляет собой мышцы, и полинуклеотиды выбирают из генов, кодирующих два или более из следующего: С4, Cdkn2c, Cdsl, Collal, Colla2, Col3al, Dusp26, Edg2, Igh-6, Mt2, Plk2, Rhpn2 и Syt9. Из этой группы дифференциальная экспрессия обращается путем ограничения в калорийности в С4, Cdkn2c, Cdsl, Colla1, Colla2, Col3a1, Edg2, Igh-6, Mt2, Plk2 и Syt9.
В одном из воплощений, комбинация включает два или более полинуклеотида или белка, экспрессируемые из этих полинуклеотидов. Предпочтительно, комбинация включает большинство полинуклеотидов или белков, экспрессируемых из этих полинуклеотидов, обычно, примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более полинуклеотидов или белков или их фрагментов, в качестве подходящих для определенных видов, ткани и применения. Если комбинация включает один или несколько фрагментов, то фрагменты могут быть любого размера, который сохраняет свойства и функцию исходного полинуклеотида или белка, предпочтительно, от примерно 30%, 60% или 90% от оригинала.
Полинуклеотиды и белки могут быть от любого животного, включая людей, в особенности, собак и кошек, в наибольшей особенности, собак. Гомологи полинуклеотидов и белков из разных видов животных могут быть получены с помощью стандартного анализа информации и молекулярных способов, хорошо известных специалисту. Например, название, опубликованный код доступа в базе данных или описание функции гена или белка можно ввести в одну из нескольких общедоступных баз данных, которые создадут список источников, предоставляющих информацию об этом гене из различных видов, включая информацию о последовательности. Одна из таких баз - это база данных information Hyperlinked over Proteins» (iHOP), которая доступна в интернете через URL: . Альтернативно, код доступа открытой базы данных известного гена или белка может быть применен для получения информация о последовательности для этого гена или белка и для поиска гомологов или ортологов в других видах с помощью сопоставительного поиска последовательностей. Например, код доступа гена или белка из мыши, полученный в GenBank, может быть введен в базу данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI) Национальных институтов здоровья, и, таким способом, могут быть получены последовательности ДНК или полипептидные последовательности для этого гена мыши. Применяя те же базы данных, поиск в BLAST можно провести на последовательности ДНК или белка мыши или их фрагментах, в достаточной мере длинных для определения гена или белка, для идентификации последовательностей, обладающих достаточно гомологией из других видов, например, из собаки. Коды доступа последовательностей из других видов, представляющих интерес, можно затем ввести в базу данных для получения информации, относящейся к этим полноразмерным последовательностям нуклеотида или белка, а также другой описательной информации.
В еще одном аспекте изобретения обеспечивают композиции, включающие два или более зонда детекции дифференциальной экспрессии гена в выбранной ткани у старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами. В некоторых воплощениях, выбранная ткань представляет собой сердце, жировую ткань, мозг или мышечную ткань, и зонды включают: (а) полинуклеотиды, которые специфически гибридизуются с двумя или более генами, кодирующими белки, перечисленные в таблице 2, таблице 5, таблице 8 или в таблице 10, или их фрагменты; или (b) агенты, связывающие полипептиды, которые специфически связываются с двумя или более полипептидами, выбранными из белков, перечисленных в таблице 2, таблице 5, таблице 8 или в таблице 10, или их фрагментов.
В одном из воплощений, выбранная ткань представляет собой сердце, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Amyl, Apod, Bdh1, С3, Casq1, Ссl8, Kcnd2, Lcn2, Mt2, Myot, Pah, Prkcq, Serpina3n, Skap2, Tmeml6k и Vgl12. В другом воплощении, выбранная ткань представляет собой жировую ткань, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Aspn, Clec4n, Соl6а2, Col18a1, Cox8b, Crip2, Ear11, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, PvhbdB, Slc6al3 и Sycp3. В другом воплощении, выбранная ткань представляет собой мозг, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Apod, B2m, Clqa, Clqb, Cd68, Clec7a, Cst7, Ctsd, Gfap, I133, Lgals3, Lyzs и Sppl. Еще в одном воплощении, выбранная ткань представляет собой мышцы, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой С4, Cdkn2c, Cdsl, Collal, Colla2, Col3al, Dusp26, Edg2, Igh-6, Mt2, Plk2, Rhpn2 и Syt9.
В конкретных воплощениях, дифференциальную экспрессию обращают путем ограничения в калорийности, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой: (а) С3, Сс18, Lcn2, Mt2, Pah, Prkcq, Serpina3n, Tmeml6k и Vgll2 в сердце; (b) Aspn, Col6a2, Crip2, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, Rhbdl3 и Slc6al3 в жировой ткани; (с) Apod, B2m, Clqa, Clqb, Ctsd, Gfap, 1133, Lyzs и Sppl в мозге; или (d) C4, Cdkn2c, Cdsl, Collal, Colla2, Col3al, Edg2, Igh-6, Mt2, Plk2 и Syt9 в мышцах.
Предпочтительно, композиция включает большинство зондов, обычно, примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500 или более зондов детекции полинуклеотидов или белков или их фрагментов, по необходимости, для определенного вида, ткани и применения. Специалисту ясно, что может быть применено множество разных зондов для единственного целевого гена или белка, для улучшения чувствительности или точности анализа с применением зондов. Например, могут быть применены некоторые олигонуклеотидные зонды, которые специфически гибридизуются с разными последовательностями на полинуклеотиде-мишени. Таким же образом, могут быть применены некоторые антитела, иммунологически специфические для разных эпитопов на белке-мишени.
Один или несколько олигонуклеотидных или полинуклеотидных зондов для исследуемого образца могут быть получены с помощью информации о последовательности для любого из генов, перечисленных в этой заявке, из любого вида, предпочтительно, собаки или кошки. Зонды должны быть в достаточной мере длинными, для того чтобы специфическая гибридизация проходила в значительной степени исключительно с подходящими комплементарными генами или транскриптами. В некоторых воплощениях, олигонуклеотидные зонды, по меньшей мере, имеют длину, равную примерно 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 25 нуклеотидов. В некоторых воплощениях, желательно применять более длинные зонды, по меньшей мере, примерно в 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 нуклеотидов, и в некоторых воплощениях могут подойти зонды длиной более чем примерно 100 нуклеотидов. Зонды могут включать полноразмерные последовательности, кодирующие функциональные белки. Зонды, представляющие собой нуклеиновые кислоты, синтезируют или получают с помощью способов, известных специалистам в этой области техники, например, с помощью синтеза in vitro из нуклеотидов, выделения и очистки из природных источников или энзиматическим расщеплением полинуклеотидов изобретения.
Гибридизационные комплексы, включающие зонды, представляющие собой нуклеиновые кислоты, гибридизованные с полинуклеотидом изобретения могут быть обнаружены с помощью множества способов, известных в этой области техники. В некоторых воплощениях изобретения, для быстрой и специфической детекции полинуклеотидов и профиля их экспрессии могут быть применены иммобилизованные зонды, представляющие собой нуклеиновые кислоты. Обычно, зонд, представляющий собой нуклеиновую кислоту, закрепляют на твердой подложке, и целевой полинуклеотид (например, ген, продукт транскрипции, ампликон, или, чаще всего, смесь после амплификации) гибридизуется с зондом. Как зонд, так и мишень, или оба, могут быть помечены, обычно, флуороформом или другой меткой, такой как стрептавидин. Если помечена мишень, то гибридизацию можно обнаружить, регистрируя флуоресценцию связавшихся комплексов. Если помечен зонд, гибридизацию обычно обнаруживают по тушению метки. Если помечены и зонд, и мишень, то детекцию гибридизации обычно проводят, регистрируя изменение цвета, возникающее в результате сближения двух связанных меток. В этой области техники известно множество стратегий мечения, меток и им подобного, в частности, для приложений, основанных на флуоресценции.
В другом воплощении, зонды включают агенты, связывающие полипептиды, которые специфически связываются с полипептидами, продуцируемыми в результате экспрессии одного или нескольких полипептидов, перечисленных в этой заявке, или их фрагментов. Такие связывающие белки зонды может быть получены с помощью информации о последовательности, доступной для любого из белков, определенных в таблице 2, таблице 5, таблице 8 и таблице 10, или их фрагментов.
Методики анализа, которые могут быть применены для определения количества белка в образце, также хорошо известны специалистам в этой области техники. Такие способы анализа включают радиоиммунологические анализы, анализы по конкурентному связыванию, вестерн-блоттинг и анализы методом ELISA. В способах анализа с применением антител, для применения в изобретении подходят как поликлональные, так и моноклональные антитела. Такие антитела могут быть иммунологически специфическими для определенного белка или эпитопа белка или фрагмента белка, что понятно специалистам в этой области техники. Способы получения поликлональных и моноклональных антител, иммунологически специфических для белка или пептида также хорошо известны в этой области техники.
В предпочтительных воплощениях изобретения могут быть применены антитела для детекции и количественного определения белков, продуцируемых в результате экспрессии генов, описанных в этой заявке. Хотя белки могут быть обнаружены с помощью иммунопреципитации, аффинного разделения, вестерн-блоттинга и подобных способов, в предпочтительном способе применяют технологию по типу ELISA, в котором антитело иммобилизовано на твердой подложке, и целевой белок или пептид инкубируют с иммобилизованным антителом. Как зонд, так и мишень, или оба, могут быть помечены. В этой области техники известно множество стратегий мечения, меток и им подобных.
В еще одном аспекте изобретения обеспечивают устройства, включающие твердую подложку, к которой прикреплена панель, включающая множество зондов для детекции дифференциальной экспрессии гена в выбранной ткани у старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами. В некоторых воплощениях, выбранная ткань представляет собой сердце, жировую ткань, мозг или мышечную ткань, и зонды включают: (а) полинуклеотиды, которые специфически гибридизуются с двумя или более генами, кодирующими белки, перечисленные в таблице 2, таблице 5, таблице 8 или в таблице 10, или их фрагменты; или (b) агенты, связывающие полипептиды, которые специфически связываются с двумя или более полипептидами, выбранными из белков, перечисленных в таблице 2, таблице 5, таблице 8 или в таблице 10, или их фрагментов. В предпочтительном воплощении, устройство применяют для обнаружения дифференциальной экспрессии генов у собак и кошек.
