СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ОТВЕТА НА ПРОТИВОВИРУСНУЮ ТЕРАПИЮ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ С Российский патент 2015 года по МПК G01N33/48 

Предлагаемое изобретение относится к гепатологии и предназначено для прогнозирования ответа на противовирусную терапию (ПВТ) при хроническом гепатите С (ХГС).

Уровень техники

В настоящее время общепризнанным способом этиотропного лечения ХГС, в том числе у детей, является длительное применение препаратов интерферона.

Прогнозирование эффективности лечения больных ХГС представляет собой важную практическую задачу в связи с высокой стоимостью противовирусных препаратов, наличием многочисленных побочных действий при их применении, а также отсутствием способности надежно элиминировать вирус из организма больного и связанной с этим фактом необходимостью выбора методик лечения.

Проведение ПВТ при ХГС - процесс длительный (24-48 недель и более), многокомпонентный, отягощенный большим количеством побочных явлений и высокой стоимостью препаратов.

Дозы, схемы и длительность ПВТ должны быть индивидуализированы и определяются целым рядом параметров, относящихся как к особенностям вируса (например, генотип), так и характеристике пациента, серьезно влияющих на эффективность проводимого лечения.

Перед началом терапии принято учитывать так называемые «предикторы эффективности» (Протокол диагностики и лечения больных вирусными гепатитами В и С, РЖГГК, 2010, т.ХХ, №6). К ним относят:

- генотип вируса не - 1;

- вирусная нагрузка менее 600000 МЕ/мл;

- женский пол;

- возраст моложе 40 лет;

- раса европейская;

- масса тела менее 75 кг;

- отсутствие резистентности к инсулину;

- повышенная активность трансаминаз;

- отсутствие выраженного фиброза или цирроза печени.

Каждый из этих признаков в отдельности и их сочетания в определенной степени предопределяют вероятность благоприятного ответа на терапию.

В самое последнее время предложено также учитывать генетический статус пациента в виде определения полиморфизма гена IL - 28В, кодирующего синтез интерферона лямбда 3 (Клин. Гепатология, 2010, №1, стр.42). Однако все эти данные ориентировочны и позволяют лишь наметить общий план лечения.

В последние годы наибольшее значение придается оценке индивидуального ответа конкретного пациента в ходе уже начатой терапии. При этом основной (реперной) точкой, к которой «привязаны» критерии оценки эффективности ПВТ и ее коррекции, является 12 недель от начала лечения. Снижение на 2 log или исчезновение РНК ВГС из крови пациента считается предиктором устойчивого вирологического ответа (РГГКЖ, 2010, т.ХХ, №6, стр.31). Однако, как показывает практика, и этот критерий не является абсолютным, и поиск дополнительных тестов представляет собой в настоящее время одно из важнейших направлений совершенствования ПВТ ХГС.

Известен способ прогнозирования эффективности интерферонотерапии вирусных гепатитов у детей с помощью оценки показателей лейкоцитмодулирующей активности сыворотки крови до начала лечения (RU 2739689, 20.10.2001). Способ этот имеет ряд недостатков, ограничивающих его применение, к ним относятся:

- способ предназначен только для детей;

- определение показателя до начала лечения имеет характер группового, а не индивидуального прогнозирования;

- методы интерферонотерапии, которыми пользовались авторы (оральные препараты интерферона, интерферон в сочетании с циклофероном), не относятся к методам лечения ХГС, общепризнанным мировым гепатологическим сообществом, и поэтому не могут использоваться для прогнозирования официально рекомендуемой в настоящее время ПВТ при ХГС.

Известен способ прогнозирования результатов лечения больных ХГС препаратами интерферона-альфа (ИФН-а), который является ближайшим аналогом предлагаемого способа. Способ предусматривает оценку уровня синтеза ИФН-гамма и ИЛ-4 непосредственно перед началом ПВТ и повторно через 4,5 часа после 1-й инъекции (RU 2287825, 20.11.2006). Способ обладает рядом недостатков и ограничений:

- разработан и может быть использован только у взрослых пациентов;

- характеризует избранные показатели только перед началом терапии и ответ на 1-ю инъекцию, которые могут не совпадать с таковыми в ходе многомесячной ПВТ;

- повторное взятие крови через 4,5 часа после первого ее забора на практике затруднено у амбулаторных пациентов, каковыми являются больные ХГС;

- 4,5 часа, избранные авторами как пик терапевтической активности ИФН, не могут относиться в равной мере и к стандартным ИФН-ам, и к его пегилированным формам, в то время как пациенты, у которых проводилось исследование, получали и те, и другие, и не разделены по этому признаку.

