РЕКОМБИНАНТНЫЙ АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫЙ ВИРУС, ЯВЛЯЮЩИЙСЯ ГИБРИДОМ СЕРОТИПОВ AAV9 И AAVrh74, С ПОНИЖЕННЫМ ТРОПИЗМОМ К ПЕЧЕНОЧНОЙ ТКАНИ Российский патент 2024 года по МПК C12N15/864 A61K48/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к капсиду рекомбинантного аденоассоциированного вируса (AAV), являющегося гибридом капсидного белка AAV серотипа 9 (AAV9) и капсидного белка AAV серотипа rh74 (AAVrh74), обладающему тропизмом к печеночной ткани, пониженным по сравнению с таковым исходных капсидных белков AAV9 и AAVrh74. Данное изобретение относится также к векторным частицам на основе AAV гибридного серотипа, несущим нужный ген, и к их применению в генной терапии, в частности для лечения генетически обусловленных нервно-мышечных заболеваний.

Уровень техники

Векторы на основе рекомбинантных аденоассоциированных вирусов (rAAV) широко используются для переноса генов in vivo. Векторы на основе rAAV представляют собой безоболочечные частицы, состоящие из капсида диаметром 20 нм и одноцепочечной ДНК размером 4,7 килобаз (кб). В геноме имеются два гена - rep и cap, фланкируемые двумя палиндромными областями, называемыми инвертированными концевыми повторами (ITR). Ген cap кодирует три структурных белка, обозначаемых VP1, VP2 и VP3, которые образуют капсид AAV. У белков VP1, VP2 и VP3 одинаковый С-концевой участок, последовательность которого составляет весь белок VP3. В аденоассоциированном вирусе серотипа 2 (AAV2), который можно взять за типичный, белок VP1 состоит из 735 аминокислотных остатков (GenBank YP_680426); последовательность VP2 включает 598 аминокислотных остатков, начиная с треонина в 138-м положении (T138), в VP3 533 остатка, его последовательность начинается с метионина в 203-м положении (M203). Серотипы AAV определяются по капсиду. Существует несколько различных серотипов, каждый из которых обладает своей тканевой специфичностью. Поэтому выбор серотипа зависит от того, какая ткань должна стать мишенью. Клетки скелетных мышц и клетки печени инфицируются и трансдуцируются векторами на основе различных серотипов AAV, например AAV8, AAV9 и AAV-rh74.

Химерные, или гибридные серотипы AAV создавались путем обмена фрагментов нуклеотидных последовательностей, кодирующих белки капсида, между различными природными серотипами АAV с целью повысить эффективность трансдукции или усилить тропизм вируса к нужным тканям или типам клеток.

Гибридные капсиды AAV получали, комбинируя структурные домены капсидов AAV серотипа 8 и серотипов, выделенных из мозга приматов. Полученные гибридные серотипы AAV способны к трансдукции в ткани сетчатки у человека и мыши, причем эффективность трансдукции не больше, чем у векторов на основе AAV2 и AAV5 (Charbel Issa et al., PLOS ONE, 2013, 8, e60361). Однако один из этих гибридных серотипов AAV проявлял повышенную эффективность трансдукции в жировой ткани по сравнению с AAV1, AAV8 и AAV9 (Liu et al., Molecular Therapy, 2014, 1, 8, doi:10.1038/mtm).

В публикации WO 2015/191508 описываются рекомбинантные гибридные капсиды AAV, полученные путем обмена вариабельными областями капсидов AAV, выделенных из различных видов живых организмов (человек, приматы, птицы, змеи, крупный рогатый скот), в частности капсидов AAV с тропизмом к клеткам центральной нервной системы, для создания химерных капсидов, специфичных к ткани центральной нервной системы.

В публикации WO 2017/096164 описываются рекомбинантные капсиды AAV, являющиеся гибридами капсидов AAV серотипов 1, 2, 3b, 6 и 8, обладающих повышенным тропизмом к ткани скелетных мышц человека.

Однако все встречающиеся в природе серотипы аденоассоциированного вируса, проверенные на сегодняшний день, склонны накапливаться в печени. Это создает сложности, в частности при системном введении векторов на основе AAV в организм. Во-первых, переносимый ген, который должен экспрессироваться в мышечных клетках, может вызвать в печени вредные эффекты. Во-вторых, из-за того, что вектор на основе AAV, попадет в печень, в скелетных мышцах его окажется меньше, чем нужно. Соответственно, придется увеличить его дозировку. А это повышает гепатотоксичность и затраты на применение вектора.

Разница в генной экспрессии в различных тканях достигается с помощью тканеспецифичных промоторов и механизмов регуляции с участием малых некодирующих РНК (микроРНК). Но эти регуляторные механизмы не исключают возможности того, что после системного введения геном вектора на основе AAV будет проявлять себя в органах, не являющихся его предполагаемой мишенью, например будет экспрессироваться в печени.

Было показано, что при мутациях, затрагивающих остатки аргинина, являющегося оснóвной аминокислотой, в положениях 585 или 588 (R585, R588) капсидного белка, ослабляется связывание гепарина/гепаринсульфата и снижается тропизм векторов на основе AAV2 к печени (Asokan et al., Nat. Biotechnol., 2010, 28, 79-82). Однако этот подход пригоден только в случае серотипов AAV2 и AAV6, у которых тропизм к печени определяется связыванием оснóвных остатков капсидного белка с гепарином.

Таким образом, существует настоятельная потребность в новых векторах на основе аденоассоциированного вируса, у которых тропизм к печеночной ткани намного ниже, чем к мышечной. Нужны также новые векторы, способные эффективно инфицировать мышечные клетки, но не проникающие в клетки печени или мозга.

Раскрытие изобретения

Авторы данного изобретения создали новые гибридные серотипы аденоассоциированного вируса, комбинируя два серотипа, эффективно проникающие в клетки мышечной и печеночной ткани. а именно AAV9 и AAV-rh74. Два новых гибридных серотипа AAV были получены путем обмена вариабельных областей гена cap между серотипами AAV9 и AAVrh74 (см. фиг. 1A и 1B). Оказалось, что у гибридного серотипа аденоассоциированного вируса отсутствует тропизм к печеночной ткани, свойственный исходным серотипам AAV9 и AAVrh74 (см. фиг. 4C и 4D). В то же время для гибридного серотипа AAV наблюдался более высокий титр вектора и более высокая эффективность генной трансдукции в клетках скелетных и сердечной мышц.

Новые гибридные серотипы AAV ценны для генной терапии нервно-мышечных расстройств, включая заболевания, обусловленные генетически, аутоиммунные, нейродегенеративные и раковые заболевания.

Таким образом, данное изобретение охватывает рекомбинантные аденоассоциированные вирусы с капсидами, гибридными между AAV9 и AAVrh74, обладающие пониженным тропизмом к печеночной ткани; векторные частицы на основе AAV, содержащие гибридные капсиды рекомбинантного аденоассоциированного вируса; композиции, содержащие векторные частицы на основе AAV гибридного серотипа, а также способы получения и применения указанных векторных частиц на основе AAV гибридных серотипов и включающих их композиций, в частности применение в генной терапии.

Осуществление изобретения

Гибридный белок капсида рекомбинантного аденоассоциированного вируса

В одном из своих аспектов данное изобретение относится к белку капсида рекомбинантного аденоассоциированного вируса (AAV), являющегося гибридом между капсидными белками AAV серотипов 9 (AAV9) и 74 (AAVrh74), причем указанный гибридный белок капсида рекомбинантного AAV обладает пониженным тропизмом к печеночной ткани по сравнению с капсидными белками исходных серотипов AAV9 и AAVrh74.

В настоящем документе термин «тропизм» относится к специфичности заражения клеток определенного типа или определенных тканей вирусными частицами, содержащими капсидный белок AAV.

Тропизм капсида AAV к клеткам определенного типа или определенным тканям можно определить, измеряя стандартными аналитическими методами, известными в данной области техники (например, описанными в разделе «Примеры» настоящей заявки), способность векторных частиц на основе AAV, содержащих гибридный белок капсида AAV, инфицировать клетки определенного типа или определенные ткани или осуществлять в них трансдукцию.

В настоящем документе термин «тропизм к печеночной ткани»/«гепатотропизм» относится к тропизму в отношении печеночной ткани и клеток печени, включая гепатоциты.

По данному изобретению тропизм гибридного белка капсида AAV к печеночной ткани по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, 50% или более, предпочтительно по меньшей мере на 50%, 60% 70%, 80%, 90% или 99% ниже, чем тропизм к печеночной ткани капсидных белков исходных серотипов AAV9 или AAVrh74.

По данному изобретению гибридный белок капсида AAV обладает тропизмом к мышечным тканям и мышечным клеткам.

Мышечные ткани включают, в частности, ткань сердечной мышцы и ткань скелетных мышц.

В настоящем документе термин «мышечные клетки» относится к миоцитам, миотрубочкам, миобластам и/или сателлитным клеткам.

В некоторых воплощениях данного изобретения тропизм гибридного капсидного белка AAV к мышечной ткани сходен с таковым капсидных белков исходных серотипов AAV9 и/или AAVrh74. Предпочтительно тропизм гибридного капсидного белка AAV к мышечной ткани составляет по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% или более от тропизма к мышечной ткани капсидных белков исходных серотипов AAV9 и/или AAVrh74.

В некоторых воплощениях данного изобретения гибридный капсидный белок AAV является гибридом белка VP1, VP2 или VP3.

В некоторых воплощениях данного изобретения, гибридный капсидный белок AAV обладает тропизмом по меньшей мере к скелетно-мышечной ткани. В некоторых предпочтительных воплощениях данного изобретения гибридный капсидный белок AAV обладает тропизмом как к скелетно-мышечной ткани, так и к ткани сердечной мышцы. Примером такого гибридного белка является гибридный капсид AAV, имеющий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 3 (в разделе «Примеры» этот белок обозначен «Hybrid Cap9-rh7»). Капсид AAV этого типа можно использовать для лечения расстройств сердечной и скелетных мышц.

Гибридный капсидный белок AAV по данному изобретению может быть получен из любых последовательностей капсидных белков AAV9 и AAVrh74; эти последовательности хорошо известны в данной области техники; они доступны в открытых базах данных аминокислотных последовательностей. Например, капсидному белку AAV9 соответствуют последовательности, представленные в базе данных GenBank со следующими идентификаторами: AY530579.1; SEQ ID NO: 123 (по публикации WO 2005/033321); SEQ ID NO: 1 (по публикации WO 2012/112832); варианты капсида AAV9, в которых один или более из природных аминокислотных остатков в положениях 271 (D), 446 (Y) и 470 (N) заменены на остатки других аминокислот, как описано в публикации WO 2012/112832; варианты капсида AAV9 с аминокислотными заменами K143R, T251A, S499A, S669A и S490A, как описано в патенте США № 2014/0162319. Капсидному белку AAVrh74 соответствуют следующие последовательности: SEQ ID NO: 1 по публикации WO 2015/013313; SEQ ID NO: 6 по WO 2006/110689; SEQ ID NO: 1 по WO 2013/123503; SEQ ID NO: 4 по WO 2013/158879; варианты с заменами аминокислотных остатков K137R, K333R, K550R, K552R, K569R, K691R, K695R, K709R и сочетания указанных вариантов.

В некоторых воплощениях данного изобретения, гибридный белок капсида AAV по данному изобретению является производным от капсидного белка AAV9, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (GenBank AY530579.1) и капсидного белка AAVrh74 , имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

В некоторых воплощениях данного изобретения, гибридный белок капсида AAV по данному изобретению получается в результате замены вариабельной области в последовательности капсидного белка AAV9 или AAVrh74 на соответствующую вариабельную область последовательности капсидного белка аденоассоциированного вируса другого серотипа,

причем эта вариабельная область капсида AAV9 соответствует отрезку аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 капсида AAV9 (референсная последовательность) начиная с любого из положений с 331-го по 493-е и до любого из положений с 556-го по 736-е или фрагменту, состоящему из по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 расположенных подряд аминокислотных остатков из участка между 493-м и 556-м положениями последовательности SEQ ID NO: 1 капсида AAV9; и

вариабельная область капсида AAVrh74 соответствует отрезку аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 капсида AAVrh74 (референсная последовательность) начиная с любого из положений с 332-го по 495-е и до любого из положений с 558-го по 738-е или фрагменту, состоящему из по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 расположенных подряд аминокислотных остатков из участка между 495-м и 558-м положениями последовательности SEQ ID NO: 2 капсида AAVrh74.