В одном из воплощений, выбранная ткань представляет собой сердце, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Amyl, Apod, Bdhl, С3, Casql, Ссl8, Kcnd2, Lcn2, Mt2, Myot, Pah, Prkcq, Serpina3n, Skap2, Tmeml6k и Vgl12. В другом воплощении, выбранная ткань представляет собой жировую ткань, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Aspn, Clec4n, Соl6а2, Col18a1, Cox8b, Crip2, Ear11, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, Rhbdl3, Slc6al3 и Sycp3. В другом воплощении, выбранная ткань представляет собой мозг, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Apod, B2m, Clqa, Clqb, Cd68, Clec7a, Cst7, Ctsd, Gfap, 1133, Lgals3, Lyzs и Sppl. Еще в одном воплощении, выбранная ткань представляет собой мышцы, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой С4, Cdkn2c, Cdsl, Col1al, Col1a2, Col3a1, Dusp26, Edg2, Igh-6, Mt2, Plk2, Rhpn2 и Syt9.
В конкретных воплощениях, дифференциальную экспрессию обращают путем ограничения в калорийности, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой: (а) С3, Ссl8, Lcn2, Mt2, Pah, Prkcq, Serpina3n, Tmeml6k и Vgl12 в сердце; (b) Aspn, Col6a2, Crip2, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, Rhbdl3 и Slc6al3 в жировой ткани; (с) Apod, B2m, Clqa, Clqb, Ctsd, Gfap, I133, Lyzs и Sppl в мозге; или (d) C4, Cdkn2c, Cdsl, Collal, Colla2, Col3al, Edg2, Igh-6, Mt2, Plk2 и Syt9 в мышцах.
В одном из воплощений, могут быть применены чипы с олигонуклеотидными или полинуклеотидными зондами, тогда как в другом воплощении можно применить чипы с антителами или другими белками, которые связываются с дифференциально экспрессируемыми генными продуктами. Такие чипы могут быть сделаны по индивидуальному заказу в соответствии с известными способами, такими как, например, синтез in-situ на твердой подложке или прикрепление заранее синтезированных зондов к твердой подложке посредством методики микропринтирования. В предпочтительных воплощениях чипы с зондами, представляющими собой нуклеиновые кислоты, или белок-связывающие зонды изготовляют по индивидуальному заказу для специфической детекции транскриптов или белков, продуцируемых двумя или более из следующего: дифференциально экспрессируемыми генами или фрагментами генов, описанными в этой заявке.
В еще одном аспекте изобретения обеспечивают способы детекции дифференциальной экспрессия одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в выбранной ткани у старых субъектов в сравнении со стандартом или с молодыми субъектами. В конкретных воплощениях ткань представляет собой сердце, жировую ткань, мозг или мышцы, и способы обычно включают: (а) обеспечение зондов, включающих (i) полинуклеотиды, которые специфически гибридизуются с двумя или более генами, кодирующими белки, перечисленные в таблице 2, таблице 5, таблице 8 или в таблице 10, или их фрагменты; или (ii) агенты, связывающие полипептиды, которые специфически связываются с двумя или более полипептидами, выбранными из белков, перечисленных в таблице 2, таблице 5, таблице 8 или в таблице 10, или их фрагментов; (b) добавление зондов к образцу, включающему мРНК или белки из старого субъекта, так чтобы сделать возможным гибридизацию или связывание зондов с мРНК или белками в образце, формируя таким способом комплексы гибридизации или связывания в образце; (с) необязательно, добавление зондов к другому образцу, включающему мРНК или белки из молодого субъекта, так чтобы сделать возможным гибридизацию или связывание зондов с мРНК или белками во втором образце, формируя таким способом комплексы гибридизации или связывания в другом образце; (d) детекцию гибридизационных комплексов в образце или образцах; и (е) сравнение комплексов гибридизации или связывания из первого образца с комплексами гибридизации или связывания из стандарта или, необязательно, из другого образца, в котором, по меньшей мере, одно различие между количеством гибридизации или связывания в образце в сравнении со стандартом или необязательным другим образцом указывает на дифференциальную экспрессию одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых у старых субъектов.
Способ может быть применен для обнаружения дифференциальной экспрессии генов, кодирующих генные продукты, приведенные в таблицах 2, 5, 8 или 10 или в дополняющих их таблицах. Таким образом, в одном из воплощений, выбранная ткань представляет собой сердце, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Amyl, Apod, Bdhl, С3, Casql, Ссl8, Kcnd2, Lcn2, Mt2, Myot, Pah, Prkcq, Serpina3n, Skap2, Tmeml6k и Vgll2. В другом воплощении, выбранная ткань представляет собой жировую ткань, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Aspn, Clec4n, Со16а2, Col18al, Сох8b, Crip2, Earll, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, RhbdB, Slc6al3 и Sycp3. В другом воплощении, выбранная ткань представляет собой мозг, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Apod, B2m, Clqa, Clqb, Cd68, Clec7a, Cst7, Ctsd, Gfap, 1133, Lgals3, Lyzs и Sppl. Еще в одном воплощении, выбранная ткань представляет собой мышцы, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой С4, Cdkn2c, Cdsl, Colla1, Col1a2, Col3al, Dusp26, Edg2, Igh-6, Mt2, Plk2, Rhpn2 и Syt9.
В конкретных воплощениях, дифференциальную экспрессию обращают путем ограничения в калорийности, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой: (а) СЗ, Ссl8, Lcn2, Mt2, Pah, Prkcq, Serpina3n, Tmeml6k и Vgl12 в сердце; (b) Aspn, Col6a2, Crip2, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, RhbdB и Slc6al3 в жировой ткани; (с) Apod, B2m, Clqa, Clqb, Ctsd, Gfap, I133, Lyzs и Sppl в мозге; или (d) C4, Cdkn2c, Cds1, Col1al, Col1a2, Col3a1, Edg2, Igh-6, Mt2, Plk2 и Syt9 в мышцах.
В предпочтительном воплощении, способ применяют для детекции дифференциальной экспрессии генов у собак и кошек. В конкретных воплощениях зонды связывают с подложкой, предпочтительно, в форме чипа.
Стадия (с) и часть стадий (d) и (е) необязательны, и их применяют, если необходимо провести относительно одновременное сравнение двух или нескольких анализируемых систем (т.е. тканей из старого и молодого субъектов). Однако в другом воплощении, стандарт, применяемый для сравнения, основан на данных, полученных ранее с применением способа. В этом воплощении, зонды приводят в контакт с образцом для формирования комплексов гибридизации или связывания, которые детектируют и сравнивают с комплексами стандарта. Различия между комплексами гибридизации или связывания из образца и стандарта указывают на дифференциальную экспрессию полинуклеотидов и, следовательно, генов, дифференциально экспрессируемых в ткани старого субъекта по сравнению со стандартом, который может включать мРНК, предварительно выделенную из молодого субъекта или «стандартного» субъекта другого типа. В предпочтительном воплощении, зонды изготавливают для специфической детекции полинуклеотидов или их фрагментов, продуцируемых одним или несколькими генами или фрагментами генов, идентифицируемых с помощью изобретения. Способы детекции гибридизационных комплексов известны специалистам в этой области техники.
Анализы, описанные в этой заявке, в которых применяют тканеспецифические биомаркеры для обнаружения связанных со старением продуктов транскрипции и трансляции, могут быть применены в способах определения физиологического возраста ткани у субъекта. Такие способы могут быть полезны для осуществления, содействия или проведения омолаживающего курса лечения, такого как ограничение в калорийности, и/или диеты. Такие способы включают получение образца выбранной ткани из субъекта, проходящего такой курс лечения. Образец ткани затем анализируют на измененную экспрессию одного или нескольких генов, ассоциированных с молодым по сравнению со старым фенотипом, применяя генный или белковый чип или другой способ детекции, как описано в этой заявке. Результаты анализа выявят, эффективен ли курс лечения в замедлении или обращении процесса старения в ткани.
В еще одном аспекте изобретения обеспечивают способы обнаружения того, действительно ли тестируемое вещество полезно для обращения или замедления процесса старения, по меньшей мере, в одной выбранной ткани при введении животному. Способы включают (а) определение первого профиля экспрессии генов путем измерения продуктов транскрипции или трансляции двух или нескольких полинуклеотидов, которые выбирают из генов, кодирующих белки, перечисленные в таблице 2, таблице 5, таблице 8 или в таблице 10, или их фрагменты, в тестируемой системе в отсутствии тестируемого вещества; (b) определение второго профиля экспрессии генов путем измерения продуктов транскрипции или трансляции двух или нескольких полинуклеотидов, которые выбирают из генов, кодирующих белки, перечисленные в таблице 2, таблице 5, таблице 8 или в таблице 10, или их фрагменты, в тестируемой системе в присутствии тестируемого вещества; и (с) сравнение первого профиля экспрессии генов со вторым профилем экспрессии генов, при котором изменение во втором профиле экспрессии генов в сравнении с первым профилем экспрессии генов указывает на то, что тестируемое вещество вероятно полезно для обращения или замедления процесса старения при введении животному. При сравнении первого профиля экспрессии генов со вторым профилем экспрессии генов, сравнение может быть проведено как на уровне индивидуального продукта транскрипции или трансляции, так и как среднее изменение признаков старения для всех продуктов транскрипции или трансляции. Этот способ полезен для определения показателя замедления старения.
В одном из воплощений, выбранная ткань представляет собой сердце, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Amyl, Apod, Bdh1, С3, Casql, Сс18, Kcnd2, Lcn2, Mt2, Myot, Pah, Prkcq, Serpina3n, Skap2, Tmeml6k и Vgl12. В другом воплощении, выбранная ткань представляет собой жировую ткань, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Aspn, Clec4n, Соl6а2, Col18a1, Cox8b, Crip2, Earl1, Emilin2, Otop1, Pla2g2d, RhbdB, Slc6a13 и Sycp3. В другом воплощении, выбранная ткань представляет собой мозг, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Apod, B2m, Clqa, Clqb, Cd68, Clec7a, Cst7, Ctsd, Gfap, I133, Lgals3, Lyzs и Sppl. Еще в одном воплощении, выбранная ткань представляет собой мышцы, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой С4, Cdkn2c, Cds1, Col1a1, Col1a2, CoBal, Dusp26, Edg2, Igh-6, Mt2, Plk2, Rhpn2 и Syt9.
В конкретных воплощениях, дифференциальную экспрессию обращают путем ограничения в калорийности, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой: (а) С3, Ссl8, Lcn2, Mt2, Pah, Prkcq, Serpina3n, Tmeml6k и Vgll2 в сердце; (b) Aspn, Col6a2, Crip2, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, RhbdB и Slc6al3 в жировой ткани; (с) Apod, B2m, Clqa, Clqb, Ctsd, Gfap, I133, Lyzs и Sppl в мозге; или (d) C4, Cdkn2c, Cdsl, Colla1, Colla2, Col3a1, Edg2, Igh-6, Mt2, Plk2 и Syt9 в мышцах.