Раскрытие изобретения.

Задачей изобретения является разработка нового подхода к индивидуализации проведения ПВТ при ХГС как у взрослых, так и у детей.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение точности прогнозирования для выбора оптимальной тактики лечения у каждого пациента.

Технический результат достигается за счет определения на 12 неделе противовирусного лечения уровня интерферона в плазмоцитоидных дендритных клетках крови (ПДК).

С описанием в 1999 году ПДК открыта новая страница в учении об иммунитете. Эти уникальные клетки играют ключевую роль в иммунном ответе, обеспечивая взаимодействие врожденного (мощная выработка интерферона) и приобретенного (представление антигена) иммунитета (Liu YJ. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu Rev Immunol 2005; 23:275-306; Kadowaki N., YJ Liu. Natural type I interferon-producing cells as a link between innate and adaptive immunity. Hum. Immunol. 2002 Dec 12; 63:1126-1132).

В зрелом виде ПДК циркулируют в периферической крови, а также в очень малых количествах присутствуют в костном мозге (до 1%), селезенке, тимусе, лимфоузлах (0,05-0,5%); практически отсутствуют в периферических тканях. Исключение составляют ткани печени (Cella M, Jarrossay D. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat Med 1999; 5(8):919-23).

Отличительными особенностями ПДК являются - немедленная (через 2-4 часа) выработка полного спектра ИФН I и III типа (λ), а также наличие специфических TLR-рецепторов (TLR7 и TLR9). С помощью регулятора экспрессии ИФН I типа (IRF7) стремительно активируется распознавание TLR рецепторами вирусных нуклеиновых кислот (Cisse В, Caton ML, Lehner M, Maeda Т, Scheu S, Reizis B. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 2008; 135(1):37-48), после чего начинается немедленная продукция ИФН I типа. Транскрипционные уровни IRF7 в ПДК выше, чем в обычных клетках (Crozat K, Guiton R, Guilliams M, Henri S, Baranek T, Schwartz-Comil I et al. Comparative genomics as a tool to reveal functional equivalences between human and mouse dendritic cell subsets. Immunol Rev 2010; 234(1):177-98).

При ХГС в 2010 году в этих клетках был открыт новый, биологический механизм ИФН-образования. Особенности образования ИФН при HCV-инфекции продемонстрировали в своем исследовании Takahashi et al. (Takahashi K, Shinichi A. Plasmacytoid dendritic cells sense hepatitis С virus-infected cells, produce interferon and inhibit infection. Proc Nati Acad Sci USA, Pablished on line 2010-03-15). По мнению авторов, при ХГС инфицированный гепатоцит, в котором активно реплицируется вирус, взаимодействует с ПДК, вызывая массивную выработку ИФН, не заражая саму ПДК.

В наших исследованиях при изучении ПДК, их роли в патогенезе и ИФН-образовании при ХГС у взрослых и детей был получен ряд доказательств того, что состояние этих клеток может лежать в основе хронического течения инфекции, а уровень ИФН-генеза в ПДК в ответ на ПВТ - определять ее эффективность.

В ходе специально проведенного нами исследования у 133 больных ХГС (58 детей, 75 взрослых пациентов) было показано, что пациенты, положительно ответившие на ПВТ стойким прекращением репликации вируса, имели на 12 неделе лечения показатель выработки ИФН в ПДК - 1558±277,5 пг/мл, а те, кто не дал желаемого ответа - 69,11±54,33 пг/мл (у здоровых детей и взрослых ИФН в ПДК не определяется, поэтому за уровень выработки ИФН в ПДК у здоровых лиц принято 3 пг/мл - верхний уровень детекции метода). Статистическая достоверность различий показателей в сравниваемых группах очень высока (p<0,001). Как указывалось выше, основной (реперной) точкой, к которой «привязаны» критерии оценки эффективности ПВТ и ее коррекции, является 12 недель от начала лечения.

Полученные нами данные указывают на тесную связь стимуляции ИФН-образования в ПДК с положительным ответом на ПВТ, в связи с этим уровень подъема ИФН-генеза в ПДК на 12-й неделе лечения может служить надежным прогностическим тестом эффективности проводимой терапии.

В ходе проведенного исследования были отобраны 2 группы пациентов:

1 группа - пациенты, которые находились на комплексной ПВТ и ответили на нее стойким прекращением репликации вируса как на терапии, так и после ее окончания (N=26; выработка ИФН составила 1558±2277,5 пг/мл).

2 группа - пациенты, которые также получали ПВТ, но не ответили стойким прекращением репликации вируса ни на фоне проводимого лечения, ни после его окончания (N=11; выработка ИФН составила 69,11±54,33 пг/мл).