В объем данного изобретения входят гибридные белки капсида AAV, являющиеся производными любой из аминокислотных последовательностей капсидных белков AAV9 и AAVrh74, полученными путем замены вариабельной области в капсидной последовательности AAV9 или AAVrh74 на соответствующую вариабельную область капсидной последовательности аденоассоциированного вируса другого серотипа, как описано выше. По данному изобретению вариабельную область определяют, используя в качестве референсных капсидные последовательности SEQ ID NO: 1 AAV9 и SEQ ID NO: 2 AAVrh74. После сравнения любой другой капсидной последовательности AAV9 с SEQ ID NO: 1 или любой другой капсидной последовательности AAVrh74 с SEQ ID NO: 2 стандартными методами выравнивания аминокислотных последовательностей белков с помощью хорошо известных в данной области техники компьютерных программ BLAST, FASTA, CLUSTALW и т.п. специалист в данной области техники без труда может установить соответственные положения последовательности вариабельной области в других капсидных последовательностях AAV9 или AAVrh74.

В некоторых предпочтительных воплощениях данного изобретения гибридный капсидный белок AAV по данному изобретению образуется в результате замены вариабельной области, соответствующей последовательности с 449-го по 609-е положение капсидной последовательности SEQ ID NO: 1 AAV9 или с 450-го по 611-е положение капсидной последовательности SEQ ID NO: 2 AAVrh74, на соответственную вариабельную область капсида вируса другого серотипа.

В некоторых воплощениях данного изобретения, указанный гибридный белок капсида AAV содержит аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4; последовательностей, степень идентичности которых с указанными последовательностями составляет по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99%, и их фрагмента, соответствующего капсидному белку VP2 или VP3. Белку VP2 соответствует часть последовательности SEQ ID NO: 3 или 4 от аминокислотного остатка T138 до ее конца. Белку VP3 соответствует часть последовательности SEQ ID NO: 3 от аминокислотного остатка M203 до ее конца или последовательности SEQ ID NO: 4 от аминокислотного остатка M204 до ее конца.

Последовательность SEQ ID NO: 3 получается из капсидного белка AAV9, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, путем замены вариабельной области AAV9 (положения с 449-го по 609-е последовательности SEQ ID NO: 1) на вариабельную область капсидного белка AAVrh74 (положения с 450-го по 611-е последовательности SEQ ID NO: 2); в разделе «Примеры» соответствующий гибрид называется Hybrid Cap9-rh74. Белку VP2 соответствует часть последовательности SEQ ID NO: 3 от аминокислотного остатка T138 до ее конца. Белку VP3 соответствует часть последовательности SEQ ID NO: 3 от аминокислотного остатка M203 до ее конца.

Последовательность SEQ ID NO: 4 получается из капсидного белка AAVrh74, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, путем замены вариабельной области AAVrh74 (положения с 450-го по 611-е последовательности SEQ ID NO: 2) на вариабельную область капсидного белка AAV9 (положения с 449-го по 609-е последовательности SEQ ID NO: 1); в разделе «Примеры» соответствующий гибрид называется Hybrid Caprh74-9. Белку VP2 соответствует часть последовательности SEQ ID NO: 4 от аминокислотного остатка T138 до ее конца. Белку VP3 соответствует часть последовательности SEQ ID NO: 4 от аминокислотного остатка M204 до ее конца.

В некоторых предпочтительных воплощениях данного изобретения гибридный капсидный белок AAV по данному изобретению получается из капсидного белка AAV9 в результате замены вариабельной области AAV9 на соответствующую вариабельную область капсидной последовательности AAVrh74, как описано выше; предпочтительно гибридный капсидный белок AAV содержит замену вариабельной области, соответствующей участку с 449-го по 609-е положение капсидной последовательности SEQ ID NO: 1 AAV9 на вариабельную область, соответствующую участку с 450-го по 611-е положение капсидной последовательности SEQ ID NO: 2 AAVrh74. Предпочтительно указанный гибридный капсидный белок содержит аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 3 и последовательностей, степень идентичности которых с указанной последовательностью составляет по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99%; более предпочтительно указанный гибридный белок AAV содержит последовательность SEQ ID NO: 3.

Термин «идентичность» в настоящем документе относится к сходству аминокислотных последовательностей двух полипептидов (или нуклеотидных последовательностей двух нуклеиновых кислот). Когда в двух сравниваемых последовательностях в данном положении находятся одинаковые аминокислотные остатки (нуклеотиды), говорят, что сравниваемые последовательности идентичны в данном положении. Степень идентичности двух последовательностей - это отношение числа положений, в которых эти последовательности идентичны, на число сравниваемых положений, выраженное в процентах. Обычно сравнение делают, выровняв последовательности, чтобы установить максимальную идентичность. Степень идентичности рассчитывается путем выравнивания с использованием, например, пакета программ GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7; Мадисон, шт. Висконсин) или любого другого алгоритма для сравнения последовательностей, например BLAST, FASTA или CLUSTALW.

В некоторых воплощениях данного изобретения гибридный капсидный белок AAV по данному изобретению дает большое количество векторных частиц рекомбинантного AAV. Предпочтительно титр вектора на основе гибридного капсида рекомбинантного AAV составляет или превышает 10¹¹ вирусных геномов на 1 мл (вг/мл). Высокая эффективность образования векторных частиц рекомбинантного AAV весьма ценна для применения в генной терапии.

В некоторых воплощениях данного изобретения, гибридный капсидный белок AAV по данному изобретению также включает дополнительные модификации, например, увеличивающие прицельность векторов на основе AAV к ткани скелетных мышц или к сердечной мышце. Примером (не имеющим ограничительного характера) таких модификаций является присоединение антоплеврина-В к N-концу капсидного белка VP2 AAV (Finet et al., Virology, 2018, 513, 43-51). Другой пример – вставка пептида в участок, экспонированный на поверхности капсида, в частности возле положения 588 по нумерации аминокислотных остатков в последовательности SEQ ID NO: 1. Примеры таких пептидов (не имеющие ограничительного характера) описаны в работе Michelfelder et al. PLoS ONE, 2009, 4, e5122. Вставка делается предпочтительно в участок между положениями 587 и 592 по нумерации аминокислотных остатков в последовательности SEQ ID NO: 1. При вставке пептида возможна (но не обязательна) делеция некоторых или всех аминокислотных остатков в указанном участке. Последовательность вставляемого пептида состоит предпочтительно не более чем из 20 аминокислотных остатков и может содержать определенные последовательности из не более чем пяти аминокислотных остатков, расположенные на ее N-и/или С-конце, например GQSG (SEQ ID NO: 35) и AQAA (SEQ ID NO: 36) на N- и C-конце пептида соответственно.

В некоторых воплощениях данного изобретения вставляемый пептид содержит или представляет собой (то есть состоит из) последовательность, выбираемую из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 12 - 34. Предпочтительно вставляемый пептид имеет на N-конце последовательность GQSG (SEQ ID NO: 35), а на С-конце – последовательность АQAA (SEQ ID NO: 36). Предпочтительно вставляемый пептид замещает собой все аминокислотные остатки начиная с 587-го положения и по 592-е положение по нумерации последовательности SEQ ID NO: 1 капсидного белка AAV. Предпочтительно вставляемый пептид повышает прицельность к ткани сердечной мышцы и в некоторых случаях к ткани скелетных мышц. В некоторых предпочтительных воплощениях данного изобретения гибридный капсидный белок AAV, модифицированный вставкой пептида, содержит или представляет собой (то есть состоит из) последовательность, выбираемую из группы, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 9 и последовательностей, степень идентичности которых с указанной последовательностью, составляет по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99%; более предпочтительно, что гибридный капсидный белок содержит последовательность SEQ ID NO:9. Последовательность SEQ ID NO: 9 получается из гибридного белка Cap9-rh74, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, в результате вставки пептида, имеющего последовательность SEQ ID NO: 12. В объем данного изобретения входят также химерные капсидные белки VP1 и VP2 AAV, получаемые из капсидного белка VP3, являющегося гибридом AAV9/rh74, по данному изобретению, в которых N-концевой участок, специфический для VP1, и/или N-концевой участок, специфический для VP2, принадлежат природным или искусственным серотипам ААV, отличным от AAV9 и AAVrh74.

В некоторых воплощениях данного изобретения, химерный капсидный белок VP1 AAV содержит:

(i) специфический для VP1 N-концевой участок, имеющий последовательность, взятую из природного или искусственного серотипа AAV, отличного от AAV9 и AAVrh74,

(ii) специфический для VP2 N-концевой участок, имеющий последовательность, взятую из AAV9, AAVrh74 либо из природных или искусственных серотипов AAV, отличных от AAV9 и AAVrh74, и

(iii) С-концевой участок VP3, имеющий последовательность гибридного белка VP3 по данному изобретению.

В некоторых воплощениях данного изобретения химерные капсидные белки VP2 AAV содержат

(i) специфический для VP2 N-концевой участок, имеющий последовательность, взятую из природного или искусственного серотипа AAV, отличного от AAV9 и AAVrh74, и

(ii) С-концевой участок VP3, имеющий последовательность гибридного белка VP3 по данному изобретению.

Полинуклеотид, вектор и их применение для получения вектора на основе AAV

Другой аспект данного изобретения – полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный гибридный белок капсида AAV в экспрессируемой форме. Указанный полинуклеотид может быть представлен РНК, ДНК или синтетической либо полусинтетической нуклеиновой кислотой.

В некоторых воплощениях данного изобретения, указанным полинуклеотидом является гибридный ген cap AAV9/rh74, кодирующий гибридные капсидные белки VP1, VP2 и VP3 по данному изобретению. В некоторых предпочтительных воплощениях данного изобретения указанный полинуклеотид содержит последовательность SEQ ID NO: 5 (кодирующую гибридный капсидный белок AAV, имеющий последовательность SEQ ID NO: 3) или последовательность SEQ ID NO: 7 (кодирующую гибридный капсидный белок AAV, имеющий последовательность SEQ ID NO: 4).

В некоторых воплощениях данного изобретения указанным полинуклеотидом является химерный ген cap, который кодирует гибридный капсидный белок VP3 AAV9/rh74 по данному изобретению и химерный капсидный белок VP1, а также, при необходимости, химерный капсидный белок VP2, причем специфический для VP1 N-концевой участок и, при необходимости, специфический для VP2 N-концевой участок взяты из природного или искусственного серотипа AAV, отличного от AAV9 и AAVrh74. Такой химерный ген cap можно получить с помощью любого пригодного для этой цели метода, используя нуклеотидную последовательность, кодирующую гибридный капсидный белок VP3 AAV9/rh74 по данному изобретению в сочетании с гетерологичными последовательностями, взятыми из отобранных серотипов AAV, отличных от указанных, или из несоседних участков геномов указанных серотипов, или из вирусов, отличных от AAV, или из невирусных источников.

В некоторых воплощениях данного изобретения, указанный полинуклеотид также кодирует репликазу аденоассоциированного вируса (Rep AAV) в экспрессирумой форме, предпочтительно Rep AAV2.

Полинуклеотид по данному изобретению предпочтительно встраивают в рекомбинантный вектор; рекомбинантные векторы включают (перечисленное здесь не имеет ограничительного характера) линейные или кольцевые ДНК либо РНК, состоящие из хромосомных или нехромосомных, синтетических или полусинтетических нуклеиновых кислот, например вирусные векторы, плазмиды или РНК-векторы.