В некоторых воплощениях, способ может дополнительно включать стадию сравнения, по меньшей мере, второго профиля экспрессии генов с контрольным или стандартным профилем экспрессии генов, полученным путем измерения продуктов транскрипции или трансляции двух или нескольких полинуклеотидов, которые выбирают из генов, кодирующих белки, перечисленные в таблицах 2, 5, 8 или 10, или их фрагменты, в тестируемой системе в присутствии эталонного вещества или композиции, о которых известно, что они обращают или замедляют старение в определенной ткани или тканях при введении животным.
В одном из воплощений, тестируемая система включает популяцию культивируемых клеток. Конструкт нуклеиновой кислоты, включающий связанный со старением ген в соответствии с изобретением, вводят в культуру клеток-хозяев. Клетки-хозяева могут представлять собой линии клеток млекопитающих, такие как, но, не ограничиваясь, NIH3T3, СНО, HELA и COS, хотя также могут быть применены клетки, не принадлежащие млекопитающим, такие как клетки дрожжей, бактерий и насекомых. Кодирующие последовательности генов функционально связаны с соответствующими регуляторными элементами экспрессии, которые подходят для применения в определенных клетках-хозяевах. Конструкты нуклеиновой кислоты могут быть введены в клетки-хозяева в соответствии с любым способом, применяемым в этой области техники, включая, но, не ограничиваясь, трансфекцию, трансформацию, осаждение фосфатом кальция, электропорацию и липофекцию. Такие методики хорошо известны и рутинно применяются в этой области техники. Трансформированные клетки также могут быть применены для идентификации соединений, модулирующих экспрессию связанных со старением генов.
Анализы экспрессии гена могут быть проведены с помощью генного конструкта, включающего промотор селективно связанного со старением гена, функционально связанный с геном-репортером. Конструкт репортера может быть введен в подходящую культуру клеток, включая, без ограничения, описанные выше стандартные линии клеток-хозяев или клетки недавно изолированные из субъекта, такие как клетки жировой ткани или мышечные клетки. Анализ проводят путем регистрации экспрессии гена-репортера в присутствии или в отсутствии тестируемого компонента.
В предпочтительном воплощении, тестируемая система включает животных. Обычно, тестируемый компонент вводят субъекту и анализируют профиль экспрессии генов в выбранной ткани субъекта для определения эффекта тестируемого компонента на транскрипцию или трансляцию связанных со старением генов или генных продуктов по изобретению. Для определения эффекта тестируемого компонента экспрессия гена может быть проанализирована in situ или ex vivo. В другом воплощении, тестируемый компонент вводят субъекту и анализируют активность белка, экспрессируемого из гена in situ или ex vivo в соответствии с любым способом, применяемым в этой области техники для определения эффекта тестируемого компонента на активность белков, представляющих интерес. Кроме того, если тестируемый компонент вводят субъекту, то можно также оценить физиологический, системный и физический эффекты соединения, а также потенциальную токсичность соединения.
Тестируемые вещества могут представлять собой любое вещество и комбинацию веществ, которые могут иметь влияние на полинуклеотиды или гены, дифференциально экспрессируемые в выбранных тканях старого субъекта при сравнении с молодым субъектом. Подходящие тестируемые вещества включают, но не ограничиваются, аминокислоты; белки, пептиды, полипептиды, нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды, полинуклеотиды, малые молекулы, макромолекулы, витамины, минералы, простые сахара; сложные сахара; полисахариды; углеводы; триглицериды со средней длиной цепи (МСТ); триацилглицериды (TAGs); n-3 (омега-3) жирные кислоты, включая DHA, ЕРА, ALA; n-6 (омега-6) жирные кислоты, включая LA, γ-линоленовую кислоту (GLA) и ARA; SA, конъюгированную линолевую кислоту (CLA); источники холина, такие как лецитин; жирорастворимые витамины, включая витамин А и его предшественнники, такие как каротиноиды (например, (β-каротин), источники витамина D, такие как витамин D2 (эргокальциферол) и витамин D3 (холекальциферол), источники витамина Е, такие как токоферолы (например, α-токоферол) и токотриенолы, и источники витамина К, такие как витамин К1 (филлохинон) и витамин К2 (менадион); водорастворимые витамины, включая витамины В, такие как рибофлавин, ниацин (включая никотинамид и никотиновую кислоту), пиридоксин, пантотеновую кислоту, фолевую кислоту, биотин и кобаламин; и витамин С (аскорбиновую кислоту); антиоксиданты, включая некоторые из перечисленных выше витаминов, в особенности, витамины Е и С; также биофлавоноиды, такие как катехин, кверцетин и теафлавин; хиноны, такие как убихинон; каротиноиды, такие как ликопин и ликоксантин; ресвератрол; и α-липоевую кислоту; L-карнитин; D-лимонен; глюкозамин; S-аденозилметионин; и хитозан. В предпочтительном воплощении, тестируемые вещества представляют собой питательных веществ, которые могут быть добавлены к пище или потреблены в качестве пищевой добавки. Вещества, идентифицированные с помощью вышеизложенного способа, также рассматривают как часть изобретения.
В еще одном аспекте изобретения обеспечивают наборы, включающие, в отдельных контейнерах в разовой упаковке или в отдельных контейнерах в виртуальной упаковке, два или более зонда для детекции дифференциальной экспрессии гена в выбранной ткани у старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами. В некоторых воплощениях, ткань представляет собой сердце, жировую ткань, мозг или мышечную ткань, и зонды включают (а) полинуклеотиды, которые специфически гибридизуются с двумя или более генами, кодирующими белки, перечисленные в таблице 2, таблице 5, таблице 8 или в таблице 10, или их фрагменты; или (b) агенты, связывающие полипептиды, которые специфически связываются с двумя или более полипептидами, выбранными из белков, перечисленных в таблице 2, таблице 5, таблице 8 или в таблице 10, или их фрагменты; в которых набор дополнительно включает, по меньшей мере, одно из следующего: (1) инструкции по применению зондов в анализе экспрессии гена для детекции дифференциальной экспрессии гена в выбранных тканях субъектов, (2) реагенты и оборудование для применения зондов и (3) композицию, о которой известно, что она обращает или замедляет процесс старения в выбранной ткани при введении субъекту.
Если набор включает виртуальную упаковку, то набор ограничен инструкциями в виртуальной среде в комбинации с одним или несколькими физическими компонентами набора. В одном из воплощений, набор содержит зонды и/или другие физические компоненты и инструкции по применению зондов, а другие компоненты доступны через интернет. Набор может содержать дополнительные единицы оборудования, такие как устройство для перемешивания образцов, зондов и реагентов и устройство для применения набора, например, пробирки или принадлежности для перемешивания.
В еще одном аспекте изобретения обеспечивает компьютерные системы, включающие базу данных, содержащую информация о полинуклеотидах, которые дифференциально экспрессируются в выбранной ткани старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами. Эта база данных может содержать информацию, определяющую уровень экспрессии одного или нескольких полинуклеотидов, которые выбирают из генов, кодирующих белки, перечисленные в таблицах 2, 5, 8 или 10, и/или полипептидов, которые специфически связываются с белками, перечисленными в таблицах 2, 5, 8 или 10, и пользователь связывается с компьютером, для того чтобы воспользоваться базой данных, в частности, для того чтобы ввести, обработать и ознакомиться с информацией для разных животных или категорий животных. В одном из воплощений, база данных дополнительно содержит информацию об уровне активности одного или нескольких полипептидов, перечисленные в таблицах 2, 5, 8 или 10. В другом, база данных дополнительно включает информацию о последовательностях для одного или нескольких полинуклеотидов или полипептидов, таких как те, что перечислены в таблицах 2, 5, 8 или 10, предпочтительно, из различных видов. В других воплощениях, база данных содержит дополнительную информация, имеющую отношение к описанию генов в одном или нескольких видах животных. Компьютерная система представляет собой любое электронное устройство, способное хранить и обрабатывать данные и взаимодействовать с пользователем, например, обычный компьютер или аналитический инструмент, разработанный так, чтобы облегчать применение изобретения и выводящий результаты применительно к статусу животного.
В еще одном аспекте изобретения обеспечивает носитель информации для передачи информации об одной или нескольких композициях и способах, описанных в этой заявке, или инструкции для них. Такой носитель обычно включает документы, цифровые накопители, оптические накопители, звуковые презентации, визуальные изображения или им подобные, содержащие информацию или инструкции. Например, средства передачи данных могут представлять собой вывод данных на вэб-сайт, интерактивный терминал, брошюру, ярлык на изделии, листок-вкладыш в упаковку, рекламное сообщение, раздаточный информационный материал, аудиозапись с публичным сообщением, видеозапись, DVD, CD, читаемый компьютером чип, читаемый компьютером карта, читаемый компьютером диск, память компьютера или любая их комбинация. Полезная информация включает один или несколько из следующего: (1) способы стимуляции здоровья и хорошего состояния животных и (2) контактная информация для использования лицами, ухаживающими за животными, если у них возникнет вопрос об изобретение и его применении. Полезные инструкции включают методики для применения зондов, инструкции для проведения анализа экспрессии генов и по количеству вводимых веществ и частоте их введения. Средства сообщения полезны для получения информации по преимуществам применения изобретения.
ПРИМЕРЫ
Различные аспекты изобретения могут быть дополнительно проиллюстрированы следующими примерами. Понятно, что эти примеры предназначены только для иллюстрации и не ограничивают объем изобретения, раскрытого в этой заявке, если специально не указано иное.
Пример 1
Этот пример кратко описывает исследование, проведенное для тестирования способности некоторых комбинаций веществ имитировать эффекты увеличения продолжительности жизни, вызываемые ограничениями в потреблении калорий (CR) без уменьшения пищевого рациона. Мышей C57BL6 содержали на контрольной диете, основанной на формуле AIN93M (Американский институт питания (AIN)), синтетическая диетическая формула для содержания зрелых грызунов) или на диете с похожей композицией питательных веществ, но содержащей 25%-ное ограничение в калориях (CR)
Ткани собирали от мышей, находившихся на контрольной диете на пятом и 25-ом месяцах жизни; ткани от мышей, получавших дополнительные питательные вещества, собирали на 25-ом месяце жизни. Из ткани выделяли РНК и определяли изменения в экспрессии гена с помощью qPCR, применяя прибор «realplex2» компании «Eppendorf». Данные для индивидуальных генов приведены в некоторых из следующих примеров.