Данные, полученные в группах сравнения, достоверны (p<0,001). Положительный ответ на ПВТ тесно связан с уровнем ИФН-образования в ПДК. Чем выше уровень выработки ИФН, тем вероятнее благоприятный ответ на ПВТ.

Первая группа была разделена на две подгруппы:

1.1. группа - взрослые пациенты, находящиеся на ПВТ и ответившие на нее стойким прекращением репликации вируса как на терапии, так и после ее окончания (N=18; выработка ИФН составила 1959±341,5 пг/мл).

1.2. группа - дети, больные ХГС, находящиеся на ПВТ и ответившие на нее стойким прекращением репликации вируса как на терапии, так и после ее окончания (N=8; выработка ИФН составила 656,2±297,5 пг/мл; mediana(min-max) - 405,1(112,5-2625) пг/мл.

Аналогичное деление было и во второй группе:

2.1. - взрослые пациенты, находящиеся на ПВТ, но не ответившие стойким прекращением репликации вируса ни на фоне проводимого лечения, ни после его окончания (N=6; выработка ИФН составила 98,57±98,57 пг/мл).

2.2. - дети, больные ХГС, находящиеся на ПВТ, но не ответившие стойким прекращением репликации вируса ни на фоне проводимого лечения, ни после его окончания (N=5; выработка ИФН составила 33,76±32,97 пг/мл, mediana (min-max) - 0 (0-165.6 пг/мл).

Данные, полученные в группах сравнения 1.1 и 2.1 (взрослые пациенты), достоверны при использовании стандартного метода Стьюдента (p<0,005). Для групп 1.2 и 2.2 (дети) в связи с меньшей численностью групп применялся непараметрический метод оценки результатов (метод Манна-Уитни), при использовании которого мы также получили достоверность различий (p<0,02).

Способ осуществляют следующим образом.

У пациента, страдающего ХГС, проводят забор венозной крови до назначения противовирусной терапии и на 12-й неделе ее проведения. Забор венозной крови осуществляют стандартным способом в пробирку 10 мл (или 5 мл) с консервантом ЭДТА. Венозную кровь хранят не более 6 часов. Исследование осуществляют сразу после забора крови, учитывая время, необходимое для клеточной стабилизации (не менее 40 мин). Далее в ламинаре, в стерильных условиях, отбирают 100 мкл крови, к которым добавляют 200 мкл раствора А (для приготовления раствора А необходим стимулятор клеточного роста ODN2216 - синтетический олигонуклеотид, иммуностимулирующий сугубо TLR9 рецепторы) и 200 мкл раствора В (для приготовления раствора В необходим IL3, который стимулирует дифференцировку мультипотентных гемопоэтических стволовых клеток). Затем пробу помещают в CO2 инкубатор на 24 часа, после чего кровь центрифугируют и отбирают супернатант культуры клеток, который при необходимости длительного хранения замораживают при -80°C. После чего пробы проходят стандартную постановку методом ИФА «ELISA», который предназначен для определения уровня выработки ИФН.

Если уровень интерферона в выделяемых из крови плазмоцитоидных дендритных клетках увеличился в 20 раз и более по сравнению с исходными значениями, определяемыми перед началом противовирусной терапии, или в 2,6×10² раз у взрослых и 1,2×10² у детей по сравнению с нормальными показателями ИФН-генеза у здоровых, если отсутствуют показатели ИФН-генеза перед началом ПВТ, прогнозируют эффективность проводимого лечения с вероятностью 96,9%.

Клинические примеры.

Пример 1.

Больной Глеб А., 17 лет, № карты амбулаторного больного - 8.

Обратился на амбулаторный прием к гепатологу с жалобами на снижение аппетита, повышенную утомляемость, боли в правом подреберье при физической нагрузке.

Из анамнеза заболевания было установлено, что у мальчика с 2006 года определяются маркеры ВГС. Эпид. анамнез: в возрасте 2 лет (1999 г.) - парентеральное вмешательство (гемотрансфузия) по поводу обширного ожога.

Противовирусная терапия не проводилась, в лечении периодически получал курсы гепатопротекторов.

Объективно - состояние средней степени тяжести по основному заболеванию. Кожа и видимые слизистые чистые. Печень пальпируется у края реберной дуги, уплотнена.

По результатам биохимического анализа крови активность трансаминаз - АЛТ - 52 Ед./л и ACT - 46 Ед./л. Маркеры ГС: HCV РНК+, HCV РНК колич. - 1,2×10⁵ МЕ/мл, генотип 1в.