Известно множество векторов, в которые можно встроить нужные нуклеотидные последовательности с целью ввести их в эукариотические клетки-хозяева и обеспечить сохранение там; выбор подходящего вектора определяется предполагаемым его применением (например, для репликации нужной нуклеотидной последовательности, или для ее экспрессии, или для сохранения как внехромосомного элемента, или для интеграции в хромосомную ДНК клетки-хозяина), а также природой клетки-хозяина.

В некоторых воплощениях данного изобретения вектором служит плазмида.

По данному изобретению используется экспрессионный рекомбинантный вектор, включающий элементы, необходимые для экспрессии гибридного капсидного белка AAV, а также, при необходимости, репликазы AAV. Обычно каждую кодирующую последовательность (для гибридного капсидного белка и для репликазы AAV) включают в состав отдельной экспрессионной кассеты либо в одном и том же векторе, либо в разных. Каждая экспрессионная кассета включает кодирующую последовательность с открытой рамкой считывания (ORF), функционально связанную с регуляторными последовательностями, которые обеспечивают экспрессию соответствующего белка в клетке, продуцирующей вирионы AAV, например определенный промотор, промотор/энхансер, инициирующий кодон (ATG), стоп-кодон и сигнал терминации транскрипции. Или же гибридный капсидный белок и репликаза AAV экспрессируются с одной экспрессионной кассеты с использованием участка внутренней посадки рибосомы (IRES), который встраивают между двумя кодирующими последовательностями, или вирусного 2А-пептида Кроме того, нуклеотидные последовательности, кодирующие гибридный капсидный белок и репликазу AAV, предпочтительно оптимизируют для экспрессии в конкретных клетках, продуцирующих AAV, в частности в человеческих клетках.

Вектор по данному изобретению, предпочтительно плазмиду, можно использовать для получения гибридного вектора на основе AAV, содержащего гибридный капсидный белок AAV, применяя стандартные методы получения AAV, известные в данной области техники (Review in Aponte-Ubillus et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 2018, 102: 1045-1054).

После котрансфекции клетки инкубируют в течение времени, достаточного для того, чтобы произошло образование векторных частиц на основе AAV; затем клетки собирают, подвергают лизису и векторные частицы очищают стандартными методами очистки, например путем центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия.

Частицы на основе AAV, фармацевтическая композиция и терапевтическое применение

В другом своем аспекте данное изобретение относится к частицам на основе AAV, содержащим гибридный рекомбинантный капсидный белок AAV по данному изобретению. Эти частицы могут содержать гибридные капсидные белки VP1, VP2 и VP3, кодируемые гибридным геном cap по данному изобретению. Или же либо в дополнение эти частицы содержат химерные капсидные белки VP1 и VP2 и гибридный белок VP3, кодируемые химерным геном cap по данному изобретению.

В некоторых воплощениях данного изобретения, частицы на основе AAV являются как бы мозаичными в том смысле, что содержат также другой капсидный белок AAV природного или искусственного серотипа, отличного от AAV9 и AAVrh74, причем эти мозаичные частицы на основе AAV обладают пониженным тропизмом к печеночной ткани по сравнению с таковым AAV9 и AAVrh74. Искусственный серотип AAV может быть представлен (перечисленное здесь не имеет ограничительного характера) химерным капсидом AAV, рекомбинантным капсидом AAV или гуманизированным капсидом AAV. Такой искусственный капсид можно получить любым подходящим для этой цели методом, используя выбранную последовательность AAV (например, фрагмент последовательности капсидного белка VP1) в сочетании с гетерологичными последовательностями, взятыми от AAV различных выбранных серотипов, с участками генома (не соседними с данной последовательностью) того же серотипа AAV, из невирусного источника последовательностей AAV или из невирусного источника.

Предпочтительно частицы на основе AAV по данному изобретению являются векторными частицами. Геном вектора на основе AAV представляет собой одноцепочечную нуклеиновую кислоту или двухцепочечную самокомплементарную (McCarty et al, Gene Therapy, 2003, Dec., 10(26), 2112-2118).

Самокомплементарные векторы получают путем делеции концевого сайта прикрепления (TRS) в одном из концевых повторов AAV. Модифицированным таким образом векторам, у которых реплицирующийся геном вдвое короче генома AAV дикого типа, свойственно образовывать димеры ДНК. Геном AAV фланкирован инвертированными концевыми повторами (ITR). В некоторых воплощениях данного изобретения вектор на основе AAV является псевдотипированным, то есть его геном и капсид происходят из AAV разных серотипов. В некоторых предпочтительных воплощениях данного изобретения геном псевдотипированного вектора происходит из AAV2.

В некоторых предпочтительных воплощениях данного изобретения векторные частицы на основе AAV несут нужный ген.

Частицы на основе AAV по данному изобретению могут быть получены с помощью методов создания рекомбинантных векторных частиц на основе AAV по данному изобретению.

Словосочетание «желаемый/нужный ген» означает ген, ценный для определенного применения, например диагностики, внедрения репортерных генов, модифицирования, лечения и редактирования генома (перечисленное здесь не имеет ограничительного характера).

Например, желаемым/нужным геном может быть ген терапевтического назначения, репортерный ген или ген фермента, служащего для редактирования генома.

Словосочетания «нужный ген терапевтического назначения», «ген, нужный для лечения» или «нужный гетерологичный ген» означают ген, способный дать терапевтический эффект, либо ген, кодирующий белок, пептид или РНК, обладающие терапевтическим эффектом.

Нужный ген – это какая-либо нуклеотидная последовательность, способная повлиять на ген-мишень или на подлежащий воздействию клеточный механизм, в частности в мышечных клетках. Например, этот ген изменяет экспрессию, последовательность или регуляцию гена-мишени или подлежащего воздействию клеточного механизма. В некоторых воплощениях данного изобретения нужный ген – это функциональный вариант какого-либо гена или его фрагмента. Функциональными вариантами указанного гена могут быть ген дикого типа, вариант гена (например, вариант из того же семейства генов или иные варианты), укороченный ген, кодируемый которым белок сохраняет прежнюю функциональность по меньшей мере частично. Функциональный вариант гена может быть полезен в генной терапии для замены или дополнения того гена, который у больного не функционален или дефектен. В других воплощениях данного изобретения нужный ген – это ген, инактивирующий доминантный аллель, обусловливающий аутосомное доминантное генетическое заболевание. Фрагмент гена может быть полезен в качестве матрицы для рекомбинации при использовании в сочетании с ферментом, служащим для редактирования генома.

Или же нужный ген – это ген, кодирующий белок для определенного применения (например, антитело, антительный фрагмент или фермент, служащий для редактирования генома) или РНК. В некоторых воплощениях данного изобретения белок, кодируемый нужным геном, - это белок, дающий терапевтический эффект, включая антитела терапевтического действия или ферменты, служащие для редактирования генома. В некоторых воплощениях данного изобретения кодируемая нужным геном РНК имеет терапевтическое значение. Нужный ген – это функциональный ген, способный обеспечить образование кодируемого им белка, пептида или РНК в клетках-мишенях при данном заболевании, в частности в мышечных клетках. Вектор на основе AAV по данному изобретению содержит нужный ген в форме, экспрессирующейся в мышечных клетках, включая клетки сердечной и скелетных мышц. В частности, нужный ген функционально связан с универсальными, тканеспецифичными или индуцируемыми промоторами, способными действовать в мышечных клетках. Нужный ген может быть встроен в экспрессионную кассету, содержащую также последовательности polyA.

Кодируемая нужным геном РНК предпочтительно комплементарна последовательности ДНК- или РНК-мишени либо связывается с белком-мишенью. Например, РНК, кодируемая нужным геном, - это интерферирующая РНК, например короткая РНК, образующая шпильки (shRNA); микроРНК; малая РНК, играющая роль матрицы при редактировании генома (gRNA) и используемая в сочетании с ферментом Cas или сходным белком, служащим для редактирования генома; антисмысловая РНК, способная к пропуску поврежденных экзонов, например модифицированная малая ядерная РНК (snRNA) или длинная не кодирующая РНК. Интерферирующие РНК или микроРНК могут использоваться для регуляции экспрессии гена-мишени, участвующего в заболевании мышц. РНК-матрица для редактирования генома в сочетании с ферментом Cas или сходным белком, служащим для редактирования генома, может использоваться для модифицирования последовательности гена-мишени, в частности для коррекции последовательности мутантного или дефектного гена или для влияния на экспрессию гена-мишени, участвующего в заболевании, в частности нервно-мышечного заболевания. Антисмысловая РНК, способная к пропуску поврежденных экзонов, может использоваться, в частности, для коррекции рамки считывания и восстановления экспрессии дефектного гена с нарушенной рамкой считывания. В некоторых воплощениях данного изобретения нужная РНК – это РНК, имеющая терапевтическое значение.

Ферменты, служащие для редактирования генома, по данному изобретению – это любые ферменты или ферментные комплексы, способные изменять ген-мишень или влиять на подлежащий воздействию клеточный механизм, в частности в мышечных клетках. Например, фермент, служащий для редактирования генома, может влиять на экспрессию, изменять последовательность или регуляцию гена-мишени или клеточного механизма. Предпочтительно фермент, служащий для редактирования генома, является сконструированной нуклеазой, например мегануклеазой, нуклеазой с «цинковыми пальцами» (ZEN), эффекторной нуклеазой, подобной активаторам транскрипции (TALEN), ферментом, кодируемым геном cas, из системы CRISPR/Cas (CRISP - короткие палиндромные повторы, расположенные группами, равномерно удаленными друг от друга) или другим подобным ферментом (перечисленное здесь не имеет ограничительного характера). Фермент, служащий для редактирования генома, в частности сконструированная нуклеаза, например белок, кодируемый геном cаs, или подобный фермент, может быть функциональной нуклеазой, создающей разрывы в двух цепях ДНК (DSB) локуса-мишени; такие ферменты используются в применениях сайт-специфического редактирования генома, включая коррекцию генов, замену генов, нокаут генов, нокин генов, мутагенез, хромосомные транслокации, хромосомные делеции и т.п. (перечисленное здесь не имеет ограничительного характера). В применениях сайт-специфического редактирования генома фермент, служащий для редактирования генома, в частности сконструированная нуклеаза, например фермент, кодируемый геном cas, и ему подобные белки, можно использовать в сочетании с матрицей для гомологичной рекомбинации (HR-матрицей, называемой также донорной ДНК-матрицей), в результате чего происходит изменение локуса-мишени путем гомологичной рекомбинации, вызванной двойным разрывом ДНК в данном локусе. В частности, с помощью HR-матрицы возможно внедрять нужный ген (трансген) в локус-мишень генома или осуществлять репарацию по месту мутации в локусе-мишени, предпочтительно в аномальном или дефектном гене, обусловливающем нервно-мышечное заболевание. Или же фермент, служащий для редактирования генома, например фермент, кодируемый геном cas, и подобные ему белки, конструируют таким образом, что он теряет нуклеазную активность и используется как белок, связывающийся с ДНК, для различных применений конструирования генома, например активации транскрипции, подавления транскрипции, эпигеномных модификаций, визуализации геномных данных, соосаждения РНК или ДНК и проч.

В другом своем аспекте данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество частиц AAV, включающих гибридный рекомбинантный белок капсида AAV по данному изобретению, предпочтительно векторные частицы на основе AAV, несущие нужный ген терапевтического действия.

В некоторых воплощениях данного изобретения предлагаемая фармацевтическая композиция предназначена для применения в качестве медикамента, в частности в генной терапии. В объем данного изобретения входит применение предлагаемой фармацевтической композиции в качестве медикаментозного средства, в частности для лечения заболеваний путем генной терапии.

Генная терапия осуществляется путем переноса генов, редактирования генов, пропуска поврежденных экзонов, РНК-интерференции, транс-сплайсинга или каких-либо других генетических изменений кодирующих или регуляторных нуклеотидных последовательностей в клетке, включая нуклеотидные последовательности, находящиеся в ядре, митохондриях или принадлежащие комменсалам, например вирусные нуклеотидные последовательности, содержащиеся в клетке.