Пример 2
Этот пример описывает идентификацию биомаркеров старения в сердечной ткани.
Для идентификации изменения экспрессии гена в сердце семи линий мышей (129, C57BL6, Balbc, С3Н, СВА, DBA и B6C3HF1) применяют чип «Mouse Genome 430 2.0» компании «Affymetrix». Значительное изменение в экспрессии определяют с помощью двусторонних t-критериев для молодых против старых мышей (Р<0,05, n=7 мышей на породу на возрастную группу). Молодых мышей тестируют на 5-ом месяце жизни, старых мышей тестируют на 25-ом месяце жизни. В таблице 1 приведены ряд генов, экспрессия которых значительно изменяется с возрастом в каждой линии (Р<0,05), и в таблице 2 перечислены гены, экспрессия которых изменяется, по меньшей мере, в четырех из семи линиях.
Шестнадцать потенциальных маркеров старения сердца отбирают для подтверждения данных, полученных на чипе, с помощью qPCR. Гены отбирают на основании многочисленных факторов, включая (но, не ограничиваясь): обильная экспрессия в эксперименте с микрочипом, явное изменение в экспрессии в линии В6, предварительные сведения о связи гена со старением сердца. С помощью образцов RNA из В6, примененных в исследовании с чипом, qPCR-анализ выявил, что все 16 генов показали изменение в экспрессии с возрастом. Эти гены приведены в таблице 3. Для девяти маркеров из 16 подтвержденных с помощью qPCR маркеров старения сердца, qPCR дополнительно выявил, что их возрастная экспрессия образца обращается с помощью CR, по меньшей мере, примерно, на 32%. Эти девять маркеров - С3, Ссl8, Lcn2, Mt2, Pah, Prkcq, Serpina3n, Tmem16k и Vgl12.
Эффекты приведенного в примере 1 применения диеты на специфические маркеры старения сердца описаны ниже, вместе с опубликованной функцией (опубликованными функциями) каждого маркера.
Реакция на стресс
Металлотионеин 2 (Mt2): Известно, что гены металлотионеина индуцируются в ответ на окислительный стресс, и трансгенные мыши, сверхэкспрессирующие металлотионеин 2А человека со специфического для сердца промотора, защищены от доксорубициновой кардиотоксичности. Сообщалось, что Mt2 может защитить сердце от окислительного повреждения, только если он присутствует до индукции окислительного стресса. Следует отметить, что этот ген по данным анализа микрочипа был идентифицирован как возможный супермаркер старения скелетной мышцы, но изменение в экспрессии этого гена не было подтверждено с помощью qPCR. В сердце, мы наблюдали увеличение в экспрессии этого гена с возрастом, которое частично предотвращалось CR.
Аполипопротеин D (Apod): Аполипопротеин D представляет собой член семейства генов липокалина, он вовлечен в иммунный ответ и ответ на стресс.Apod индуцируется в ответ на стресс в мозге, и ранее мы идентифицировали этот ген в качестве супермаркера старения неокортекса мыши. В сердце мыши экспрессия этото гена увеличивается в ~2,5 раза с возрастом, но CR не предупреждает это увеличение.
Липокалин 2 (Lcn2). Ряд сообщений указывают на то, что липокалин 2 индуцируется воспалением и окислительным стрессом, и его увеличению препятствуют ловушки активных форм кислорода, цистеамин и DMSO. Следовательно, Lcn2 может быть полезным биомаркером для идентификации окислительного стресса как in vitro, так и in vivo. В сердце мыши экспрессия этого гена увеличивается примерно в три раза с возрастом и CR полностью предотвращает это увеличение.
Иммунный ответ/Воспаление
Компонент комплемента 3 (С3): Компонент комплемента 3 играет центральную роль в активации системы комплемента. Его активация необходима как для классического, так и для альтернативного пути активация комплемента. Ранее мы идентифицировали близкородственный ген (С4) в качестве супермаркера старения в скелетных мышцах мыши; эти данные находятся в соответствии со многими сообщениями об увеличении иммунной активации с возрастом. В сердце мыши, экспрессия С3 увеличивается примерно в два раза с возрастом, и CR предупреждает это увеличение.
Хемокин лиганд (С-С мотив) 8 (Сс18): Этот цитокин проявляет хемотаксическую активность в отношении моноцитов, лимфоцитов, базофилов и эозинофилов и привлекает лейкоциты в участки воспаления, этот цитокин может вносить вклад в ассоциированную с опухолью инфильтрацию лейкоцитов и в антивурусное состояние в отношении ВИЧ-инфекции. В сердце мыши экспрессия этого гена значительно увеличивается (примерно в шесть раз) с возрастом, и CR частично предупреждает это увеличение.
Протеинкиназа С, тета (Prkcq): Члены семейства протеинкиназ С (РКС) фосфорилируют большое разнообразие белков-мишеней, и известно, что они вовлечены в разнообразные клеточные сигнальные пути. Каждый член семейства РКС обладает специфическим профилем экспрессии, и считается, что он играет отдельную роль. Prkcq необходима для активации Т-лимфоцитов; интересно, что экспрессия близкородственного гена (Prkcz) увеличивается в скелетных мышцах множества линий мышей, хотя это было не подтверждено методом qPCR. В сердце, экспрессия увеличивается примерно в три раза с возрастом, и этому слабо препятствует CR.
Ингибитор сериновой (или цистеиновой) пептидазы, ветвь А, член 3N (Serpina3n): Было показано, что этот ген подавляет опосредуемый гранзимом В апоптоз в цитотоксических Т-лимфоцитах, и общий эффект увеличения экспрессии этого гена может привести к ингибированию апоптоза в иммунных клетках. В сердце мыши экспрессия этого гена увеличивается в четыре раза с возрастом, и CR практически полностью предупреждает это увеличение.
Фосфобелок 2, ассоциированный с src-семейством (Skap2): Белок, кодируемый этим генов, способствует адгезии иммунной клетки в участках воспаления. В сердце мыши экспрессия этого гена увеличивается примерно в два раза с возрастом, и CR не влияет на это увеличение.
Метаболизм
3-Гидроксибутиратдегидрогеназа, тип 1 (Bdh1): Этот ген кодирует члена семейства генов короткоцепочечных дегидрогеназ/редуктаз, и вовлечен в продукцию кетоновых тел путем катализа взаимопревращения ацетоацетата и 3-гидроксибутирата, основных кетоновых тел, продуцируемых в ходе катаболизма жирных кислот. В сердце мыши мы наблюдали слабое увеличение в экспрессии этого гена с возрастом, которое дополнительно увеличивалось под действием CR.
Фенилаланингидроксилаза (Pah):Pah кодирует фермент фенилаланингидроксилазу, которая представляет собой лимитирующую скорость стадию в катаболизме фенилаланина до тирозина. Недостаток активности этого фермента приводит к фенилкетонурии, нарушению с аутосомно-рецессивным типом наследования. В сердце мыши экспрессия этого гена увеличивается примерно в десять раз с возрастом, и CR снижает экспрессию этого гена до примерно в половину от регистрируемой в старых контролях.
Сердечная функция
Амилаза 1 (Amyl). Амилазы представляют собой секретируемые белки, которые гидролизуют 1,4-альфа-гликозидные связи в олигосахаридах и полисахаридах, и, таким образом, катализирует первую стадию расщепления поступающих с пищей крахмала и гликогена. Белок, кодируемый этим геном, может быть связан с сердечной функцией, поскольку сообщалось об увеличении уровня этого белка в плазме крови у людей с хронической сердечной недостаточностью. Ранее мы наблюдали увеличение в экспрессии этого гена в скелетных мышцах во множестве линий мышей, хотя этот ген не был идентифицирован в качестве супермаркера в мышцах. В сердце мыши, экспрессия этого гена увеличивается в ~2,5-раза с возрастом, и CR заметно на нее не влияет.
Гомолог рудимент-подобного 2 (Дрозофила) (Vgl12): Этот ген кодирует транскрипционный кофактор, который активирует дифференциацию скелетных мышц, следовательно, его экспрессия в сердце, вероятно, связана с поддержанием сердечных мышц в целом. В сердце мыши экспрессия этого гена увеличивается в ~7,5-раз с возрастом, и CR предупреждает примерно половину от возрастного увеличения в экспрессии.
Миотилин (Myot): Этот ген кодирует белок, обнаруженный в области z-дисков поперечнополосатых мышц и вовлеченный в поддержание структуры мышц и организацию саркомера. У людей, мутация в этом гене связана с одной из форм мышечной дистрофии. Экспрессия этого гена не сильно увеличивается с возрастом в сердце мыши, и CR не препятствует этому увеличению.
Кальсеквестрин (Casql): Кальсеквестрин представляет собой основной кальций-связывающий белок в саркоплазматическом ретикулуме, и высвобождение ионов кальция, связанных с Casql, приводит к сокращению мышц. Экспрессия этого гена снижается с возрастом, что, возможно, отражает снижение мышечного сокращения с возрастом в целом. Экспрессия этого гена не изменяется под действием CR.
Калиевый потенциал-зависимый канал, относящийся к семейству Shal, член 2 (Kcnd2): Белок, кодируемый этим геном, ответственен за выход калия в сердце, и экспрессия этого гена регулируется другими генами, чувствительными к уровню кальция. Экспрессия этого гена снижается на ~25% с возрастом, но не изменяется под действием CR.
Трансмембранный белок 16К (Tmem16k): Для этого гена нет данных о его функциях, однако согласно базе данных «Gene Ontology consortium» (Консорциум по генной онтологии), он представляет собой интегральный мембранный белок. Экспрессия этого гена увеличивается на ~50% с возрастом, и CR снижает экспрессию этого гена до такого низкого уровня, какой наблюдают у молодых контрольных мышей.