Фиброэластография печени - F1-2 балла по шкале METAVIR.

Уровень выработки ИФН в ПДК - 3 пг./мл.

Диагноз: Хронический гепатит С, минимальной активности, репликативный, высокая вирусная нагрузка, генотип 1в, F1-2 балла по шкале METAVIR.

Больному назначена стандартная комплексная ПВТ (РоферонА + рибавирин) в возрастной дозировке.

На 12-й неделе терапии отмечается нормализация уровня трансаминаз - АЛТ - 35 Ед./л и ACT - 30,5 Ед./л. Маркеры ГС: HCV РНК колич. - не определяется.

Уровень выработки ИФН в ПДК - 2625,2 пг/мл.

При лабораторном обследовании через 6 мес. после окончания ПВТ: показатели уровня трансаминаз остались в пределах нормы, HCV РНК колич. - не определяется, что соответствует стойкому вирологическому ответу, под которым понимается устойчивое отсутствие репликации вируса через 6 мес. после окончания терапии и более. Дальнейшее наблюдение подтвердило отсутствие рецидива виремии.

Таким образом, на 12-й неделе ПВТ у мальчика зафиксирован мощный подъем интерферонообразования (в 875 раз) по сравнению с показателем до начала терапии, что в дальнейшем оказалось соответствующим устойчивому вирологическому ответу. Случай демонстрирует надежность позитивного прогноза и возможность на его основе строить дальнейшую терапию.

Пример 2. Больной Фирдавс X., 11 лет, № карты амбулаторного больного - 109.

Обратился на амбулаторный прием к гепатологу с жалобами на недомогание, снижение аппетита, ощущение тяжести в правом подреберье.

Из анамнеза заболевания было установлено, что у мальчика определяются маркеры ВГС. Эпид. анамнез: мать мальчика страдает ХГС.

Противовирусная терапия не проводилась.

Объективно - состояние средней степени тяжести по основному заболеванию. Кожа и видимые слизистые чистые, отмечается краевая субиктеричность склер. Печень у края реберной дуги, несколько уплотнена, «пузырные» симптомы ++.

По результатам биохимического анализа крови активность трансаминаз - АЛТ - 65,5 Ед./л и ACT - 54,2 Ед./л.

Маркеры ГС: HCV РНК+, HCV РНК колич. - 7,51×10⁴ МЕ/мл, генотип 3a.

Фиброэластография печени - F1 баллов по шкале METAVIR.

Уровень выработки ИФН в ПДК - 3 пг/мл.

Диагноз: Хронический гепатит С, вертикальный путь передачи, слабой активности, репликативный, F1 баллов по шкале METAVIR.

Больному назначена стандартная комплексная ПВТ (РоферонА + рибавирин) в возрастной дозировке.

На 12-й неделе терапии уровень трансаминаз - АЛТ - 41,2 Ед./л и ACT - 24,9 Ед./л. Маркеры ГС: HCV РНК колич. - 1,86×10³ МЕ/мл.

Уровень выработки ИФН в ПДК - 3 пг/мл.

Данные лабораторного обследования в дальнейшем подтвердили отсутствие достижения авиремии.

Таким образом, на 12-й неделе ПВТ у ребенка не обнаружено подъема ИФН-образования в ПДК, что соответствовало отсутствию вирологического ответа на проводимую терапию. Подобная ситуация может позволить отменить неэффективную терапию.

Пример 3.

Больная Владислава О., 32 года, № карты амбулаторного больного - 162.

Обратилась на амбулаторный прием к гепатологу с жалобами на утомляемость, снижение аппетита, ощущение тяжести в правом подреберье.

Из анамнеза заболевания было установлено наличие маркеров ВГС с 2007 года. Эпид. анамнез: парентеральные вмешательства отрицает, оперативные вмешательства не проводились, вредных привычек нет, источник инфицирования не установлен.

Этиотропная противовирусная терапия не проводилась, периодически получала курсы гепатопротекторов.

Объективно - состояние средней степени тяжести по основному заболеванию. Кожа и видимые слизистые чистые. Печень у края реберной дуги, уплотнена, «пузырные» симптомы ±. По результатам биохимического анализа крови активность трансаминаз - АЛТ - 14 Ед./л и ACT - 18 Ед./л.

Маркеры ГС: HCV РНК+, HCV РНК колич. - 3,2×10⁵ МЕ/мл, генотип 1в.

Фиброэластография печени - F0 баллов по шкале METAVIR.

Уровень выработки ИФН в ПДК - 3 пг/мл.

Диагноз: Хронический гепатит C, не активный, репликативный, высокая вирусная нагрузка, генотип 1в, F0 баллов по шкале METAVIR.