Основными типами генной терапии являются следующие:

- терапия, целью которой является обеспечение замены аномального или дефектного гена на функциональный ген; такая терапия называется заместительной или дополняющей;

- терапия, целью которой является редактирование гена или генома; в этом случае задача состоит в обеспечении клетки необходимыми средствами коррекции последовательностей или изменения экспрессии либо регуляции аномального или дефектного гена таким образом. чтобы экспрессировался функциональный ген или подавлялся (инактивировался) аномальный ген; в этих случаях говорят о геноредактирующей терапии.

При дополняющей генотерапии нужный ген – это функциональный вариант гена, который у больного мутантный или дефектный, как, например, при некоторых заболеваниях, обусловленных генетически. В таких случаях нужный ген обеспечивает экспрессию с образованием функционального продукта данного гена.

При редактирующей генотерапии для редактирования гена или генома используется один или более нужных генов, например:

(i) ген, кодирующий РНК, которая может обладать терапевтическим эффектом (см. выше), например, интерферирующие РНК – такие, как малые РНК, образующие шпильки (shRNA), малые РНК, играющие роль матрицы при редактировании генома (gRNA) и используемые в сочетании с ферментом Cas или сходным белком, антисмысловые РНК, способные к пропуску поврежденных экзонов RNA, как, например, модифицированные малые ядерные РНК (snRNA); и

(ii) ген, кодирующий фермент, служащий для редактирования генома (см. выше), например сконструированная нуклеаза, например мегануклеаза, нуклеаза с «цинковыми пальцами» (ZEN), эффекторная нуклеаза, подобная активатору транскрипции (TALEN), фермент, кодируемый геном cas, или другой подобный фермент, или комбинация таких генов; а также фрагмент функционального варианта гена для использования в качестве матрицы при рекомбинации, как описано выше.

Генная терапия применяется для лечения различных заболеваний, включая генетически обусловленные болезни, в частности нервно-мышечные генетические расстройства, раковые, нейродегенеративные и аутоиммунные заболевания (перечисленное здесь не имеет ограничительного характера).

В некоторых воплощениях данного изобретения генная терапия применяется для лечения заболеваний, затрагивающих мышечные ткани, в частности ткань скелетных мышц и/или сердечной мышцы, например нервно-мышечные генетические расстройства, кардиомиопатии, рабдомиосаркомы, полимиозит, дерматомиозит, ювенильный полимиозит и др. (перечисленное здесь не имеет ограничительного характера).

Примеры мутантных генов, играющих роль в нервно-мышечных генетических расстройствах, которые можно лечить путем генотерапии, используя фармацевтическую композицию по данному изобретению, перечислены в приведенных ниже таблицах.

Мышечные дистрофии

Ген Белок DMD Дистрофин EMD Эмерин FHL1 Белок FHL1 (белок «четыре с половиной» 1, содержит четыре домена LIM и один цинковый палец) LMNA Ламин A/C SYNE1 Несприн 1 (белок ядерной оболочки, содержащий спектриновые повторы, 1) SYNE2 Несприн 2 (белок ядерной оболочки, содержащий спектриновые повторы, 2) TMEM43 Трансмембранный белок 43 TOR1AIP1 Белок, взаимодействующий с торсином А, 1 DUX4 Активатор транскрипции парного гомеодоменного фактора транскрипции 1 SMCHD1 Белок структурной поддержки хромосом, содержащий шарнирный домен, 1 PTRF Фактор высвобождения полимеразы I и транскрипта MYOT Миотилин CAV3 Кавеолин 3 DNAJB6 Гомолог белка теплового шока 40, подсемейство B, представитель 6 DES Десмин TNPO3 Tранспортин 3 HNRNPDL Белок, подобный D-белку семейства гетерогенных ядерных рибонуклеопротеинов CAPN3 Калпаин 3 DYSF Дисферлин SGCG γ -саркогликан SGCA α-саркогликан SGCB β -саркогликан SGCD δ -саркогликан TCAP Телефонин TRIM32 Белок, содержащий трехчастный мотив (TRIM), 32 FKRP Белок, связанный с фукутином TTN Титин POMT1 Протеин-O-маннозилтрансфераза 1 ANO5 Аноктамин 5 FKTN Фукутин POMT2 Протеин-O-маннозилтрансфераза 2 POMGNT1 β-1,2-N-ацетилглюкозаминилтрансфераза 1 протеин-О-связанной маннозы PLEC Плектин TRAPPC11 Белковый комплекс транспорта частиц 11 GMPPB ГДФ-маннозопирофосфорилаза В DAG1 Дистрогликан 1 DPM3 Долихилфосфат-маннозилтрансферазы полипептид 3 ISPD Белок, содержащий домен изопреноид-синтазы VCP Валозин-содержащий белок LIMS2 Домен LIM и антигеноподобный домен стареющих клеток 2 GAA Кислая α-глюкозидаза

Врожденные мышечные дистрофии

Ген Белок LAMA2 Ламининовая α₂-цепь в мерозине COL6A1 α1-цепь коллагена типа VI COL6A2 α2-цепь коллагена типа VI COL6A3 α3-цепь коллагена типа VI SEPN1 Селенопротеин N1 FHL1 Белок FHL1 (белок «четыре с половиной» 1, содержит четыре домена LIM и один цинковый палец) ITGA7 Предшественник интегрина α7 DNM2 Динамин 2 TCAP Teлефонин LMNA Ламин A/C FKTN Фукутин POMT1 Протеин-O-маннозилтрансфераза 1 POMT2 Протеин-O-маннозилтрансфераза 2 FKRP Белок, связанный с фукутином POMGNT1 β-1,2-N-ацетилглюкозаминилтрансфераза 1 протеин-О-связанной маннозы ISPD Белок, содержащий домен изопреноид-синтазы POMGNT2 β-1,2-N-ацетилглюкозаминилтрансфераза 2 протеин-О-связанной маннозы B3GNT1 УДФ-N-ацетилглюкозамин:β-галактозидаза β-1,3-N-ацетилглюкозаминил-трансфераза 1 GMPPB ГДФ-манноза фосфорилаза B (маннозо-1-фосфатгуанилилтрансфераза (ГДФ)) LARGE Белок, подобный гликозилтрансферазам DPM1 Полипептид 1 долихилфосфат-маннозилтрансферазы (каталитическая субъединица) DPM2 Полипептид 2 долихилфосфат-маннозилтрансферазы (регуляторная субъединица) ALG13 УДФ-N- ацетилглюкозаминилтрансфераза B3GALNT2 β -1,3-N-ацетилгалактозаминилтрансфераза 2 TMEM5 Трансмембранный белок 5 POMK Протеин-О-манноза-киназа CHKB Холинкиназа β ACTA1 α-Актин скелетных мышц TRAPPC11 Белковый комплекс транспорта частиц 11

Врожденные миопатии

Ген Белок TPM3 Тропомиозин 3 NEB Небулин ACTA1 α-Актин скелетных мышц TPM2 Тропомиозин 2 (β) TNNT1 Медленный тропонин T KBTBD13 Белок, содержащий повтор Kelch и домен BTB (POZ), 13 CFL2 Кофилин 2 (мышечный) KLHL40 Белок – член семейства чашеобразных (Kelch) белков 40 KLHL41 Белок – член семейства чашеобразных (Kelch) белков 41 LMOD3 Лейомодин 3 (фетальный) SEPN1 Селенопротеин N1 RYR1 Рецептор рианодина 1 (скелетные мышцы) MYH7 Тяжелая цепь сердечного β-миозина 7 MTM1 Миотубуларин DNM2 Динамин 2 BIN1 Aмфифизин TTN Tитин SPEG Белок - продукт комплексного локуса SPEG MEGF10 Трансмембранный белок с EGF-подобными доменами 10 MYH2 Тяжелая цепь миозина 2 скелетных мышц MYBPC3 Белок C, связывающий сердечный миозин CNTN1 Контактин-1 TRIM32 Белок, содержащий трехчастный мотив, 32 PTPLA Белок – член А семейства тирозинфосфатаз (3R-гидроксиацил-коэнзим А-дегидратаза) CACNA1S α1S-Субъединица потенциал-зависимого кальциевого канала типа L

Дистальные миопатии

Ген Белок DYSF Дисферлин TTN Титин GNE УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимераза/N-ацетилманнозаминкиназа MYH7 Тяжелая цепь сердечного β-миозина 7 MATR3 Матрин 3 TIA1 РНК-связывающий белок, ассоциированный с цитоплазматическими гранулами цитолитических клеток MYOT Миотилин NEB Небулин CAV3 Кавеолин 3 LDB3 Белок, связывающий домен LIM, 3 ANO5 Аноктамин 5 DNM2 Динамин 2 KLHL9 Белок, гомологичный чашеобразным белкам Kelch, 9 FLNC Филамин C, γ (актин-связывающий белок 280) VCP Валозин-содержащий белок

Другие миопатии

Ген Белок ISCU Гомолог белка-носителя аппарата самосборки железо-серных кластеров у Escherichia coli MSTN Миостатин FHL1 Белок FHL1 (белок «четыре с половиной» 1, содержит четыре домена LIM и один цинковый палец) BAG3 Атаноген, ассоциированный с BCL2, 3 ACVR1 Киназа II рецептора активина A типа 2 MYOT Миотилин FLNC Филамин C, γ (актин-связывающий белок 280) LDB3 Белок, связывающий домен LIM, 3 LAMP2 Предшественник мембранного белка, ассоциированного с лизосомами, 2 VCP Валозин-содержащий белок CAV3 Кавеолин 3 SEPN1 Селенопротеин N1 CRYAB α-Кристаллин B DES Десмин VMA21 Вакуолярный гомолог H⁺-АТФазы (Saccharomyces cerevisiae) PLEC Плектин PABPN1 Ядерный белок, связывающий рoly(A), 1 TTN Титин RYR1 Рианодиновый рецептор 1 (скелетные мышцы) CLN3 Белок, связанный с восковидным липофусцинозом нейронов (болезнью Баттена), 3 (баттенин) TRIM54 Белок, содержащий трехчастный мотив, 54 TRIM63 Белок, содержащий трехчастный мотив 63 (убиквитин-лигаза E3)

Миотонические синдромы

Ген Белок DMPK Протеинкиназа, ассоциированная с миотонической дистрофией CNPB Клеточный нуклеотид-связывающий белок CLCN1 Канал для ионов хлора 1 (скелетные мышцы), ассоциированный с болезнью Томсена аутосомно-доминантного типа CAV3 Кавеолин 3 HSPG2 Перлекан ATP2A1 АТФаза, переносящая ионы Ca²⁺ в быстро сокращающихся мышцах, 1

Мышечные заболевания, связанные с ионными каналами

Ген Белок CLCN1 Канал для ионов хлора 1 (скелетные мышцы), ассоциированный с болезнью Томсена аутосомно-доминантного типа SCN4A α–Субъединица потенциал-зависимого натриевого канала типа IV SCN5A α–Субъединица потенциал-зависимого натриевого канала типа V CACNA1S α1S-Субъединица потенциал-зависимого кальциевого канала типа L CACNA1A α1А-Субъединица потенциал-зависимого кальциевого канала типа P/Q KCNE3 Белок потенциал-зависимых калиевых каналов, член 3 семейства типа Isk KCNA1 Белок потенциал-зависимых калиевых каналов, член 1 подсемейства, родственного каналу «shaker» KCNJ18 Калиевый канал внутреннего выпрямления 2.6 (Kir2.6) KCNJ2 Калиевый канал внутреннего выпрямления J2 KCNH2 Белок потенциал-зависимых калиевых каналов член 2 подсемейства H KCNQ1 Белок потенциал-зависимых калиевых каналов член 1 подсемейства KQT KCNE2 Белок потенциал-зависимых калиевых каналов, член 2 семейства типа Isk KCNE1 Белок потенциал-зависимых калиевых каналов, член 1 семейства типа Isk

Злокачественная гипертермия

Ген Белок RYR1 Рианодиновый рецептор 1 (скелетные мышцы) CACNA1S α1S-Субъединица потенциал-зависимого кальциевого канала типа L