Для оценки общей эффективности вмешательства, разработанного для противодействия возрастным изменениям в экспрессии гена, полезно создать показатель, который позволит сравнивать эффективность вмешательства в противодействии экспрессии маркеров старения сердца. Ниже описаны два показателя, хотя также могут быть разработаны другие анализы. Каждый показатель представляет собой среднее от эффектов воздействия режима питания в противодействии возрастным изменениям в экспрессии гена; первый показатель рассматривает все 16 универсальных маркеров старения сердца, описанных в этом сообщении; второй показатель рассматривает только девять универсальных маркеров, которые изменяются как при старении, так и под действием CR. Для каждого гена «процент предотвращения» рассчитывают как процент изменения при старении, которому противодействует вмешательство. Например, величина, равная «100%», будет указывать на то, что воздействие режима питания поддерживает экспрессию гена на том же уровне, что наблюдают в молодых контролях. Оценка предупреждения, равная более чем 100%, будет указывать на сдвиг в экспрессии гена до уровня, который «моложе» того, что наблюдают в молодых контролях; наоборот, отрицательный процент предотвращения будет указывать на усиление экспрессии гена по сравнению с наблюдаемой в старых контрольных группах. Величины для каждого гена затем усредняют по всей обработке, и результирующий показатель выявляет степень, в которой воздействие может противостоять возрастным изменениям в экспрессии маркеров старения сердца. Для обоих показателей умеренное CR обладает наибольшей способностью противостоять возрастным изменениям в экспрессии маркеров старения сердца.
Пример 3
Этот пример описывает идентификацию транскрипционных маркеров старения в жировой ткани.
Для идентификации изменений в экспрессии гена в эпидидимальной жировой ткани семи линий мышей (129, C57BL6, Balbc, С3Н, СВА, DBA и B6C3HF1) применяют чип «Mouse Genome 430 2.0» компании «Affymetrix». Значительное изменение в экспрессии определяют с помощью двусторонних t-критериев для молодых против старых мышей (Р<0,05, п=7 мышей на линию на возрастную группу). Молодых мышей тестируют на пятом месяце жизни, старых мышей тестируют на 25-м месяце жизни. Таблица 4 показывает число генов, экспрессия которых значительно изменяется с возрастом в каждой линии и в таблице 5 перечислены все гены, экспрессия в которых изменяется, по меньшей мере, в пяти из семи линий.
Для подтверждения данных, полученных на чипе методом qPCR, отбирают тридцать один потенциальный маркер старения жировой ткани. При отборе генов-кандидатов для подтверждения методом RT-PCR, в первую очередь тестировали гены, экспрессия в которых изменилась во всех линиях. Другие факторы, которые необходимо учитывать, включают исключение генов с низкой экспрессией (которую оценивают по средней интенсивности сигнала в эксперименте с микропанелью) и исключение генов, которые не демонстрируют изменения в экспрессии, по меньшей мере, на 50% (<1,5 или>1,5-кратное изменение). Четыре гена, которые изменились во всех семи линиях, не имели доступного для приобретения праймера и, таким образом, эти гены не могли быть подвергнуты скринингу методом qPCR. Бета-актин (Actb) не изменялся ни в одной из линий и служил в качестве конститутивного гена для qPCR-анализов.
Для оставшихся 27-ми генов, идентифицированных в качестве кандидатов-маркеров старения жировой ткани, применяют qPCR-анализ для тестирования образцов из исследования по кормлению питательными веществами по примеру 1 для подтверждения возрастных изменений и противодействия возрастным изменениям в условиях умеренной CR. Статистически значимое изменение в экспрессии с возрастом при анализе методом qPCR наблюдали для 13 из 27 генов. Данные приведены в таблице 6. Было дополнительно определено, что восемь из этих 13-ти генов изменяются с возрастом, и CR предупреждает, по меньшей мере, примерно 33% возрастного изменения; эти восемь генов представляют собой: Aspn, Соl6а2, Crip2, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, RhbdB и Slc6al3.
Функциональная значимость маркеров старения жировой ткани обсуждается ниже. Гены, отвечающие на фактор роста
Аспорин (Aspn): Трансформирующий фактор роста бета (TGF-бета) представляет собой секретируемый белок, который играет роль в поддержании внеклеточного матрикса (ЕСМ), регулируя экспрессию генов, вовлеченных в поддержание цитоскелета (1). Аспорин представляет собой компонент ЕСМ, и было показано, что экспрессия аспорина индуцируется TGF-бета (2) в суставном хряще; мы наблюдали снижение в экспрессии аспорина (2-кратное) в жировой ткани с возрастом. Рассмотренные вместе, эти данные предполагают снижение в поддержании ЕСМ с возрастом в жировой ткани. CR может предупредить это снижение, поскольку CR практически полностью предупреждает возрастное снижение в экспрессии Aspn (1,8-кратное увеличение в старых CR против старых контрольных мышей).
Обогащенный цистеином белок 2 (Crip2): Хотя мало что известно о функции Crip2, похоже, что он принадлежит к семейству белков, вовлеченных в ремоделирование цитоскелета (3), и как с аспорином (выше), было показано, что экспрессия Crip2 индуцируется TGF-бета (4). Уровень экспрессии Crip2 был очень сходен с тем, что наблюдали с аспорином, включая значительное изменение в экспрессии с возрастом (в 2,3 раза), которое предупреждает CR (в 2,0 раза).
Ромбоид, жилко-подобный 3 (Rhbdl3): Белок, кодируемый геном Rhbdl3, характеризуется как наиболее эволюционно консервативная кДНК гена rho дрозофилы, которая модулируется сигналом эпидермального фактора роста, и играет некоторую роль в развитии нервной системы у мышей. Экспрессия этого гена сильно снижается с возрастом, и CR полностью предупреждает возрастные изменения в экспрессии этого гена (изменение в 6,2 раза с возрастом и увеличение в 7,2 раза с CR).
Таким образом, приведенные выше три гена представляют собой универсальные маркеры старения жировой ткани, которые регулируются факторами роста, экспрессия которых может модулироваться режимом питания.
Снижение в ЕСМ в сборке микрофибрилл с возрастом
Коллаген, тип VI, альфа 2 (Соl6а2): Коллаген VI представляет собой компонент внеклеточного матрикса, и мутации по гену Соl6а2 у людей связаны с некоторыми врожденными миопатиями из-за нарушенного образования микрофибрилл (6, 7). Ранее, в нашем исследовании универсальных маркеров старения в скелетных мышцах мыши мы показали, что экспрессия некоторых генов коллагена (Col1al, Col1a2 и Соl3а1) снижается с возрастом, и что этому снижению препятствует CR. Значительное снижение (снижение в 2,1 раза) в Соl6а2 в жировой ткани предполагает падение в поддержании ЕСМ с возрастом из-за снижения в сборке микрофибрилл.
Разделитель эластиновых микрофибрилл 2 (Emilin2). Мало что известно о функции Emilin2, хотя сообщалось о том, что он синтезируется и локализуется в ЕСМ. Emilin2 может выполнять некоторую роль в клеточной смерти через внешний апоптический путь, поскольку связывание апоптических факторов с Emilin2 приводит к активация каспазы. Альтернативно, другие исследователи предполагают, что повышенный уровень в сыворотке белка, кодируемого этим геном, может быть биомаркером рака яичников. В любом случае, наблюдали значительное снижение в экспрессии Emilin2 с возрастом в жировой ткани (-2,1 раза изменение с возрастом), и CR предотвращает возрастное изменение на ~35%.
Увеличение воспаления с возрастом
Фосфолипаза А2, группа IID (Pla2g2d): Фосфолипазы А2 (PLA2) хорошо известны из-за их способности приводить к мобилизации жирные кислоты из фосфолипидов, которые затем превращаются в провоспалительные простагландины и лейкотриены (11). Интересно, что повышенный уровень PLA2 может иметь последствия вне мобилизации липидов, поскольку увеличение внеклеточного PLA2 связано с увеличенным уровнем провоспалительных цитокинов TNFcc и интерлейкина 1 (12). Экспрессия гена Pla2g2d увеличивается в 3,1 раза с возрастом и частично (но незначительно) предупреждается CR (изменение в экспрессии в 1,4 раза).
Менее охарактеризованные гены
Отопетрин 1 (Otopl): Единственное сообщение, касающееся функция Otopl, говорит о том, что он важен для образования отолитов, структур внутреннего уха, которые ответственны за восприятие силы тяжести и нагрузки (13). Поскольку эти структуры формируются путем кристаллизации карбоната кальций, вероятно, что функция этого гена в жировой ткани имеет отношение к гомеостазу кальция. Экспрессия Otopl увеличивается в 3,0 раза с возрастом и частично (но не значительно) предупреждается CR (изменение в экспрессии в 1,5 раза).
Семейства переносчиков растворенных веществ 6, член 13 (Slc6al3): Не существует сообщений относительно функции этого гена у мышей или людей. Однако по единственному исследованию на крысах (14) можно предположить, что белок, кодируемый геном Slc6al3, вовлечен в транспорт нейромедиатора, гамма-аминомасляной кислоты (GABA). Экспрессия Slc6al3 снижается (изменение в 1,8 раз) с возрастом и это снижение частично (но незначительно) предупреждается CR (изменение в 1,3 раза по сравнению со старыми контролями).
Для оценки общей эффективности воздействия, разработанного для противодействия возрастным изменениям в универсальных маркерах старения, полезно создать показатель, который позволит сравнивать, как воздействие противодействует экспрессии универсальных маркеров старения. Соответственно, «показатель предупреждения старения » рассчитывают для описания среднего эффекта воздействия на возрастные изменения в экспрессии восьми универсальных маркеров старения жировой ткани.
Для каждого из восьми универсальных маркеров старения жировой ткани, рассчитывали «процент предотвращения» как процент изменения в старении, которому противодействует воздействие. Например, величина, равная «100%» будет указывать на то, что воздействие режима питания поддерживает экспрессию гена том же уровне, что наблюдают в молодых контролях. Оценка предупреждения, превышающая 100%, будет указывать на сдвиг в экспрессии гена до уровня, который «моложе» того, что наблюдают в молодых контролях; наоборот, отрицательный процент предотвращения будет указывать на то, что экспрессия гена усилилась по сравнению с наблюдаемой в старых контрольных группах. Величины для каждого гена затем усредняют по всей обработке, и результирующий показатель выявляет итоговую степень, в которой воздействие может противостоять возрастным изменениям на уровне транскрипции.
Пример 4
Этот пример описывает идентификацию транскрипционных маркеров старения в мозговой ткани.
Для идентификации изменений в экспрессии гена в неокортексе шести линий мышей (C57BL6, Balbc, С3Н, СВА, DBA и B6C3HF1) применяют чип «Mouse Genome 430 2.0» компании «Affymetrix». Значительное изменение в экспрессии определяют с помощью двусторонних t-критериев для молодых против старых мышей (Р<0,05, n=7 мышей на линию на возрастную группу). Молодых мышей тестируют на пятом месяце жизни, старых мышей тестируют на 25-м месяце жизни.
Таблица 7 показывает число генов, которые значительно изменяются с возрастом в каждой линии. В таблице 8 перечислены все гены, экспрессия в которых изменяется, по меньшей мере, в трех из шести линий.