Больной назначена стандартная комплексная ПВТ (пегинтерферон альфа 2а + рибавирин).

На 12-й неделе терапии уровень трансаминаз - АЛТ - 34 Ед./л и ACT - 26 Ед./л.

Маркеры ГС: HCV РНК колич. - не определяются.

Уровень выработки ИФН в ПДК составил 3100 пг/мл.

При лабораторном обследовании через 6 мес. после окончания ПВТ: показатели уровня трансаминаз остались в пределах нормы, HCV РНК колич. - не определяется, что соответствует стойкому вирологическому ответу.

Таким образом, у пациентки через 12 нед. ПВТ зарегистрировано повышение ИФН-образования в ПДК более чем в 1000 раз (3100 пг/мл против 3 пг/мл перед началом лечения), что привело в дальнейшем к устойчивому вирологическому ответу, являющемуся конечной целью проводимой терапии. Случай демонстрирует, что так же, как у детей, подъем выработки ИФН в ПДК является показателем благоприятного ответа и основой для продолжения терапии.

Пример 4.

Больной Андрей В., 32 года, № карты амбулаторного больного - 160.

Обратился на амбулаторный прием к гепатологу с жалобами на ощущение тяжести в правом подреберье.

Из анамнеза заболевания было установлено наличие маркеров ВГС с 2003 года. Эпид. анамнез: парентеральные вмешательства отрицает, оперативные вмешательства не проводились, вредных привычек нет, источник инфицирования не установлен.

Этиотропная противовирусная терапия не проводилась.

Объективно - состояние средней степени тяжести по основному заболеванию. Кожа и видимые слизистые чистые. Печень пальпируется на +1,0, +1,0+ ср/3 см из-под края ребер, уплотнена, «пузырные» симптомы ±.

По результатам биохимического анализа крови активность трансаминаз - АЛТ - 45,3 Ед./л и ACT - 29,6 Ед./л.

Маркеры ГС: HCV РНК+, HCV РНК колич. - 2,67×10⁶ МЕ/мл, генотип 1в.

Фиброэластография печени - F0 баллов по шкале METAVIR.

Уровень выработки ИФН в ПДК - 3 пг/мл.

Диагноз: Хронический гепатит C, не активный, репликативный, высокая вирусная нагрузка, генотип 1в, F0 баллов по шкале METAVIR.

Больному назначена стандартная комплексная ПВТ (пегинтерферон альфа 2а + рибавирин).

На 12-й неделе терапии уровень трансаминаз - АЛТ - 10,7 Ед./л и ACT - 19,4 Ед./л. Маркеры ГС: HCV РНК колич. - 1,73×10⁵ МЕ/мл.

Уровень выработки ИФН в ПДК составил 3 пг/мл.

При лабораторном обследовании через 6 мес. после окончания ПВТ: показатели уровня трансаминаз нормализовались, HCV РНК колич. - 2,3×10⁵ МЕ/мл, что говорит о продолжающейся репликации вируса и соответствует отсутствию ответа на проведенную терапию.

В данном примере отсутствие подъема выработки интерферона в ПДК на 12-й нед. лечения соответствует отсутствию желаемого эффекта терапии. Подобная ситуация, так же, как у детей, может служить основой для прекращения неэффективного лечения.

Таким образом, предложенный способ позволяет с высокой вероятностью (96,9%) в первые 12 недель ПВТ предсказать ее конечный результат, что принципиально важно для решения вопроса об общей длительности лечения, возможности и допустимости коррекции доз, целесообразности изменения схем и т.д.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования ответа на противовирусную терапию при хроническом гепатите C. На 12-й неделе лечения определяют уровень интерферона в плазмоцитоидных дендритных клетках крови. При его приросте у взрослых и детей в 20 раз и более по сравнению с исходным уровнем, определяемым перед началом терапии, или в 2,6×10² раз у взрослых, а у детей в 1,2×10² по сравнению с нормальными показателями прогнозируют стабильный положительный ответ на противовирусную терапию. Способ позволяет повысить точность прогнозирования для выбора оптимальной тактики лечения у каждого пациента. 4 пр.

Способ прогнозирования ответа на противовирусную терапию при хроническом гепатите C, отличающийся тем, что на 12-й неделе лечения определяют уровень интерферона в плазмоцитоидных дендритных клетках крови и при его приросте у взрослых и детей в 20 раз и более по сравнению с исходным уровнем, определяемым перед началом терапии, или в 2,6×10² раз у взрослых, а у детей в 1,2×10² по сравнению с нормальными показателями прогнозируют стабильный положительный ответ на противовирусную терапию.