Метаболические миопатии

Ген Белок GAA Кислая α-1,4-глюкозидаза (препробелок) AGL Гликоген-деветвящий белок (амилo-1,6-глюкозидаза + 4-α-глюканотрансфераза) GBE1 Гликоген (1,4-α-глюкан-)-разветвляющий фермент 1, ассоциированный с болезнью Андерсена ( гликогенозом типа IV) PYGM Гликогенфосфорилаза PFKM Фосфофруктокиназа (мышечная) PHKA1 α-Субъединица киназы фосфорилазы B PGM1 Фосфоглюкомутаза 1 GYG1 Гликогенин 1 GYS1 Гликоген-синтаза 3, гликоген-синтаза 1 (мышечная) PRKAG2 Некаталитическая γ2-субъединица протеинкиназы, активируемой АМФ RBCK1 Белок, содержащий цинковые пальцы типа RanBP и C3HC4, 1 (убиквитин-лигаза 1 гем-окисленного железо-регуляторного белка 2(IRP2)) PGK1 Фосфоглицераткиназа 1 PGAM2 Фосфоглицератмутаза 2 (мышечная) LDHA Лактатдегидрогеназа A ENO3 Тканеспецифическая β–енолаза 3 (мышечная) CPT2 Карнитин-пальмитоилтрансфераза II SLC22A5 Белок-переносчик карнитина (член 5 семейства белков-переносчиков органических катионов SLC22) SLC25A20 Карнитин-ацилкарнитин -транслоказа ETFA α-Субъединица электронпереносящего флавопротеина ETFB β-Субъединица электронпереносящего флавопротеина ETFDH Дегидрогеназа электронпереносящего флавопротеина (ETF-дегидрогеназа) ACADVL Ацил-кофермент А-дегидрогеназа (очень длинноцепочечных жирнокислотных субстратов) ABHD5 Белок, содержащий домен α/β-гидролаз, 5 PNPLA2 Триглицеридлипаза адипоцитов (деснутрин) LPIN1 Липин 1 (фосфатидатфосфатаза 1) PNPLA8 Белок, содержащий фосфолипазный пататин-подобный домен, 8

Наследственные кардиомиопатии

Ген Белок MYH6 Тяжелая цепь миозина 6 MYH7 Тяжелая β-цепь миозина 7 (сердечная мышца) TNNT2 Тропонин T2 (сердечный) TPM1 α-Тропомиозин 1 MYBPC3 Белок С, связывающий сердечный миозин PRKAG2 Некаталитическая γ2-субъединица протеинкиназы, активируемой АМФ TNNI3 Тропонин I (сердечный) MYL3 Легкая цепь миозина 3 TTN Титин MYL2 Легкая цепь миозина 2 ACTC1 Предшественник α-актина (сердечная мышца) CSRP3 Белок, богатый цистеином и глицином, 3 (сердечный белок семейства LIM) TNNC1 Медленный тропонин C VCL Винкулин MYLK2 Киназа легких цепей миозина 2 CAV3 Кавеолин 3 MYOZ2 Mиозенин 2, или кальсарцин 1 (белок Z-дисков) JPH2 Джанктофилин-2 PLN Фосфоламбан NEXN Нексилин (белок, связывающий F-актин) ANKRD1 Белок, содержащий домен с анкириновыми повторами, 1 (сердечная мышца) ACTN2 α-Актинин 2 NDUFAF1 Субкомплекс 1α НАДН-убихинон--оксидоредуктазы TSFM Митохондриальный фактор элонгации трансляции гена Ts AARS2 Митохондриальная аланил-тРНК-синтетаза 2 MRPL3 Белок митохондриальных рибосом L3 COX15 Белок, гомологичный белку сборки комплекса цитохром с-оксидазы дрожжей MTO1 Митохондриальный фактор оптимизации трансляции, связывающий тРНК, 1 (дрожжей) MRPL44 Белок митохондриальных рибосом L44 LMNA Ламин A/C LDB3 Белок, связывающий домен LIM, 3 SCN5A α–Субъединица потенциал-зависимого натриевого канала типа V DES Десмин EYA4 Фактор транскрипции, член 4 семейства белков EYA («eyes absent») 4 SGCD δ -Саркогликан TCAP Телефонин ABCC9 АТФ-связывающи кассетный транспортер, член 9 подсемейства С семейства кассетных транспортеров TMPO Белок внутренней ядерной мембраны 2 PSEN2 Пресенелин 2 CRYAB αВ-Кристаллин FKTN Фукутин TAZ Тафацин DMD Дистрофин LAMA4 α-Ламинин 4 ILK Интегрин-связанная киназа MYPN Миопалладин RBM20 РНК-связывающий мотив 20 SYNE1 Несприн 1 (белок ядерной оболочки, содержащий спектриновые повторы, 1) MURC Мышечный двуспиральный белок DOLK Долихолкиназа GATAD1 Белок - член семейства факторов транскрипции GATA, содержащий домен «цинковый палец», 1 SDHA А-субъединица сукцинат-дегидрогеназного комплекса (флавопротеин) GAA Кислая α –глюкозидаза (препробелок) DTNA α -Дистробревин FLNA α -Филамин А (актин-связывающий белок 280) TGFB3 Трансформирующий фактор роста β3 RYR2 Рианодиновый рецептор 2 TMEM43 Трансмембранный белок 43 DSP Десмоплакин PKP2 Плакофилин 2 DSG2 Десмоглеин 2 DSC2 Десмоколлин 2 JUP Плакоглобин (γ –катенин) CASQ2 Калсеквестрин 2 (сердечная мышца) KCNQ1 Белок потенциал-зависимых калиевых каналов, член 1 подсемейства типа KQT KCNH2 Белок потенциал-зависимых калиевых каналов, член 2 подсемейства типа KQT ANK2 Aнкирин 2 KCNE1 Белок потенциал-зависимых калиевых каналов, член 1 семейства типа Isk KCNE2 Белок потенциал-зависимых калиевых каналов, член 2 семейства типа Isk KCNJ2 Калиевый канал внутреннего выпрямления J2 CACNA1C Субъединица α 1С потенциал-зависимого кальциевого канала типа L SCN4B β –Субъединица потенциал-зависимого натриевого канала типа IV AKAP9 Якорный белок A-киназы 9 (PRKA) (YOTIAO) SNTA1 α1-Синтрофин KCNJ5 Калиевый канал внутреннего выпрямления, член 5 подсемейства J NPPA Предшественник натрийуретического пептида A KCNA5 Белок потенциал-зависимых калиевых каналов, член 5 подсемейства, родственного каналу «shaker» GJA5 Коннексин 40 SCN1B β-Субъединица потенциал-зависимого натриевого канала типа I SCN2B β-Субъединица потенциал-зависимого натриевого канала типа II NUP155 Нуклеопорин 155 кДа GPD1L Пептиды глицерол-3-фосфатдегидрогеназы 1 CACNB2 β2-субъединица потенциал-зависимого кальциевого канала KCNE3 Белок потенциал-зависимых калиевых каналов, член 3 семейства типа Isk SCN3B β-Субъединица потенциал-зависимого натриевого канала типа III HCN4 Зависимый от циклических нуклеотидов натриевый канал, активирующийся при гиперполяризации, 4

Врожденные миастенические синдромы

Ген Белок CHRNA1 α-Субъединица 1 никотинового рецептора ацетилхолина CHRNB1 β-Субъединица 1 никотинового рецептора ацетилхолина (мышцы) CHRND δ-Субъединица никотинового рецептора ацетилхолина CHRNE ε-Субъединица никотинового рецептора ацетилхолина RAPSN Рапсин CHAT Изоформа холин-ацетилтрансферазы COLQ Коллагеноподобный якорный полипептид ацетилхолинэстеразы MUSK Тирозинкиназный рецептор скелетных мышц DOK7 Стыковочный белок 7 AGRN Агрин GFPT1 Глутамин-фруктозо-6-фосфат трансаминаза 1 DPAGT1 Долихилфосфат (УДФ-N-ацетилглюкозамин) N-ацетилглюкозаминфосфаттрансфераза 1 LAMB2 β2 –Цепь ламинина (ламинин S) SCN4A α–Субъединица потенциал-зависимого натриевого канала типа IV CHRNG γ -Субъединица никотинового рецептора ацетилхолина PLEC Плектин ALG2 α -1,3/1,6-маннозилтрансфераза ALG14 УДФ-N-ацетилглюкозаминтрансфераза SYT2 Синаптотагмин II PREPL Белок, подобный пролилэндопептидазе

Заболевания двигательных нейронов

Ген Белок SMN1 Фактор выживаемости двигательных нейронов 1 (кодируемый теломерным вариантом гена) IGHMBP2 Хеликаза, связывающая иммуноглобулиновую μ-цепь, 2 PLEKHG5 Белок, содержащий домен, гомологичный плекстрину, член 5 семейства G (с доменом RhoGef ) HSPB8 Белок теплового шока β8 (27 кДа) HSPB1 Белок теплового шока β1 (27 кДа) HSPB3 Белок теплового шока β3 (27 кДа) AARS Аланил-тРНК-синтетаза GARS Глицил-тРНК-синтетаза BSCL2 Сейпин REEP1 Белок – усилитель экспрессии 1 (вспомогательный рецепторный белок 1) SLC5A7 Белок-переносчик карнитина (член 7 семейства белков-переносчиков органических катионов SLC5) DCTN1 Динактин 1 UBA1 Убиквитин-активирующий фермент 1 ATP7A α-Полипептид АТФазы, переносящей Cu³⁺ DNAJB2 Белок, гомологичный белку теплового шока DnaJ (Hsp40), член 2 подсемейства B TRPV4 Термочувствительный ионный канал из семейства TRP (быстрый рецепторный потенциал), член 4 подсемейства DYNC1H1 Тяжелая цепь 1 цитоплазматического динеина 1 BICD2 Гомолог 2 белка, кодируемого геном с мутацией bicaudal, D Drosophila FBXO38 Белок, содержащий домен F-бокс, 38 ASAH1 N-Ацилсфингозин-амидогидролаза (кислая церамидаза) 1 VAPB Мембранный белок, ассоциированный с везикулами B и C EXOSC8 Компонент экзосомы 8 SOD1 Растворимая супероксиддисмутаза 1 ALS2 Алсин SETX Сенатаксин FUS Гибридный белок, образующийся в результате транслокации t(12;16), при злокачественной липосаркоме ANG Ангиогенин TARDBP Белок, связывающий ДНК, содержащую элемент TAR (trans-activation response) FIG4 Инозитфосфатаза, содержащая домен Sac, 3 OPTN Оптиневрин ATXN2 Атаксин 2 VCP Валозин-содержащий белок UBQLN2 Убиквилин 2 SIGMAR1 Неопиоидный внутриклеточный рецептор ς 1 CHMP2B Заряженный белок мультивезикулярного тельца 2B PFN1 Профилин 1 MATR3 Матрин 3 NEFH Тяжелый белок нейрофиламентов PRPH Перинефрин C9orf72 Белок, кодируемый открытой рамкой считывания 72 хромосомы 9 CHCHD10 Белок, содержащий домен СНСН (двойная спираль-спираль-двойная спираль) 10 SQSTM1 Секвестосома 1 AR Рецептор андрогенов GLE1 Гомолог дрожжевого белка ядерной поры, опосредующего выход РНК, 1 ERBB3 Гомолог онкогена v-erbB вируса эритробластомы птиц 3 PIP5K1C Фосфатидилинозит-4-фосфат-5-киназа типа γ I EXOSC3 Компонент экзосомы 3 VRK1 Протеинкиназа, ассоциированная с вакцинией, 1 SLC52A3 Белок-переносчик рибофлавина (член 3 семейства белков-переносчиков органических катионов SLC52) SLC52A2 Белок-переносчик рибофлавина (член 2 семейства белков-переносчиков органических катионов SLC52) HEXB Гексозаминидаза B