Восемнадцать потенциальных маркеров старения мозга отбирают для подтверждения данных чипа методом qPCR. Гены отбирают на основании множества факторов, включая но, не ограничиваясь: избыточную экспрессию в эксперименте с микрочипом, надежные изменения в экспрессии в линии В6, предварительную информацию о генах, ассоциированных со старением мозга. С помощью РНК-образцов из мышей В6, примененных в исследовании с чипом, qPCR-анализ выявил, что 13/18 генов показали изменение в экспрессии с возрастом. Эти 13 генов приведены в таблице 9. Было дополнительно установлено, что восемь из 13-ти генов изменяются с возрастом, и CR предупреждает, по меньшей мере, примерно 33% возрастных изменений; эти восемь генов представляют собой: Apod, B2m, Clqa, Clqb, Ctsd, Gfap, I133, Lyzs и Sppl.
Маркеры старения мозга, идентифицированные выше, применяют для оценки эффективности CR в противодействии возрастным изменениям при старении мозга. Степень, в которой CR может противостоять возрастным изменениям в экспрессии («процент предотвращения»), определяют с помощью показателей, описанных в предыдущих примерах.
Многие из тех генов, о которых ранее сообщалось, что они представляют собой биомаркеры старения, были идентифицированы в исследованиях на чипе и подтверждены методом qPCR, включая Cd68, Ctsd и Gfap. CR противодействует изменениям в экспрессии для Ctsd, но только умеренно эффективно для Cd68 и Gfap.
Для некоторых генов было показано, что они обладают нейропротективным действием, если экспрессия резко усиливается, но действуют губительно, если оверэкспрессируются длительное время (например, при старении). Некоторые из этих генов включают Apod, Clqa и Clqb. Умеренная CR-диета противостоит изменениям в Apod. CR противостоит увеличению в экспрессии Clqb, наблюдаемому с возрастом и у всех мышей, получавших добавки.
Наблюдали заметное увеличение в экспрессии генов, вовлеченных в иммунный ответ и в воспалительные ответы (например, B2m, Сlec71, Cst7, I133, Lgals3). Это находится в строгом соответствии с предыдущими сообщениями об увеличении нейровоспаления с возрастом. Сообщали о том, CR противостоит возрастным изменениям в экспрессии нейровоспалительных генов, хотя, похоже, CR противостоит только возрастному увеличению в экспрессии В2 т.В целом, изменения в экспрессии воспалительных супермаркеров было большим (в особенности, Clec7а и Cst7) и устойчивым к воздействию режима питания в этом исследовании. Однако было показано, что значительное ограничение в калорийности потребляемой пищи (~40%) противодействует возрастным изменениям в генах, ответственных за нейровоспаление, таким образом, альтернативные воздействия обладают потенциалом для противодействия возрастным изменениям в этих супермаркерах.
Наконец, много маркеров ассоциировано с нейродегенеративными нарушениями, такими как болезнь Альцгеймера (например, Apod, Clqa, Clqb, Ctsd, Lyzs, Sppl). Предполагают, что ограничение в калориях противодействует прогрессии болезни Альцгеймера у людей и в моделях заболевания на мышах. Соответственно, умеренное CR, примененное в этом исследовании противодействует возрастным изменениям во многих их этих генов.
Основная информация о сообщаемых или предполагаемых функциях генов, представляющих собой маркеры, приведена ниже.
Apod: Сообщали, об увеличение экспрессии аполипопротеина D при различных неврологических нарушениях, включая болезнь Альцгеймера, шизофрению и инсульт, и при старении мозга. Apod может представлять собой белок, отвечающий на стресс, поскольку сообщалось, что оверэкспрессия этого гена в дрозофиле приводит к нейропротекции и удлинению продолжительность жизни. Таким образом, уровень Apod коррелирует с уровнем эндогенного стресса.
В2М: бета-2-микроглобулин (часть класса I молекул комплекса основной гистосовместимости) также представляет собой известный маркер воспаления, и ранее было показано его увеличение с возрастом в спинномозговой жидкости пожилых людей и в мозге людей с болезнью Паркинсона.
Clqa и Clqb: По имеющимся данным эти гены задействованы во врожденном иммунитете и представляют собой маркеры воспаления, которые, как мы показали ранее, активируются с возрастом в мозге мыши, и было также показано, что они активируются при нейродегенеративных заболеваниях человека, таких как болезнь Альцгеймера.
Cd68: также известен как макросиалин, Cd68 представляет собой макрофаг-специфический белок, экспрессия которого, по имеющимся данным, увеличивается при старении в отдельных областях мозга самцов мышей C57BL/6NNia, и считается, что он экспрессируется в микроглии.
С1ес7а: также известен как Dectin-1, по имеющимся данным, этот рецептор может индуцировать множество клеточных ответов в макрофагах, включая фагоцитоз, окислительный взрыв и продукцию цитокинов. Этот ген кодирует члена суперсемейства С-тип лектин/С-тип лектин-подобный домен (CTL/CTLD). Кодируемый гликобелок представляет собой небольшой, типа II, мембранный рецептор со складкой внеклеточного лектин-подобного домена С-типа и с цитоплазматическим доменом с тирозиновым мотивом активации иммунорецептора. По имеющимся данным он функционирует как распознающий структуру рецептор, который распознает множество бета-1,3-связанных и бета-1,6-связанных глюканов из грибов и растений, и, таким образом, играет некоторую роль во врожденном иммунном ответе. Охарактеризованы альтернативные транскрипционные сплайсированные варианты, кодирующие разные изоформы. Этот ген тесно связан с другими членами суперсемейства CTL/CTLD на хромосоме 12р13 в природном участке комплекса ген-киллер.
Cst7: Цистатин F представляет собой гликозилированный низкомолекулярный ингибитор цистеиновой протеиназы человека. Цистатины представляют собой важные природные ингибиторы цистеиновых протеаз, нацеленные на первоначально папаин-подобные цистеиновые протеазы, включая катепсины и протеазы паразитов, такие как круципаин, а также аспарагиниловые эндопептидазы млекопитающих. Цистатин F млекопитающих, который экспрессируется практически исключительно в гемопоэтических клетках и аккумулируется в лизосомо-подобных органеллах, вовлечен в регуляцию презентации антигена и другие иммунные процессы. Он представляет собой необычный цистатин, член суперсемейства с описанным редокс-регулируемым механизмом активация и ограниченным профилем специфичности.
Ctsd: Катепсин D представляет собой основную липосомальную протеазу, и недавно сообщалось о мутациях в Ctsd, которые делают ее энзиматически дефектной, в подгруппах нейронного восковидного липофусциноза/болезни Баттена. Фенотип этого заболевания не требует Вах-опосредуемого апоптоза, а напротив, вероятно, опосредуется через аутофагию. Катепсин D-опосредуемый протеолиз аполипопротеина Е может участвовать в болезни Альцгеймера. Сообщалось также об активации липосомальной системы в экспериментальных моделях нейронального повреждения.
Gfap: Глиофибриллярный кислый белок представляет собой классический маркер активация астроцитов и, возможно, наиболее хорошо изученный маркер старения мозга. Этот ген кодирует один из основных белов промежуточных филаментов зрелых астроцитов. Его применяют в качестве маркера для того, чтобы при исследовании отличить астроциты от других глиальных клеток. Мутации в этом гене вызывают болезнь Александера, редкое нарушение астроцитов в центральной нервной системе.
I133: Плохо охарактеризованный цитокин, сообщалось, что IL-33 представляет собой белок с двойной функцией, который может функционировать и как провоспалительный цитокин, и как внутриклеточный ядерный фактор со свойствами регулятора транскрипции.
Lgals3: Галектин-3 представляет собой мульти-функциональный белок и, по имеющимся данным, участвует в опосредовании воспалительных реакций. По сообщениям, галектин-3 активируется в микроглиальных клетках. Интересно, что галектин-3, по имеющимся сведениям активирует адгезию нейрональных клеток и рост нейритов.
Lyzs: Также, известен как лизоцим, он представляет собой плохо охарактеризованный и, предположительно, липосомальный белок, который широко распространен в лейкоцитах и вовлечен в воспалительные реакции.
Spp1: Секретируемый фосфобелок-1, также известный как остеопонтин, представляет собой секретируемый аргинин-глицин-аспартат (RGD)-содержащий фосфобелок. Похоже, что Spp1 оверэкспрессируется при болезни Паркинсона. Остеопонтин (OPN) вовлечен в воспалительные процессы и в процессы заживления ран, включая аутоиммунный увеит.
Пример 5
Этот пример описывает идентификацию транскрипционных маркеров старения в мышечной ткани. Для создания панели генов, которые, вероятно, представляют собой надежные маркеры старения в скелетных мышцах мыши, проводят анализ транскрипционного профиля с помощью чипа «Mouse Genome 430 2.0» компании «Affymetrix» в икроножных мышцах мышей из семи линий: 129/J, C57BL/6, CBA/J, DBA2J, С3Н/HeJ, Balb/c и B6C3HF1. Анализ профиля проводят на семи молодых (пять месяцев жизни) и семи старых (28-30 месяцев) мышах из каждой линии. Двусторонние t-критерии выполняют для тестирования на статистическую значимость изменения в экспрессии гена с возрастом. Из -21000 транскриптов, представленных на панели, 172 транскриптов значительно (Р<0,05) изменились с возрастом, по меньшей мере, в шести из семи линий (таблица 10).
Из 172 транскриптов, которые были идентифицированы в анализе с микрочипом, методом qPCR анализируют 21 ген для определения изменений в экспрессии с возрастом и под действием CR. Гены выбирают с помощью нескольких критериев - гены отбирают на основании известной биологической функции, если они имели относительно избыточную экспрессию в анализе на чипе и/или если исследования, опубликованные в престижных журналах, предполагают его участие в старении мышц. RT-PCR анализ проводят, применяя прибор «Applied Biosystems 7000» с помощью имеющихся в продаже PCR-праймеров, разработанных компанией «Applied Biosystems». TATA box-связывающий белок (Tbp) применяют в качестве внутреннего контроля для всех RT-PCR анализов, поскольку ранее было показано, что этот ген не изменяется с возрастом или под действием CR. Из 21-го протестированного гена, 13 генов показали изменение в экспрессии с возрастом, по меньшей мере, в шести из семи линий (таблица 11). Из 13-ти генов, одиннадцать продемонстрировали обращение под действием CR. Эти одиннадцать генов представляют собой: С4, Cdkn2c, Cds1, Col1a1, Col1a2, Col3a1, Edg2, Igh-6, Mt2, Р1k2 и Syt9.