Наследственные двигательные и сенсорные нейропатии

Ген Белок PMP22 Белок миелина периферических нервов 22 MPZ Нулевой белок миелина LITAF Транскрипционный фактор для фактора некроза опухолей, индуцируемого липополисахаридами EGR2 Белок раннего ответа 2 NEFL Легкий белок нейрофиламентов (68 кДа) HOXD10 Белок, содержащий домен, кодируемый гомеобоксом, D10 ARHGEF10 Фактор обмена гуаниновых нуклеотидов, содержащий домен Rho, 10 FBLN5 Фибулин 5 (межклеточный матрикс) DNM2 Динамин 2 YARS Тирозил-тРНК синтетаза INF2 Инвертированный формин 2 GNB4 β–Субъединица G-белка 4 (белка, связывающего гуаниновые нуклеотиды) GDAP1 Индуцируемый ганглиозидами белок, ассоциированный с клеточной дифференцировкой, 1 MTMR2 Миотубулярин-связывающая фосфатаза 2 SBF2 Фактор, связывающий домен SET, 2 SBF1 Фактор, связывающий домен SET, 1 SH3TC2 Белок KIAA1985 NDRG1 Белок-продукт гена, контролируемого геном N-myc, 1 PRX Периаксин HK1 Гексокиназа 1 FGD4 Фрабин, связывающий актиновые микрофиламенты FIG4 Инозитфосфатаза, содержащая домен Sac, 3 SURF1 Митохондриальный мембранный белок, кодируемый локусом surfeit, 1 GJB1 Коннексин 32 (белок β1 щелевых контактов, мол. масса 32 кДа) AIFM1 Фактор индукции апоптоза, ассоциированный с митохондриями, 1 PRPS1 Фосфорибозилпирофосфатсинтетаза 1 PDK3 Киназа пируватдегидрогеназы, изофермент 3 KIF1B Белок 1B из семейства кинезинов MFN2 Митофузин 2 RAB7A Маркер поздних эндосом RAB7 из семейства онкогенов RAS TRPV4 Термочувствительный ионный канал из семейства TRP, член 4 подсемейства V GARS Глицил-тРНК-синтетаза HSPB1 Белок теплового шока 1 (27 кДа) HSPB8 Белок теплового шока 8 (27 кДа) AARS Аланил-тРНК-синтетаза DYNC1H1 Тяжелая цепь 1 цитоплазматического динеина 1 LRSAM1 Мембранная металлоэндопептидаза, содержащая богатые лейцином повторы и домен SAM, 1 DHTKD1 Белок, содержащий дегидрогеназный E1 и транскелотазный домены, 1 TRIM2 Белок, содержащий трехчастный мотив, 2 TFG Слитый белок рецепторной тирозинкиназы (TRK) MARS Метионил-тРНК-синтетаза KIF5A Белок 5A из семейства кинезинов LMNA Ламин A/C MED25 Субъединица 25 медиаторного комплекса DNAJB2 Белок, гомологичный белку теплового шока DnaJ (Hsp40), член 2 подсемейства B HINT1 Нуклеотид-связывающий белок, содержащий мотив «гистидиновая триада», 1 KARS Лизил-тРНК-синтетаза PLEKHG5 Белок, содержащий домен, гомологичный плекстрину, член 5 семейства G (с доменом RhoGef ) COX6A1 Полипептид 1 субъединицы VIa цитохром-с-оксидазы IGHMBP2 Хеликаза, связывающая иммуноглобулиновую μ-цепь, 2 SPTLC1 Субъединица 1 серин-пальмитоилтрансферазы SPTLC2 Длинная цепь 2 серин-пальмитоилтрансферазы ATL1 Атластин 1 KIF1A Белок 1A из семейства кинезинов WNK1 Протеинкиназа WNK (бедная лизином) 1 IKBKAP Ингибитор энхансера гена κ-легкой цепи, ассоциированный с киназным комплексом, В-клеток NGF β-полипептид фактора роста нервов DNMT1 ДНК(цитозин-5)-метилтрансфераза 1 SLC12A6 Котранспортер ионов калия и хлора KCC3 GJB3 Коннексин 31 (белок β3 щелевых контактов, мол. масса 31 кДа) sept-09 Септин 9 GAN Гигаксонин CTDP1 Субъединица 1 фосфатазы с карбокси-концевым доменом (CTD) VRK1 Протеинкиназа, ассоциированная с вакцинией, 1

Наследственные параплегии

Ген Белок ATL1 Aтластин 1 SPAST Спастин NIPA1 Белок–продукт гена, не импринтирующегося при синдроме Прадера-Вилли и синдроме Ангельмана, 1 KIAA0196 Струмпеллин KIF5A Белок 5A из семейства кинезинов RTN2 Ретикулон 2 HSPD1 Белок теплового шока 1 (мол. масса 60 кДа) (шаперонин) BSCL2 Сейпин REEP1 Белок – усилитель экспрессии 1 (вспомогательный рецепторный белок 1) ZFYVE27 Протрудин SLC33A1 Переносчик ацетил-кофермента А, член 33 семейства белков-переносчиков органических ионов SLC CYP7B1 Полипептид 1 подсемейства В семейства 7 цитохромов P450 SPG7 Параплегин SPG11 Спатаксин ZFYVE26 Спастизин ERLIN2 Белок, ассоциированный с липидными плотиками эндоплазматического ретикулума, 2 SPG20 Спартин SPG21 Маспардин B4GALNT1 β -1,4-N-ацетил-галактоаминилтрансфераза 1 DDHD1 Белок, содержащий домен DDHD, 1 KIF1A Белок 1A из семейства кинезинов FA2H Гидролаза жирных кислот 2 PNPLA6 Белок, содержащий фосфолипазный пататин-подобный домен, 6 C19orf12 Белок, кодируемый открытой рамкой считывания 12 хромосомы 19 GJC2 Белок щелевых контактов γ2 (мол.масса 47 кДа) NT5C2 Цитозольная 5'-нуклеотидаза II GBA2 β–Глюкозидаза 2, участвующая в обмене желчных кислот AP4B1 β1-субъединица адаптерного белкового комплекса 4 AP5Z1 ζ1-субъединица адаптерного белкового комплекса 5 (LOC9907) TECPR2 Белок, содержащий тектонин- β-пропеллерный повтор, 2 AP4M1 μ1-субъединица адаптерного белкового комплекса 4 AP4E1 ε1-субъединица адаптерного белкового комплекса 4 AP4S1 ς1-субъединица адаптерного белкового комплекса 4 DDHD2 Белок, содержащий домен DDHD, 2 C12orf65 Белок, кодируемый открытой рамкой считывания 65 хромосомы 12 CYP2U1 Полипептид 1 подсемейства U семейства 2 цитохромов P450 ARL6IP1 Белок, взаимодействующий с белком, подобным фактору AДФ-рибозилирования 6, 1 AMPD2 Аденозинмонофосфатдезаминаза 2 ENTPD1 Эктонуклеозидтрифосфатдифосфогидролаза 1 ALDH3A2 Альдегиддегидрогеназа 3A2 ALS2 Алсин L1CAM Молекула клеточной адгезии нейронов L1 PLP1 Протеолипидный белок 1 MTPAP Митохондриальная poly(A)-полимераза AFG3L2 AFG3-подобный белкок-2 (параплегин-подобная АТФ-зависимая протеаза (Saccharomyces cerevisiae) 1 SACS Саксин

Другие нервно-мышечные расстройства

Ген Белок TOR1A Торсин A SGCE ε -Саркогликан IKBKAP Ингибитор энхансера гена κ-легкой цепи, ассоциированный с киназным комплексом, В-клеток TTR Транстиретин (преальбумин, ассоциированный с амилоидозом типа I) KIF21A Белок 21A из семейства кинезинов PHOX2A Белок, содержащий гомеодомен, родственный Aristaless, парного типа, 2A TUBB3 β -Тубулин 3 TPM2 β -Тропомиозин 2 MYH3 Тяжелая цепь 3 миозина эмбриональных скелетных мышц TNNI2 Тропонин I типа 2 TNNT3 Tропонин T3 скелетных мышц SYNE1 Несприн 1 (белок ядерной оболочки, содержащий спектриновые повторы, 1) MYH8 Тяжелая цепь 8 миозина скелетных мышц в перинатальный период POLG Митохондриальная ДНК-полимераза γ SLC25A4 Митохондриальный белок-переносчик адениновых нуклеотидов C10orf2 Белок, кодируемый открытой рамкой считывания 2 хромосомы 10 POLG2 Вспомогательная субъединица митохондриальной ДНК-полимеразы RRM2B Малая субъединица (M2B) рибонуклеотидредуктазы, индуцируемая белком рP53) TK2 Митохондриальная тимидинкиназа 2 SUCLA2 β-Субъединица АТФ-специфичной (образующей АДФ) сукцинат-кофермент А-лигазы (сукцинаттиокиназы) OPA1 Динамин-подобная ГТФаза, ассоциированная с атрофией зрительного нерва STIM1 Трансмембранный сенсор кальция эндоплазматического ретикулума 1 семейства STIM ORAI1 Модулятор активатора высвобождения кальция 1 PUS1 Псевдоуридилатсинтаза 1 CHCHD10 Белок, содержащий домен СНСН (двойная спираль-спираль-двойная спираль) 10 CASQ1 Кальсеквестрин 1 быстро сокращающихся скелетных мышц YARS2 Митохондриальная тирозил-тРНК-синтетаза 2

Любой из генов, указанных в приведенных выше таблицах, может служить мишенью заместительной генотерапии, при этом нужным геном является функциональный вариант дефектного или мутантного гена.

Или же перечисленные выше гены могут использоваться как объект генного редактирования. Генное редактирование применяется для коррекции нуклеотидных последовательностей мутантных генов или для изменения экспрессии либо регуляции дефектных/аномальных генов, в результате чего достигается экспрессия функционального гена в клетках-мишенях, например в мышечных клетках. В таких случаях нужный ген выбирают из генов, кодирующих РНК, которые обладают терапевтическим эффектом, например интерферирующих РНК, РНК, играющих роль матрицы при редактировании генома (gRNA), и антисмысловых РНК, способных к пропуску поврежденных экзонов; мишенью РНК с терапевтическим эффектом являются перечисленные выше гены. Для генного редактирования применяются такие инструменты, как система CRISPR/Cas9.

В некоторых воплощениях данного изобретения мишенью генной терапии (дополняющей генотерапии или генного редактирования) является ген, обусловливающий одну из перечисленных выше мышечных дистрофий, в частности мышечной дистрофии Дюшенна (DMD; гены DMD, BMD); конечностно-поясной (поражение тазового и плечевого пояса) мышечной дистрофии (LGMD) (ген CAPN3 и другие гены); лице-лопаточно-плечевой мышечной дистрофии типа 1 (FSHD1A) (ген DUX4 или FRG1) и типа 2 (FSHD1B) (гени SMCHD1) и титинопатий (ген ТTN).

В некоторых воплощениях данного изобретения предлагаемая фармацевтическая композиция предназначена для использования при лечении мышечных заболеваний (например, миопатий) или поражений мышц, в частности генетически обусловленных нервно-мышечных расстройств без поражения печени, например мышечных дистрофий, врожденных мышечных дистрофий, врожденных миопатий, дистальных миопатий, других миопатий, миотонических синдромов, заболеваний, затрагивающих ионные каналы, злокачественной гипертермии, метаболических миопатий, наследственных кардиомиопатий, врожденных миастенических синдромов, заболеваний двигательных нейронов, наследственных параплегий, наследственных двигательных и сенсорных нейропатий и иных нервно-мышечных расстройств.

Мышечные дистрофии включают, в частности:

- дистрофинопатии – различные заболевания мышц, сцепленные с Х-хромосомой, которые вызываются патологическими вариантами гена DMD, кодирующего белок дистрофин; дистрофинопатии включают мышечную дистрофию Дюшенна (DMD), мышечную дистрофию Бекера (BMD) и дилатационную кардиомиопатию, ассоциированную с геном DMD;

- конечностно-поясные мышечные дистрофии (LGMD); расстройства этой группы по клинической картине сходны с мышечной дистрофией Дюшенна, но встречаются у людей обоего пола в результате наследования по аутосомно-рецессивному и аутосомно-доминантному типам. Конечностно-поясные мышечные дистрофии вызываются мутацией генов, кодирующих связанные с мембраной мышечных клеток саркогликаны и другие белки, взаимодействующие с дистрофином. Обозначение LGMD1 относится к заболеваниям, наследующимся по аутосомно-доминантному типу, а LGMD2 - к заболеваниям, наследующимся по аутосомно-рецессивному типу. Сообщалось о патогенных вариантах генов в более чем 50 локусах (LGMD1A - LGMD1H; LGMD2A -LGMD2Y);

- кальпаинопатию (LGMD2A), причиной которой являются мутации в гене CAPN3, причем описано более 450 его патогенных вариантов;

- мышечную дистрофию Эмери-Дрейфуса (EDMD), которая вызывается дефектами одного из генов, в том числе в гене EMD, кодирующем эмерин, гене FHL1 и гене LMNA, кодирующем ламины A и C);

- мышечную дистрофию, связанную с несприном-1 и несприном-2, которая вызывается дефектами генов SYNE1 и SYNE2 соответственно;

- мышечную дистрофию, связанную с белком LUMA, которая вызывается дефектами гена TMEM43;

- мышечную дистрофию, связанную с белком LAP1B, которая вызывается дефектами гена TOR1AIP1; и

- лице-лопаточно-плечевой мышечной дистрофии типа 1 (FSHD1A), ассоциированную с дефектами гена DUX4 (уменьшением числа макросателлитных повторов D4Z4 в субтеломерной области хромосомы 4q35) или гена FRG1;

- лице-лопаточно-плечевой мышечной дистрофии типа 2 (FSHD1B), которая вызывается дефектами гена SMCHD1.

Конкретным примером генного редактирования может быть лечение конечностно-поясной мышечной дистрофии типа 2A (LGMD2), которая вызывается мутациями в гене CAPN3, кодирующем кальпаин-3. Другой пример – лечение путем коррекции мутаций в генах DMD или TNT.

Таким образом, путем генного редактирования или заместительной генотерапии обеспечивается наличие нормального варианта гена, дефектом которого обусловлено заболевание, в мышечных клетках больного, что дает свой вклад в эффективное лечение данной болезни. По такому же принципу возможно лечение перечисленных выше генетически обусловленных мышечных заболеваний путем замены или редактирования соответствующих генов.

Заместительная или дополняющая генная терапия может использоваться для лечения раковых заболеваний, в частности рабдомиосарком. При раке нужным геном может быть ген, участвующий в регуляции клеточного цикла, или метаболизма, или миграции опухолевых клеток, или индукции гибели опухолевых клеток. Например, экспрессия гена, кодирующего индуцибельную каспазу-9, в мышечных клетках приводит в действие механизм клеточной смерти, что можно использовать предпочтительно в комбинированной терапии для возбуждения продолжительного противоопухолевого иммунного ответа.

Генное редактирование можно применять для изменения экспрессии генов в мышечных клетках при аутоиммунных состояниях или раковых заболеваниях, или для нарушения жизненного цикла вирусов в этих клетках. В таких случаях нужный ген предпочтительно выбирают из генов, кодирующих РНК, служащую матрицей при редактировании генома (gRNA), генов сайт-специфичных эндонуклеаз (нуклеаз TALEN, мегануклеаз, нуклеаз с цинковыми пальцами, нуклеаз Cas), ДНК-матриц и интерферирующих РНК, например коротких РНК, образующих шпильки (shRNA), и микроРНК. Для этих целей используются такие инструменты, как система CRISPR/Cas9.

В некоторых воплощениях данного изобретения генная терапия применяется для лечения заболеваний, поражающих другие ткани, путем экспрессии генов, дающих терапевтический эффект в мышечной ткани. Это позволяет избежать экспрессии гена, дающего терапевтический эффект, в печени, в частности у больных с сопутствующим печеночным расстройством, например гепатитом. В таких случаях ген, дающий терапевтический эффект, кодирует предпочтительно белок, пептид или антитело, обладающее терапевтическим действием и выделяющееся из мышечных клеток в кровоток, который доставляет данный белок, пептид или антитело в другие ткани-мишени, например в печень. Примеры генов, дающих терапевтический эффект, включают (не ограничиваясь перечисленным здесь) гены, кодирующие факторы свертывания крови VIII и IX, а также кислую α-глюкозидазу.

Фармацевтическую композицию по данному изобретению, содержащую векторные частицы на основе аденоассоциированного вируса с пониженным тропизмом к печеночной ткани, можно вводить больным с сопутствующим заболеванием печени, например гепатитом, включая вирусный или токсический гепатит.

В контексте данного изобретение термин «терапевтически эффективное количество» относится к дозе, достаточной для обращения, ослабления или подавления прогрессирования расстройства или состояния, подлежащего лечению, или для обращения, ослабления или подавления развития одного или более симптомов расстройства или состояния, подлежащего лечению.

Эффективная доза определяется и подбирается специалистом в области медицины в зависимости от ряда факторов, включая специфику используемой композиции, путь введения и данные конкретного индивида, например пол, возраст, массу тела, принимаемые медикаментозные средства и др.

В различных воплощениях данного изобретения предлагаемая фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель и/или несущую среду.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель» в настоящем документе относится к носителям, не вызывающим негативных, аллергических или иных неблагоприятных реакций при введении млекопитающему, в особенности человеку, сообразно конкретному случаю. Фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент – это нетоксичный твердый, полужидкий или жидкий наполнитель, разбавитель, вмещающий материал или состав, выполняющий какую-либо вспомогательную функцию.

Предпочтительно фармацевтическая композиция по данному изобретению содержит несущую среду/носитель, фармацевтически приемлемый для инъецируемого препарата. Такой средой/носителем может быть, в частности, изотонический стерильный солевой раствор (одно- или двузамещенного фосфата натрия, хлорида натрия, калия или магния и подобных солей или смесей этих солей) или безводная, в частности лиофилизованная композиция, которая при добавлении (по обстоятельства) стерильной воды или физиологического раствора становится раствором, пригодным для введения путем инъекции.

Лекарственные формы, пригодные для введения путем инъекции, включают стерильные водные растворы или суспензии. Такой раствор или суспензия может содержать добавки, совместимые с вирусными векторами и не мешающие проникновению векторных частиц в клетки-мишени. В любом случае лекарственная форма по данному изобретению должна быть стерильной и жидкой в такой степени, чтобы ее было легко вводить с помощью шприца. Лекарственная форма по данному изобретению должна быть стабильна в условиях изготовления и хранения и защищена от загрязнения микроорганизмами, например бактериями и грибками. Примером пригодного по данному изобретению раствора является буферный раствор, например физиологический раствор, забуференный фосфатом (PBS) или раствор Рингер-лактат (раствор Хартманна).

Данным изобретением предлагается также способ лечения заболеваний, поражающих мышечные ткани, в частности скелетные мышцы и/или сердечную мышцу, включающий введение больному терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, описанной выше.

Данным изобретением предлагается также способ лечения заболеваний путем экспрессии генов, дающих терапевтический эффект, включающий введение больному терапевтическим эффективного количества фармацевтической композиции, описанной выше.

В настоящем документе термины «больной», «пациент» или «индивид» относятся к млекопитающим. Предпочтительно пациент/больной/индивид по данному изобретению – это человек.

В контексте данного изобретения термин «лечение» в настоящем документе употребляется в значении «обращение, ослабление или подавление прогрессирования расстройства или состояния, в отношении которого употреблен данный термин», или «обращение, ослабление или подавление развития одного или более симптомов расстройства или состояния, в отношении которого употреблен данный термин».

Фармацевтическая композиция по данному изобретению вводится индивиду, как правило, известными способами, в дозировке и режиме, эффективных для возникновения терапевтического эффекта у данного индивида.

Введение фармацевтической композиции по данному изобретению индивиду может осуществляться парентерально, перорально, местно или локально-регионально. Парентеральное введение осуществляется предпочтительно путем инъекций или перфузий, например подкожных (SC), внутримышечных (IM), внутрисосудистых, (например, внутривенных (IV)), внутрибрюшинных (IP), интрадермальных (ID) и др. Предпочтительно введение фармацевтической композиции по данному изобретению производит системный эффект во всем организме, то есть во всех мышцах индивида, включая диафрагму и сердечную мышцу. Предпочтительно введение фармацевтической композиции по данному изобретению является системным, более предпочтительно парентеральным.

Практика осуществления данного изобретения предполагает (если не указано иного) применение обычных методов и технологий в пределах компетенции специалиста в данной области техники. Такие методы и технологии вполне описаны в литературных источниках.

Ниже данное изобретение раскрывается на не имеющих ограничительного характера примерах, иллюстрируемых прилагающимися к настоящему описанию фигурами.

Описание иллюстраций

Фиг. 1. Схема образования гена сap (кодирующего белок Сар) нового серотипа AAV, являющегося гибридом серотипов AAV9 и AAVrh74.

A. Изображены гены сap (белок VP1) серотипов AAV9 и AAVrh74; выделена последовательность вариабельной области. N- и C-концевые участки вариабельной области соответствующих белков - это последовательности SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38 у серотипа AAV9 и SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 40 у серотипа AAVrh74. B. Гибридные гены сap серотипов AAV9-rh74 и AAVrh74-9 (белок VP1).

Фиг. 2. Образование вирионов новых серотипов AAV, являющихся гибридами серотипов AAV9 и AAVrh74.

Клетки HEK293T продуцировали вирионы гибридных серотипов (AAV9-rh74 и AAVrh74-9) и контрольных серотипов (AAV9 и AAVrh74). Количество вирусных геномов определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с выщеплением 5' концевой метки (TaqMan). Планки погрешности представляют стандартную ошибку среднего (SEM).

Фиг. 3. Схема поиска тканей-мишеней (иссдедования биораспределения вещества) Vg – вирусный геном (вг).

Фиг. 4. Количественное определение экспрессии трансгена в мышцах и органах после системного введения AAV гибридных серотипов.

Определяли экспрессию люциферазы в скелетных мышцах (A и B) и органах (C и D) у мышей, которым вводили вирионы гибридных серотипов AAV9-rh74 и AAVrh74-9 и контрольных AAV9 и AAVrh74 в двух различных дозах: низкая = 2 E10 вг/особь (A и C), высокая = 1 E11 вг/особь (B и D). Планки погрешности представляют стандартную ошибку среднего (SEM). TA - передняя большеберцовая мышца; Pso – поясничная мышца; Qua – четырехглавая мышца; Dia – диафрагма; RLU – относительные единицы люминисценции.

Примеры

Пример 1. Конструирование и получение векторов на основе гибридных серотипов рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) с гибридными капсидами

AAV9-rh74 и rh74-AAV9

1. Материалы и методы

Конструирование плазмид для новых серотипов AAV

Чтобы сконструировать плазмиду, cодержащую нуклеотидные последовательности, кодирующие репликазу Rep AAV2 и гибридный капсидный белок Cap 9-rh74, синтезировали фрагмент длиной 1029 нуклеотидов, содержащий высоко вариабельный участок последовательности, кодирующей капсидный белок Cap AAV-rh74, фланкированный фрагментами последовательности, кодирующей Cap AAV9, и сайты рестрикции BsiWI на 5’-конце и Eco47III на 3’-конце (GeneWiz). Используя указанные сайты рестрикции, полученный фрагмент встроили в плазмиду pAAV2-9, содержащую нуклеотидные последовательности, кодирующие белки Rep AAV2 и Cap AAV9, чтобы заменить соответствующую последовательность Cap AAV9.

Чтобы сконструировать плазмиду, cодержащую нуклеотидные последовательности, кодирующие репликазу Rep AAV2 и гибридный капсидный белок Cap rh74-9, синтезировали фрагмент длиной 2611 нуклеотидов, содержащий высоко вариабельный участок последовательности, кодирующей капсидный белок Cap AAV-9, фланкированный остальной частью последовательности Cap AAV_rh74, частью последовательности, кодирующей Rep AAV2, и сайтами рестрикции HindIII на 5’-конце и PmeI на 3’-конце (GeneWiz). Используя указанные сайты рестрикции, полученный фрагмент встроили в плазмиду pAAV2-9, содержащую нуклеотидные последовательности, кодирующие белки Rep AAV2 и Cap AAV9, чтобы заменить всю последовательность Cap AAV9.