Из генов, приведенных в таблице 11, два могут быть широко классифицированы, как вовлеченные в воспалительный ответ (С4 и Igh6), два быть широко классифицированы по поврежденной ДНК / контрольной точке клеточного цикла (Cdkn2c и Р1к2), два могут быть классифицированы по ответу на стресс (Mt2 и Dusp26), один (Cdsl) может быть широко классифицирован, как вовлеченный в биосинтез, один может быть классифицирован, как вовлеченный в кальциевый метаболизм (Syt9), и пять генов (Col1a1, Col1a2, Col3a1, Edg2, Rhpn2) могут быть классифицированы, как вовлеченные в ремоделирование цитоскелета.
После того как подходящая панель биомаркеров была подтверждена посредством qPCR (в отношении изменений с возрастом и, в большинстве случаев, обращения изменение под действием CR), экспрессию этих гены анализируют в образцах mRNA из исследования по питательным веществам по примеру 1. Ниже обсуждаются результаты, имеющие отношение к специфическим маркерам, наряду с описанием известной по данным литературы функциональной значимости этих маркеров.
Комплемент С4: Четвертый компонент каскада комплемента представляет собой существенный фактор во врожденном иммунитете. Его активацию наблюдают при нормальном старении мозга у людей, а также в мозге людей с болезнью Альцгеймера. Разные аллели С4 у людей связаны со здоровьем и продолжительностью жизни, можно предположить, что статус С4 прямо воздействует на здоровье. Комплемент С4 также связан с аутоиммунными заболеваниями.
Igh-6: Igh6 представляет собой антиген В-клеток, необходимый для созревания В-клеток. Дефицитных по Igh6 мышей обычно применяю в качестве модели дефицита В-клеток. Таким образом, увеличение Igh-6 в скелетных мышцах с возрастом может быть вторичным по отношению к увеличению в инфильтрации В-клеток в этой ткани, которая в этих исследованиях полностью предупреждается CR.
Cdkn2C (р18): CdKn2C, также известный как pl8INK4c, представляет собой ингибитор циклинкиназы (CKI) Gl-фазы. Он представляет собой один из нескольких CKI, вовлеченных в арест клеточного цикла в ответ на повреждение ДНК. Ингибиторы CKI представляют собой гены-супрессоры опухоли, поскольку мутации как в р18, так и в родственном р16, приводят к образованию опухолей. В частности р16 связан с клеточным старением компартмента популяции взрослых стволовых клеток. Вероятно, наблюдамая возрастная активация р18 отражает накопление повреждений ДНК.
Plk2: Polo-киназа 2 представляет собой polo-подобную киназу, экспрессируемую в G1 в культивируемых клетках и некоторых тканях животных, которая функционирует в ответ на повреждение ДНК. Polo, «основатель» этого семейства генов, был идентифицирован в дрозофиле и участвует в контролировании клеточного деления.
Mt2: Металлотионеины (I, II и III) представляют собой низкомолекулярные, обогащенные цистеином металлсвязывающие белки, обнаруженные у широкого круга организмов, о которых известно, что они индуцируются в самых разнообразных стрессовых состояниях. Поскольку эти белки контролируют перенос внутриклеточного цинка, считается, что контроль уровня цинка с помощью металлотионеинов представляет собой важный аспект в защите клетки от стресса.
Dusp26: DUSP (тирозин-фосфатазы с двойной специфичностью) похожи на тирозинфосфатазы, поскольку обладают характерным для тирозинфосфатаз доменом (I/V)HCXAGXGR(S/T), вовлеченным в их каталитическую активность. Были идентифицированы многие члены этого класса, включая DUSP1-9, DUSP16 и DUSP-26, также, известные как МКР 8. Все эти белки дефосфорилируют сериновый/треониновый и тирозиновый остатки на разных членах семейства МАР-киназы, что приводит к их инактивации. DUSP активируются стимулами, которые запускают МАР-киназные пути, такие как тепловой шок, митогены и гипоксия. Недавно было показано, что Dusp26 ассоциирован с транскрипционным фактором теплового шока 4b, что связало этот DUSP с ответом на тепловой шок. Удивительно, но CR не способно предупредить возрастную индукцию Dusp26 Cdsl: CDP-диацилглицерол-синтаза представляет собой скорость-лимитирующий фермент, вовлеченный в биосинтез глицеролипидов, которые служит в качестве предшественников как фосфоинозитидов, так и фосфатидилглицерола. Считается, что CDP-диацилглицерол-синтазы регулируют активность путей биосинтеза фосфолипидов.
Edg2: Экспрессия Edg2 (эндотелиальной дифференциации, лизофосфатидиловой кислоты G-белок-сопряженный рецептор, 2) снижается с возрастом, и это снижение полностью предупреждается CR. Лизофосфатидиловая кислота индуцирует перестройку цитоскелета, и поскольку Edg2 представляет собой рецептор для этой молекулы, эти результаты обобщают общую закономерность, показанную в этом исследовании, что ремоделирование цитоскелета представляет собой обычный признак старения в скелетных мышцах мыши.
Col1a1, Col1a2, Col3a1: Col1a и Соl1а2 кодируют цепи проколлагена типа I. Мутации в этих генах связаны с заболеванием, несовершенный остеогенез у человека. Насколько нам известно, этот результат представляет собой первое обнаружение скоординированной отрицательной регуляции генов коллагена при старении. Три гена про-коллагена (Col1a1, Col1a2, Соl3а1) продемонстрировали изменения с возрастом, которым противодействовало CR.
Rhpn2: Рофилин 2 представляет собой Rho ОТРаза-связывающий белок. Предполагается, что он играет некоторую роль в эндоцитозе и на основании скрининга двугибридных дрожжей было сделано предположение, что компоненты цитоскелета являются партнерами рофилина 2.
Syt9: Кальций входит в пресинаптические окончания, и нейроэндокринные клетки запускают экзоцитоз в синаптических и секреторных пузырьках. Синаптотагмины, включая Syt9, представляет собой кальций-связывающие белки, которые, как считается, представляет собой кальциевые сенсоры для экзоцитоза.
Описание раскрывает типичные предпочтительные воплощения изобретения. Хотя применяют специфические термины, их применяют только в общем и описательном смысле и не для целей ограничения, объем изобретения изложен в формуле изобретения. Ясно, что возможны многие модификации и вариации изобретения в свете вышеприведенных сведений изобретения. Следовательно, понятно, что в рамках объема прилагаемой формулы изобретения изобретение может быть применено на практике иначе, чем конкретно описано.
Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу идентификации изменений в экспрессии генов, характерных для старения, в выбранной ткани. Выбранная ткань представляет собой сердечную, мышечную, мозговую или жировую ткань. Способ включает отбор одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в ткани старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, с применением двух критериев. Указанными критериями являются изменение экспрессии по меньшей мере в 50% линий, пород или этнических групп тестируемых видов на заранее определенном уровне значимости в р<0.10, а также по меньшей мере частичное обращение изменений в экспрессии генов путем ограничения в калорийности. Изобретение обеспечивает получение надежных тканеспецифических биомаркеров старения. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 11 табл., 5 пр.
1. Способ идентификации изменений в экспрессии генов, характерных для старения, в выбранной ткани, где выбранная ткань представляет собой сердечную, мышечную, мозговую или жировую ткань, включающий
отбор одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в ткани старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, применяя первый критерий, что
(i) один или несколько генов дифференциально экспрессируются по меньшей мере в 50% линий, пород или этнических групп тестируемых видов на заранее определенном уровне значимости в p<0.10, и вторым критерием, что
(ii) изменение в экспрессии одного или нескольких генов у старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами по меньшей мере частично обращается путем ограничения в калорийности.
2. Способ по п. 1, в котором выбранный ген дифференциально экспрессируется в трех или более линиях, породах или этнических группах.
3. Способ по п. 1, в котором выбранный ген дифференциально экспрессируется в пяти или более линиях, породах или этнических группах.
4. Способ по п. 1, в котором выбранный ген дифференциально экспрессируется, по меньшей мере, в 75% протестированных линий, пород или этнических групп.
5. Способ по п. 1, дополнительно включающий тот критерий, что известно или предполагается, что ген, дифференциально экспрессируемый у старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, ассоциирован с одной или несколькими связанными со старением физиологическими функциями.
6. Способ по п. 1, в котором вид представляет собой собаку или кошку.
7. Способ детектирования дифференциальной экспрессия одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в выбранной ткани у старых субъектов в сравнении со стандартом или с молодыми субъектами, где выбранная ткань представляет собой сердечную, мышечную, мозговую или жировую ткань, включающий:
(a) обеспечение зондов, содержащих
(i) полинуклеотиды, которые специфически гибридизуются с двумя или более генами, кодирующими белки или их фрагменты, где ткань представляет собой сердечную ткань, а белки включают по меньшей мере один из следующих: Amy1, Apod, Bdh1, C3, Casq1, Ccl8, Kcnd2, Lcn2, Mt2, Myot, Pah, Prkcq, Serpina3n, Skap2, Tmem16k и Vgll2; где ткань представляет собой жировую ткань, а белки включают по меньшей мере один из следующих Aspn, Clec4n, Col6a2, Col18a1, Cox8b, Crip2, Ear11, Emilin2, Otop1, Pla2g2d, Rhbdl3, Slc6a13 и Sycp3; где ткань представляет собой мозговую ткань, а белки включают по меньшей мере один из следующих: Apod, B2m, Cd68, Clec7a, Cst7, Ctsd, Gfap, Il33, Lyzs и Spp1; где ткань представляет собой мышечную ткань, а белки включают по меньшей мере один из следующих: С4, Cdkn2c, Cds1,, Col1a2,, Dusp26, Edg2, Igh-6, Mt2, Plk2, Rhpn2 и Syt9; или
(ii) связывающие полипептиды агенты, которые специфически связываются двумя или более белками, выбранными из белков Adh1, Agtrl1, Akr1b8, Aldh1a1, Alox5ap, Amy1, Angptl2, Ankrd1, Anxa1, Apod, Apoe, Asah3l, Asph, Atp6v0e2, Atp6v1c1, Atp9a, Atxn10, BC023892, Bckdhb, Bdh1, Bre, Bysl, C1r, C3, Cacna2d1, Camk2n1, Casq1, Ccdc72, Ccl6, Ccl8, Ccnd1, Cd163, Cdh22, Cebpd, Cfb, Chek2, Churc1, Cilp, Ckb, Clic5, Col3a1, Col8a1, Cp, Cpxm2, Ctgf, Ctss, Cxcl14, Cyb5r3, Cyp27a1, Dalrd3, Dbnl, Dhrs1, Dhrs7c, Dpep1, EG665317, Ehbp1l1, Ehmt2, Enpp2, Fads1, Fbln2, Fcgr3, Fez2, Fgfr1op2, Fkbp5, Fmo2, Ftl2, Fxyd6, Fzr1, Gcdh, Gda, Gpm6b, Hlx1, Hod, Hp1bp3, Icam1, Ier3, Ifit1, Il4ra, Isoc1, Itm2a, Jph2, Kbtbd2, Kcnd2, Kcne1, Klhdc1, Lcn2, Lect1, Letm1, Lgals3bp, Lrp1, Lrp11, Ly6a, Man2a1, Mef2a, Mfge8, Mgp, Mier3, Mlf1, Mrc1, Mt2, Mybpc3, Myom2, Myot, Ndrg4, Nfkbia, Npr3, Nt5c2, Oas2, Osmr, Pah, Pbxip1, Pde1c, Pdlim4, Pgm5, Phlda1, Pkn2, Pld3, Plp2, Postn, Ppp1r3b, Prg4, Prkar1a, Prkcq, Ranbp5, Rnf5, Rpl3l, Rras, Rtn2, Rtn4, Scn1b, Scn4b, Serpina3n, Serpine2, Skap2, Slc6a6, Snx10, Socs3, Srf, Svep1, Tbc1d10c, Tfpi, Tgfb2, Tgm2, Thbs2, Thbs4, Timp2, Tln1, Tmem16k, Tmem176a, Tmem43, Tnfaip8, Tomm40, Tpte2, Trim47, Tspan13, Tspan17, Uap1l1, Ube2z, Uchl1, Vgll2, Vwf, Wdr13, Wisp2, Wtap, Yipf7, Zadh2, Zfp697, Amotl1, Cdc42ep1, Chkb, AI597468, Flna, Mst1r, Nmb, Nsd1, Nap1l5, Otop1, Osbpl8, Pla2g2d, Polr2d, Pcdhb22, 4921524J17Rik, Rc3h2, Rbms3, Akap2, Aco2, Acsf3, Acadl, Acadvl, Arf2, Arl5b, Ankib1, Anxa2, Aspn, Abcd4, Bmp1, C1galt1c1, Cidea, Coq9, Col5a2, Col6a1, Col6a2, Col18a1, Clec4n, Crip2, Cyb5r1, Cox4i1, Сох6 с, Dnmt3a, Dnaja3, Emilin2, Ear11, Efemp1, Fbxo6, Fndc3b, Fyttd1, Gcnt2, Gpd2, Gnb4, Hddc3, Hfe, Hadha, C130006E23, Hif1a, Itga6, Irf7, Ldhb, Lace1, Lxn, Lenep, Lims1, Macrod1, Msln, Myadm, Gnptg, Ndufa10, Ndufa5, Ntn4, Ntrk3, Nmnat3, Nid1, Ogdh, Ptcd3, Ppic, Pxdn, Kcnj15, EG665378, Prss23, Pim1, Rmnd1, Rp2h, Arhgef10, Rhbdl3, 1810013D10Rik, 2010005J08Rik, 2810482I07Rik, 4933439C20Rik, 9530058B02Rik, D830012I24Rik, Sec23a, Sema4a, Serpina3n, Serpinf1, Serhl, LOC100047339, LOC100046998, LOC100046740, Smcr7, Slc46a3, Slc6a13, Stard3nl, Sdhb, Suclg1, Sucla2, Supv3l1, Syngr1, Sycp3, Tspan2, Tanc1, Timm44, Usp47, Uckl1, Vps13a, Vash1, Vcan, Wwtr1, Zkscan17, Abca8a, Adamtsl4, Agxt2l1, AI465270, AI838057, Ak3l1, Alad, Alkbh3, Ankrd17, Ankrd39, Anln, Anxa4, Anxa5, Apod, Arid4a, Arl2, Arpc1b, Aspa, Atp2b1, B2m, BC035295, BC061194, Bcor, Bid, Bok, C030017B01Rik, C130006E23, C1qa, C1qb, C1qc, C330006P03Rik, Calb2, Camsap1l1, Capns1, Cast, Ccnd2, Ccs, Cd14, Cd52, Cd59a, Cd68, Cd74, Cd81, Cd9, Cdh11, Cdh8, Cdkl2, Cebpd, Cend1, Chkb, Cited1, Clec7a, Cmtm3, Cmtm5, Cnksr2, Cnn3, Cntn6, Commd9, Comtd1, Cope, Coro1b, Crim1, Cst7, Ctsd, Ctss, Ctsz, Cyb5r1, Cyba, Cyp20a1, Cyp27a1, D12Ertd647e, D19Wsu12e, D1Ertd471e, Ddc, Ddt, Dhrs1, Diap2, Dnalc1, Dusp6, E330009J07Rik, Efha1, EG434128, Egr1, Egr3, Epha4, Ephx1, Ero1lb, Eya4, Fahd2a, Fbxo39, Fcer1g, Fcgr3, Fnbp1l, Fndc3b, Foxg1, Fxyd1, Gabrb3, Gal, Gatm, Gda, Gfap, Golph2, Gprin3, Gpx3, Grhpr, Gria3, Gstm1, Gstm6, Gstm7, Gsto1, Gstt3, Gtf2f1, H2-D1, H2-M3, Hapln2, Hebp2, Hectd2, Helz, Homer1, Hsd17b11, Hsd3b7, Idh2, Ier3, Ifit3, Ifitm3, Ikbkg, Il33, Imp4, Itih3, Jmjd1c, Kcnf1, Kcnj16, Kcnv1, Klf10, Klf9, Klk6, Lcat, Lcp1, Lefty1, Lgals3, Lgals8, Lhfp, LOC629605, LOC672274, Loh11cr2a, Lyzs, M6prbp1, Malat1, Marcks, Mccc2, Mdk, Mfhas1, Mrpl10, Mysm1, Nfyb, Nol4, Ntsr2, Optn, Pank3, Pcdh17, Pcdh8, Pcdhb2, Pcdhb21, Pcdhb9, Pcolce2, Peci, Phlda1, Plek, Plekhf1, Plxna2, Pmp22, Ppap2c, Ppm1d, Ppp5c, Prdm5, Psmb8, Psmb9, Ptpn12, Pvrl3, Rab11fip2, Rabl3, Rcbtb2, Sbno1, Shox2, Slc14a1, Slc15a4, Slit2, Slit3, Sord, Sos2, Sparc, Spp1, Spred2, Ssbp3, Sstr4, St18, Suhw4, Tcea2, Th, Tmbim1, Tmem144, Tmem176a, Tmem176b, Tnnt1, Tnnt2, Trf, Tspan4, Tspo, Ube2j1, Ubtd2, Vim, Wwox, Zfp292, Zmat5, Zswim6, Zwilch, Acsl6, Actr1a, Adcy2, Agtrl1, Akr1b8, Aldh1a1, Amy1, Ankrd32, Antxr2, Apod, Arrdc4, Atp13a5, AU018740, B3gnt1, C4, Cd209b, Cdkl2, Cdkn2c, Cds1, Ces2 /// LOC546098, Chad, Chodl, Chrna1, Chrnb1, Cilp2, Clybl, Col11a1, Col1a1, Col1a2, Col3a1, Col4a1, Col5a2, Col6a1, Cpne2, Csprs, Ctnnbl1, Cuzd1, Cyt1, Ddx6, Dhx36, Dmn, Dmxl2, Dnajb14, Dusp26, E030025D05Rik, Edg2, Efha1, Egfl6, Eif2c2, Emb, Fbxl4, Fmo2, Fmod, Fscn1, Fut8, Gadd45a, Gca, Gdap10, Gna14, Gtl2 /// Lphn1, Hist1h3i, Hn1, Homer2, Hook1, Hook3, Hsd17b7, Icam1, Igh-6, Itih5, Jarid1b, Jmjd3, Kcnab1, Kera, Krt1-18, Lgals3, LOC241944, LOC545323, Lpgat1, Lrp11, Mfap4, Mgst1, Mia3, Mll3, Mll5, Mt2, Mtap7, Myo5a, Nipa1, Nxn, Opcml, Pb1, Pcgf4, Pdcd6ip, Pkp2, Plekhb1, Plk2, Plp2, Prkcz, Pura /// 6330411E07Rik, Purb, Pvrl3, Rgs5, Rhpn2, Rnf125, Sbno1, Serpina3n, Serpinf1, Sh3bp5, Slc4a10, Smc4l1, Spint2, Supt3h, Syt9, Taf9l, Tekt1, Tnmd, Trim41, Ttc14, Ttc9c, Ubn1, Vsig4, Vtn, Wif1, Zdhhc21, Ces2, или их фрагментами;
(b) добавление зондов к образцу, содержащему мРНК или белки из старого субъекта, так, чтобы могла осуществиться гибридизация или связывание зондов с мРНК или белками в образце, формируя таким способом комплексы гибридизации или связывания в образце;
(с) необязательно, добавление зондов к другому образцу, включающему мРНК или белки из молодого субъекта, так чтобы могла осуществиться гибридизация или связывание зондов с мРНК или белками во втором образце, формируя тем самым комплексы гибридизации или связывания в другом образце;
(d) детекцию гибридизационных комплексов в образце или образцах; и
(e) сравнение комплексов гибридизации или связывания из первого образца с комплексами гибридизации или связывания из стандарта или, необязательно, из другого образца, в котором, по меньшей мере, одно различие между количеством гибридизации или связывания в образце в сравнении со стандартом или необязательным другим образцом указывает на дифференциальную экспрессию одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых у старых субъектов;
где вид представляет собой собаку или кошку.
| US 20080254464 A1, 16.10.2008 | |||
| LUND J | |||
| et al., Transcriptional Profile of Aging in C | |||
| elegans, Current Biology, 2002, Vol | |||
| Способ гальванического снятия позолоты с серебряных изделий без заметного изменения их формы | 1923 |
|
SU12A1 |
| ZAHN J.M | |||
| et al., AGEMAP: A Gene Expression Database for Aging in Mice, PLoS Genetics, 2007, Vol.3, Issue 11, e201, pp.2326-2337 | |||
| МОСКАЛЕВ А.А., К Вопросу о Генетической Обусловленности Процессов Старения, Успехи Геронтологии, 2008, Т.21, N3, стр.463-469 | |||