Получение AAV

В этом исследовании пользовались двумя протоколами, соответствующими двум масштабам получения вируса. В условиях для получения вируса в малом масштабе адгезивные клетки HEK293 культивировали на 6-луночном планшете в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). В условиях для получения вируса в большом масштабе клетки HEK293 культивировали в суспензии в 250 мл бессывороточной среды. Клетки трансфецировали тремя плазмидами: i) трансгенной плазмидой, содержащей инвертированные концевые повторы (ITR) AAV2, фланкирующие экспрессионную кассету, которая кодировала люциферазу светлячка; ii) вспомогательной плазмидой pXX6, содержащей аденовирусные нуклеотидные последовательности, необходимые для образования AAV; iii) плазмидой, содержащей гены, кодирующие белки Rep и Cap AAV, которые определяют серотип AAV. Через двое суток после трансфекции клетки подвергали лизису для высвобождения вирусных частиц AAV.

Лизат, содержащий вирусные частицы, очищали: сначала дважды центрифугировали в градиенте плотности хлорида цезия, затем делали диализ либо аффинную хроматографию. Содержание вирусных геномов определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с выщеплением 5' концевой метки (TaqMan), используя праймеры и зонды, соответствующие инвертированным концевым повторам (ITR) в геноме вектора на основе AAV (Rohr et al., J. Virol. Methods, 2002, 106, 81–88).

2. Результаты

Конструирование новых серотипов

Аминокислотные последовательности белка VP1 (кодируемого генами Cap) AAV9 (SEQ ID NO: 1) и AAV-rh74 (SEQ ID NO: 2) выравнивали с помощью программы BLASTP. Были выявлены высоко вариабельные области, расположенные между положениями 449 и 609 полипептидной цепи Сар AAV9 и между положениями 450 и 611 полипептидной цепи Сар AAV-rh74 (см. фиг. 1А). Были сконструированы два новых гена cар (последовательности SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7) путем замены высоко вариабельной области одного из указанных двух серотипов на соответствующую область второго серотипа и наоборот (см. фиг 1В). каждый из полученных двух гибридных генов cар встроили в плазмиду, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Rep AAV2, что обеспечивало образования рекомбинантных вирусных частиц AAV. Новым серотипам дали следующие названия: серотип, у которого имелась большая часть последовательности белка Сар AAV9 и высоко вариабельная область AAV-rh74 - это “Гибрид AAV 9-rh74” (SEQ ID NO: 3); серотип, у которого имелась большая часть последовательности Cap AAV-rh74 и высоко вариабельная область AAV9 - это “Гибрид AAV rh74-9” (SEQ ID NO: 4).

Получение новых гибридных серотипов AAV

Были получены вирусные частицы AAV новых гибридных серотипов и контрольные в двух вариантах: в малом масштабе (2 мл) на 6-луночном планшете и в большем масштабе (250 мл) в суспензии культивируемых клеток. Как показано на фиг.2, новые гибридные серотипы получаются с выходом, пригодным для применений с переносом генов

Пример 2. Исследование биораспределения векторных частиц на основе гибридных серотипов с капсидами AAV9-rh74 и AAVrh74-9

1. Материалы и методы

Эксперименты in vivo

Векторные частицы на основе AAV вводили самцам мыши линии B6Albino в возрасте 1 месяц; введение осуществлялось путем инъекции в хвостовую вену. Брали две дозировки: низкую - 2 E10 (2х10¹⁰) вирусных геномов (вг) на 1 особь и высокую - 1 E11 (10¹¹) вг/особь. Через 15 суток после введения вектора мышей анестезировали (кетамин + ксилазин) и вводили внутрибрюшинно люциферин, после чего определяли активность люциферазы, измеряя люминисценцию с помощью системы визуализации in vivo IVIS Lumina (производство Perkin Elmer). Через 30 суток после введения вектора мышей умерщвляли, брали образцы скелетных мышц и внутренних органов и замораживали их в жидком азоте.

Молекулярный анализ

Образцы тканей гомогенизировали в буферном растворе для лизиса клеток [Трис (основание) 25 мМ, хлорид магния (MgCl₂) 8 мМ, дитиотриэтол (DTT) 1 мМ, этилендиаминтетраацетат (EDTA) 1 мМ, глицерин 15%, Triton X-100 0,2%], в который добавляли смесь ингибиторов протеаз Protease Inhibitor Cocktail (производство Roche). В лизатах образцов определяли экспрессию люциферазы с помощью многофункционального планшетного анализатора EnSpire Multimode Plate Reader (производство Roche), в буферном растворе для клеток [трис (основание) 25 мМ, хлорид магния (MgCl₂) 8 мМ, дитиотриэтол (DTT) 1 мМ, этилендиаминтетраацетат (EDTA) 1 мМ, глицерин 15%, аденозинтрифосфат (ATP) 2 мМ], в который непосредственно перед использованием добавляли люциферин (83 мкМ). В образцах также определяли суммарное содержание белка с помощью набора Pierce BCA protein assay (производство Thermo Fisher). Результаты измерений (интенсивность люминисценции) нормализовали по суммарному содержанию белка.

Для определения содержания вирусных геномов в образцах (VCN - число копий вектора) из них выделяли ДНК с помощью набора NucleoSpin Tissue (производство Macherey-Nagel). Для полимеразной цепной реакции в реальном времени брали 100 нг ДНК и действовали по тому же протоколу, который описан выше для определения титра векторов на основе AAV. Для геномного контроля в этом же эксперименте амплифицировали экзон Mex5 гена титина.

2.Результаты

Для оценки биораспределения новых серотипов получали гибридные AAV и контрольные векторы, содержащие экспрессионную кассету с репортерным геном люциферазы под контролем промотора CMV, считающегося универсальным. Указанные векторы вводили мышам системно путем инъекции в двух дозировках: низкой - 2 E10 (2х10¹⁰) вирусных геномов (вг) на 1 особь и высокой - 1 E11 (10¹¹) вг/особь. Через 15 суток после введения делали визуализацию распределения векторов по всему организму, а через 30 суток брали образцы из различных скелетных мышц и внутренних органов (см. фиг. 3).

В образцах определяли интенсивность экспрессии люциферазы и нормализовали данные по суммарному содержанию белка в указанных образцах.

В мышцах гибрид AAV 9-74 давал хороший уровень экспрессии трансгена во всех проверенных на этот счет мышцах, включая скелетные и сердечную мышцы, сходный с таковым для AAVrh74 (см. фиг. 4A - 4D).

Оказалось, что в печени для обоих гибридных векторов уровень экспрессии трансгена значительно понижен по сравнению с его высоким уровнем в случае взятых для контроля векторов AAV9 или AAV-rh74 (см. фиг. 4C - 4D).

Два новых серотипа AAV были созданы путем комбинирования серотипов AAV9 и AAV-rh74, которые эффективно инфицируют как скелетные мышцы, так и печень. А векторы гибридных серотипов по данному изобретению обеспечивали перенос гена в скелетных мышцах, но не давали эффективной трансдукции в печени.

Пример 3. Вектор на основе гибридного серотипа AAV9-rh74, кодирующий капсидный белок с пептидной модификацией

В аминокислотной последовательности гибридного белка Cap9-rh74 модифицировали пептиды с целью повысить тропизм вектора на основе гибридного серотипа AAV 9-rh74 к мышечной ткани. Модификацию капсида AAV осуществляли по работе Kienle E.C. (Диссертация на соискание степени доктора естественных наук, 2014 г., Объединенный факультет естественных наук и математики Университета Руперто_Карола в Гейдельберге, Германия), используя пептид, описанный в работе Michelfelder et al. (PLoS ONE, 2009, 4, e5122). Вкратце, проделывали следующее. Гексапептид QQNAAP (SEQ ID NO: 41), имеющийся в белке VP1 гибридного капсида 9-rh74 (положения с 587-го по 592-е последовательности SEQ ID NO: 3) в результате мутации превращался в октапептид GQSGAQAA (SEQ ID NO: 42) и пептид P1 (RGDLGLS; SEQ ID NO: 12) встраивали между остатком глицина в положении 4 и остатком аланина в положении 5. Гибридный капсидный белок Сар9-rh74, модифицированный пептидом P1, имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (ему соответствует нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 10). Векторы получали путем тройной трансфекции клеток HEK293, культивируемых в суспензии, и очищали путем аффинной хроматографии, как в Примере 1. Векторы вводили мышам, которых через месяц после этой инъекции умерщвляли, и брали образцы тканей для определения биораспределения, как в Примере 2. Ожидаемый эффект этой модификации – увеличение количества вектора в мышечной ткани.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан белок капсида рекомбинантного аденоассоциированного вируса (AAV), являющийся гибридом капсидных белков AAV серотипа 9 (AAV9) и AAV серотипа 74 (AAVrh74), включающий последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID NO: 3, и обладающий пониженным тропизмом к печеночной ткани по сравнению с капсидными белками исходных серотипов AAV9 и AAVrh74. Представлен полинуклеотид, кодирующий белок капсида рекомбинантного гибридного AAV в экспрессируемой форме. Также представлена векторная частица на основе AAV, для экспрессии нужного гена в мышечных клетках, содержащего нуклеотидную последовательность, соответствующую белку капсида рекомбинантного гибридного AAV. Изобретение расширяет арсенал средств для генетической терапии. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр.

1. Белок капсида рекомбинантного аденоассоциированного вируса (AAV), являющийся гибридом капсидных белков AAV серотипа 9 (AAV9) и AAV серотипа 74 (AAVrh74), включающий последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID NO: 3, и обладающий пониженным тропизмом к печеночной ткани по сравнению с капсидными белками исходных серотипов AAV9 и AAVrh74.

2. Белок капсида рекомбинантного гибридного AAV по п. 1, обладающий тропизмом к мышечной ткани, сходным с таковым исходных капсидных белков AAV9 и/или AAVrh74.

3. Белок капсида рекомбинантного гибридного AAV по п. 1 или 2,

где указанный гибрид образуется в результате замены вариабельной области, расположенной между положениями 449-м и 609-м капсидной последовательности AAV9 SEQ ID NO: 1, соответствующей вариабельной областью, расположенной между положениями 450-м и 611-м капсидной последовательности AAVrh74 SEQ ID NO: 2.

4. Белок капсида рекомбинантного гибридного AAV по любому из пп. 1-3, включающий последовательность, имеющую по меньшей мере на 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичности с указанной последовательностью SEQ ID NO: 3.

5. Белок капсида рекомбинантного гибридного AAV по п. 4, который включает последовательность SEQ ID NO: 3.

6. Белок капсида рекомбинантного гибридного AAV по любому из пп. 1-5, являющийся гибридным белком VP1, VP2 или VP3.

7. Полинуклеотид, кодирующий белок капсида рекомбинантного гибридного AAV по любому из пп. 1-6 в экспрессируемой форме.

8. Векторная частица на основе AAV, для экспрессии нужного гена в мышечных клетках, содержащего нуклеотидную последовательность, соответствующую белку капсида рекомбинантного гибридного AAV по любому из пп. 1-6.

9. Векторная частица AAV по п. 8, которая дополнительно включает по меньшей мере один белок капсида AAV природного или искусственного серотипа AAV, отличного от AAV9 и AAVrh74.

10. Векторная частица на основе AAV по п. 8 или 9, в которой нужный ген выбирают из группы, состоящей из

(i) генов, дающих терапевтический эффект;

(ii) генов, кодирующих белки или пептиды, дающие терапевтический эффект, например антитела, или фрагменты антител, или ферменты для редактирования генома; и

(iii) генов, кодирующих РНК, дающие терапевтический эффект, например интерферирующие РНК, малые РНК, играющие роль матрицы при редактировании генома (gRNA), и антисмысловые РНК, способные к пропуску поврежденных экзонов.